Purificación y Caracterización de Vesículas Extracelulares a partir de Células Madre Mesenquimales Derivadas del Adiposo Humano

Resumen

Este protocolo describe todos los procedimientos, desde el cultivo de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) y la recolección de sobrenadante hasta la extracción de vesículas extracelulares (EV) mediante ultracentrifugación.

Resumen

Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) pueden promover la regeneración y reconstrucción de diversos tejidos y órganos. Investigaciones recientes sugieren que su función regenerativa puede atribuirse al contacto célula-célula y a los efectos paracrinos de las células. El efecto paracrino es una forma importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, en las que las vesículas extracelulares (VE) desempeñan un papel funcional como portadoras. Existe un potencial significativo para los ADSC EV en medicina regenerativa. Múltiples estudios han informado sobre la efectividad de estos métodos. Actualmente se describen varios métodos para extraer y aislar EV basados en principios como la centrifugación, la precipitación, el tamaño molecular, la afinidad y la microfluídica. La ultracentrifugación se considera el estándar de oro para aislar los vehículos eléctricos. Sin embargo, todavía no existe un protocolo meticuloso para resaltar las precauciones durante la ultracentrifugación. Este estudio presenta la metodología y los pasos cruciales involucrados en el cultivo de ADSC, la recolección de sobrenadante y la ultracentrifugación de EV. Sin embargo, a pesar de que la ultracentrifugación es rentable y no requiere tratamiento adicional, todavía existen algunos inconvenientes inevitables, como una baja tasa de recuperación y la agregación de EV.

Introducción

La mayoría de las ADSC se derivan del tejido adiposo y se ha demostrado que promueven la regeneración y reconstrucción de varios tejidos y órganos, incluidos el miocardio, el hueso y^{la piel.} Investigaciones recientes sugieren que la función regenerativa de las ADSC puede deberse al contacto intercelular y a los efectos paracrinos de las células². El efecto paracrino es un medio importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, y esta función se logra a través de vesículas extracelulares (EV).

Los VE son estructuras de membrana de doble capa producidas p....

Protocolo

La descripción general de los pasos del protocolo se muestra en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de los medios

1. Prepare un medio de cultivo para ADSC sin exosomas utilizando 450 mL de medio de cultivo basal, 50 mL de suero fetal bovino sin exosomas y 5 mL de antibióticos triples.

2. Resucitación y cultivo de ADSC

NOTA: Resucitar los ADSC.

1. Encienda previamente la radiación UV de la mes....

Discusión

Durante el proceso experimental formal, varios puntos son cruciales para lograr los mejores resultados experimentales. Basándonos en nuestra experiencia previa, se recomienda optar por los ADSC de paso 3-6, ya que garantizan el mejor estado celular posible. Antes de P3, es posible que los glóbulos rojos, las células endoteliales y otras células diversas no se hubieran excluido. Después de P6, las células pueden envejecer gradualmente, lo que puede afectar el estado de las VE secretadas. En segundo lugar, el sobrena.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410