用于构建合成细胞的无细胞蛋白质合成系统

摘要

该协议描述了用于构建合成细胞的无细胞蛋白质合成 （CFPS） 系统。它概述了关键阶段，并在不同的微区间中具有代表性结果。该协议旨在为合成细胞社区中的不同实验室建立最佳实践，推动合成细胞开发的进步。

摘要

无细胞蛋白质合成 （CFPS） 系统已被广泛用于促进合成细胞的自下而上的组装。它是 Central Dogma 核心机械的宿主，是集成和组装各种人工细胞模拟系统的最佳底盘。尽管 CFPS 系统经常用于合成电池的制造，但为特定应用建立定制且强大的 CFPS 系统仍然是一项艰巨的挑战。在该方法论文中，我们提出了 CFPS 系统的综合方案，通常用于构建合成细胞。该方案包括 CFPS 系统制备的关键阶段，包括细胞提取物、模板制备和利用荧光报告蛋白的常规表达优化。此外，我们通过将 CFPS 系统封装在各种微隔室中来显示代表性结果，例如单层液滴、液囊泡和位于支撑脂质双层顶部的腔室。最后，我们阐明了在不同环境中成功组装这些 CFPS 系统所需的关键步骤和条件。我们预计我们的方法将促进在不断扩大的合成细胞社区内的各个实验室之间建立良好的工作规范，从而加速合成细胞开发领域的进步。

引言

合成或人工细胞的合成已成为跨学科研究的一个非常突出的领域，吸引了合成生物学、化学和生物物理学领域科学家的浓厚兴趣。这些科学家为了构建最小活细胞的共同目标而团结在一起 ^1,2,3。该领域的快速发展与关键技术的重大进步同步，例如重组 DNA 操作⁴、仿生材料⁵ 和区室化微纳加工技术⁶，包括无细胞蛋白质合成 （CFPS） 方法⁷。CFPS 系统包含用于转录和翻译的基本细胞机制，为多功能人工细胞的开发和集成提供了基础框架。

尽管 CFPS 技术经常用于合成细胞的组装，但为各种合成细胞系统的组装开发强大且量身定制的 CFPS 系统仍然是一项复杂的挑战。目前，有许多 CFPS 系统可用，它们来源于原核生物和真核生物^{模式生物 8}，每种系统都专门用于合成细胞合成中的特定应用。除了在转录和翻译中的核心作用外，CFPS 系统的主要组成部分和相关准备程序也各不相同。这些变化，包括细胞提取物、RNA 聚合酶、模板制备方法和缓冲液组成的差异，主要是由于研究小组追求不同的开发轨迹，这些研究小组已经密集优化了他们的系统以获得最大的蛋白质产量。

在 CFPS 系统的各种组成部分中，细胞提取物是转录和翻译的关键酶库，因此是 CFPS 性能的关键决定因素⁹。基于大肠杆菌 （E. coli） 的 CFPS 是最常用的系统，因为它是最容易理解的原核生物。此外，Ueda 的研究小组开发了一种由单独纯化的蛋白质和核糖体组成的完全重构的 CFPS 系统，称为 PURE¹⁰，特别适用于需要明确背景的应用。今天，即使是基于大肠杆菌的 CFPS 系统也已经多样化，尤其是在 extrac¹¹ 的来源菌株和制备方法^12,13、RNA 聚合酶^14,15、能源^16,17 和缓冲系统^18,19 方面。最常用的菌株包括 K12 和 B 菌株衍生物，例如 A19²⁰、JM109²¹、BL21 （DE3）²² 和 Rossetta2²³，以及它们的转基因对应物。

最初，选择具有降低 RNase 和蛋白酶活性的大肠杆菌菌株来增强 mRNA 稳定性和新合成的重组蛋白的稳定性，从而提高最终蛋白产量²⁴。随后，对大肠杆菌提取物进行工程改造以促进特定的翻译后修饰，包括糖基化²⁵、磷酸化²⁶ 和脂质化²⁷，以实现上述翻译后修饰。此外，还加入了一系列添加剂，如分子伴侣²⁸ 和化学稳定剂，以帮助折叠靶蛋白，有助于 CFPS 系统的多样化。噬菌体 T7 RNA 聚合酶以其高持续合成能力而闻名，主要用于转录，尽管其他聚合酶如 SP6²⁹ 也被使用。大肠杆菌内源性 RNA 聚合酶已适用于利用^{sigma 因子 30} 的遗传回路原型设计。最后，各种能量前驱体 ^31,32,33 和不同的盐和缓冲成分 19,34,35 已经过系统优化，以提高生产率。

除了 CFPS 系统本身，封装方法和区室化材料对于合成细胞的成功组装也至关重要。为成功封装 CFPS 反应而开发的各种系统包括表面活性剂稳定的水/油滴、脂质/聚合物及其杂化单层囊泡（直径范围为 50 nm 至几 μm）以及平面支撑的脂质双层。然而，由于 CFPS 系统的复合物分子含量，包埋的成功率取决于具体情况，特别是对于囊泡的形成。为了提高 CFPS 包埋的成功率和效率，已经开发了各种微流体芯片来促进液滴和囊泡的形成³⁶。然而，还需要建立更多的芯片和设备。

该方案描述了利用 BL21（DE3） 菌株的大 肠 杆菌 CFPS 系统，BL21（DE3） 菌株是重组蛋白生产的常用宿主。该方案包括细胞提取物制备、模板制备和使用荧光报告蛋白的标准表达优化的详细说明。此外，我们提出了通过将 CFPS 系统封装在不同的微隔室中实现的示例性结果，包括单层液滴、液囊泡和位于支撑脂质双层顶部的腔室。最后，我们阐述了在不同环境背景下成功建立这些 CFPS 系统的关键程序要素和必要条件。

研究方案

1. 提取物制备

1. 将甘油原液中的大 肠 杆菌BL21（DE3）菌株划线到Luria Bertani（LB）琼脂平板上，并在37°C下孵育至少15小时。
2. 将新鲜制备的 LB 板中的单个菌落接种到 50 mL Luria Bertani （LB） 培养基瓶中，制备过夜预培养。
3. 将 5 mL 预培养物接种到 3 L 带挡板的锥形瓶中的 500 mL 2xYTPG 培养基中。在 37 °C 下剧烈摇动（在 220 rpm 和 250 rpm 之间）生长，并在细胞达到对数中期 （OD₆₀₀ ~ 3） 时收获细胞。然后，将细胞培养物置于冷的冰水中 10 分钟，并在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 15 分钟。
   注：在此步骤中，对于特定应用，可以省略 2xYTPG 培养基中的葡萄糖 ^9,12。
4. 将所得细胞沉淀重悬于 35 mL 预冷的 S30 缓冲液 A 中，然后在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 15 分钟。 丢弃上清液。
5. 重复步骤 1.4 两次。
   注意：如果不立即使用，细胞沉淀可以储存在 -80 °C 下。
6. 在 S30 缓冲液 B 中重悬最终沉淀（例如，每 1 g 细胞沉淀使用 1.1 mL 的 S30 缓冲液 B），并在 17,000 psi 下通过 French Press 一次破碎细胞。
   1. 要使用 French Press，请按照用户手册将细胞悬液转移到 French Press 金属破碎室，确保所有组件都已组装完毕，并且破碎室的底部阀门已关闭。
   2. 将组装好的干扰室转移到液压平台上并固定安全锁。
   3. 打开液压泵并开始中断。
   4. 控制出口阀，使细胞悬液从出口管流出，进入新的 50 mL 管中。调整流速以确保有效破碎，最好一次一滴。将压力保持在 15,000 psi 的下限以上。
7. 将所得裂解物在 4 °C 下以 30,000 × g 离心 30 分钟，并收集上清液。重复离心一次并收集上清液。将 0.3 体积的预孵育缓冲液加入收集的上清液中，并在 37 °C 下轻轻摇动孵育 80 分钟。
   注意：使用预孵育缓冲液可以提高最终产量，尽管据报道空径流（无预孵育缓冲液）也可以提高效率^37,38，这取决于相应的源菌株。
8. 用 2 L S30 缓冲液 C 透析所得的流出混合物 2 小时，用 2 L 新鲜的 S30 缓冲液 C 交换透析缓冲液一次，并在 4 °C³⁹ 下透析过夜。
   注意：过夜透析的第二步可以缩短至约 3 小时。
9. 收集透析样品并在 4 °C 下以 30,000 × g 离心 30 分钟。 收集上清液并分装成适当的体积，并立即在液氮中快速冷冻。
   注意：冷冻样品可在 -80 °C 下储存至少 6 个月至 1 年，而不会降低效率。

2. T7 RNA 聚合酶

1. 将 pAR1219 质粒转化到 BL21（DE3） 星型 大肠杆菌 感受态细胞^{中 40}。
2. 将 10 mL 过夜培养物接种到 1 L LB 培养基（含有 100 μg/mL 氨苄青霉素）中。在 37 °C 下培养细胞，直到 OD₆₀₀ 达到 0.6-0.8。
3. 通过添加终浓度为 1 mM IPTG 开始诱导。再诱导细胞 5 小时，并在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 15 分钟收获。 将细胞沉淀在 -80 °C 下储存长达数周。
4. 将细胞沉淀重悬于 30 mL 的 T7 缓冲液 A 中，并在 15,000 psi 的压力下通过 French Press 一次破碎细胞。通过在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 30 分钟来去除细胞碎片。
5. 将硫酸链霉素逐滴加入上一步的上清液中，达到 4% （w/v） 的最终浓度。在冰上短暂孵育后，在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 30 分钟。
6. 通过 0.45 μm 滤膜过滤上清液，并将过滤后的样品上样到强阴离子交换柱（柱体积为 40 mL）上，该柱通过自动液相色谱系统用 10 柱体积的 T7 缓冲液 B 预平衡。
7. 用 50 倍柱体积的 T7 缓冲液 B 洗涤上样柱，并用 10 倍柱体积的低盐 （50 mM NaCl） 和高盐 （500 mM） T7 缓冲液 C 混合物洗脱样品，在 ~3 mL/min 的流速下建立 50 至 500 mM 的 NaCl 线性浓度梯度⁴¹。
8. 收集峰分数并通过 SDS-PAGE 分析。
   注：T7 聚合酶在 ~100 kDa 处表现出一条主要条带，而 SDS-PAGE 凝胶上仍出现大量杂质。
9. 汇集含有 T7 聚合酶的级分，并用 2 L T7 缓冲液 C 透析过夜。
10. 加入甘油至达到 10% 的最终浓度，并通过超滤⁴² 将所得混合物浓缩至 3-4 mg/mL 的最终浓度。
    注：如果在浓缩过程中出现沉淀，请立即停止并通过离心去除沉淀物。
11. 将甘油浓度调节至 50%。分装并用液氮快速冷冻样品。在 -80 °C 下储存更长时间。
    注：小等分试样也可以在 -20 °C 下储存至少 1 个月而不会损失效率。

3. 缓冲液制备

1. 使用前一天准备 表 1 所示的缓冲液。

4. 模板设计和准备

1. 将目标基因克隆到基于 T7 启动子的载体中，或生成包含目标基因的线性 PCR 产物。
   注意：有关设计原则，请参阅讨论部分。
2. 使用质粒提取试剂盒从过夜培养物中制备质粒。
   注：我们建议选择包括异丙醇沉淀步骤，然后用 70% 乙醇洗涤程序的质粒试剂盒。
3. 将干燥的 DNA 溶解在少量超纯水中，浓度在 200 μg/mL 至 500 μg/mL 之间，由微量分光光度计测定。
4. 可选：直接表达来自线性 PCR 产物的蛋白质。
   注：在这种情况下，需要 PCR 纯化步骤。

5. Mg²⁺ 和 K⁺ 优化

1. 制备用于 Mg²⁺ 浓度筛查的预混液（ 如表 2 所示）或 K⁺ 浓度筛查（如 表 3 所示）。
2. 将预混液转移到单独的微量离心管或 V 形 96 孔板中。
3. 将精确体积的 Mg²⁺ 或 K⁺ 储备液移液到单个微量离心管或 V 形 96 孔板中，并用超纯水完成 CFPS 反应。孵育反应至少 2 小时。
   注：如果使用 V 形 96 孔板，请用塑料盖密封板以防止蒸发。
4. 取出 2 μL 反应混合物，转移到黑色 96 孔板中，通过读板器进行荧光测量。
   注：我们使用荧光读板器，设置如下： 激发/发射：485/528，增益：50，读取高度：7.00 mm。但是，需要调整他们的读板器，以使用纯化的荧光蛋白生成特定的校准曲线。

6. 封装

1. 小滴
   1. 通过将脂质溶解在矿物油中来制备含表面活性剂的氟化油（HFE7500中2%PFPE-PEG）或脂质 - 矿物油溶液（参见步骤6.2.1）
   2. 通过组合 表 4 中的相应试剂 2-18，制备总体积为 100 μL 的 CFPS 反应。在 1.5 mL 试管中将 CFPS 反应物加入 500 μL 先前制备的油中，然后在试管架上用力摩擦试管 50 次，以形成细小的（油包水）液滴。将试管在 30 °C 下孵育以进行反应。
      注意：简单的微流控芯片也可用于生成均匀的液滴⁴³.
2. 巨型单层囊泡 （GUV）
   1. 制备脂质矿物油溶液
      1. 将 57 μL 氯仿加入 4 mL 玻璃瓶中，然后加入 18 μL 25 mg/mL 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱 （POPC） 脂质，形成氯仿脂质溶液，最终浓度达到 8 mM（使用具有相似最终浓度的其他脂质）。
         注：该混合步骤是为了确保不同脂质的均匀混合。
      2. 在氩气流下蒸发氯仿 15 分钟，然后在真空下进一步蒸发 1 小时。
      3. 将所得干脂质溶解在 1,500 μL 矿物油中，达到 400 μM 的最终浓度。将混合物在室温下孵育过夜。
   2. 形成界面脂质层
      1. 将 500 μL 外层溶液（见 表 5）添加到 1.5 mL 试管中，然后在外层溶液上缓慢地铺上 250 μL 脂质矿物油溶液。在室温下孵育 30 分钟以形成稳定的界面脂质层。
   3. 内溶液的制备
      1. 混合 表 6 中的所有试剂以形成 preinner 溶液，并将其保存在冰上直至使用。通过将 T7RNAP、S30 提取物和 DNA 模板作为表 4 中列出的试剂 16-18 添加到前内溶液中来完成内溶液。
         注：将包封蔗糖浓度增加到 250 mM 以上可能会抑制无细胞翻译⁴⁴。
   4. GUV 的形成
      1. 将 50 μL 内溶液加入含有 500 μL 脂质矿物油的 1.5 mL 新管中，快速上下移液，并剧烈涡旋。
      2. 将试管放在冰上 10 分钟，然后从步骤 6.2.2 开始，将 20 μL 乳化混合物缓慢添加到 1.5 mL 试管中的油相顶部。
      3. 在 4 °C 下以 800 × g （使用 100 × g 至 1000 × g 的离心速度）离心 10 分钟，并观察管底部 GUV 的形成。
         注意：可以使用更高的比离心速度;然而，人们会认为离心速度会影响形成的 GUV^{的大小 45}。
      4. 去除上油相。
      5. 小心地在管底部吸出 30 μL 的 GUV。将收集的 GUV 在 30 °C 下孵育。
         注：最佳孵育温度因蛋白质而异。
      6. 使用共聚焦激光扫描显微镜 （LSM） 监测荧光蛋白的表达。
3. 支持的脂质双层 （SLB）
   1. SLB 室的准备
      1. 通过向每个盖玻片的中心添加 7 滴硫酸和 2 滴 50% 过氧化氢，对 Piranha 清洁 24 x 24 mm #1.5 盖玻片。将盖玻片上的反应物孵育至少 45 分钟;用超纯水彻底冲洗。
      2. 使用在紫外线灯 （365 nm） 下固化 10 分钟的光学胶，将切开的 0.5 mL 微量离心管连接到清洁的盖玻片上，以形成反应室，从而组装重构室。
   2. SLB 形成
      1. 溶解 80 mol% 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DOPC）、19.95 mol% 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸 （DOPS） 和 0.05 mol% Atto488-DOPE（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 = DOPE），混合在氯仿中，在温和的氮气流下干燥并真空 1 小时以完全去除溶剂。
      2. 在 SLB 缓冲液 A 中再水化干燥的脂质膜，得到最终脂质浓度为 4 mg/mL。
      3. 涡旋并超声处理所得样品，直到它们变得透明。
      4. 用 130 μL SLB 缓冲液 A 稀释 4 mg/mL 的 SUV，将 75 μL 悬浮液转移到预制的反应室中，并在 37 °C 的加热块上孵育 1 分钟。向反应室中加入 150 μL SLB 缓冲液 A，进一步孵育 2 分钟。
      5. 用 2 mL SLB 缓冲液 B（不含 MgCl₂ 的 SLB 缓冲液 A）清洗腔室，然后更换为含有 0.4% （w/v） BSA 的 S30 缓冲液 C 用于 CFPS 反应，在腔室内留下 100 μL 缓冲液，以防止形成的 SLB 变干。
      6. 去除残留的 S30 缓冲液 C，小心地将 CFPS 反应混合物加入 SLB 室中。将腔室在 30 °C 下孵育，并在共聚焦激光扫描显微镜下监测表达。

结果

对于每批新批次的细胞提取物和 T7 RNA 聚合酶，建议对 Mg²⁺ 和 K⁺ 浓度进行基本筛选，以确保 CFPS 系统的最佳性能。超级文件夹 GFP 的荧光可以作为不同条件下 CFPS 系统总产量的指标，如图 1A、B 所示。此外， 图 1C 显示了 CFPS 系统在不同隔室中的平行产量比较，表明在封装的 CFPS 系统中性能一致，尽...

讨论

本手稿概述了一种改良的无细胞蛋白质合成 （CFPS） 系统，该系统设计用于合成细胞平台的各种微区室，包括油包水液滴、GUV 和 SLB。我们利用标准的大肠杆菌重组蛋白表达宿主菌株 BL21 （DE3） 作为构建以蛋白质为中心的合成细胞系统的来源提取物。这种方法在不同区室中产生大约 0.5 mg/mL 的蛋白质。虽然可以使用其他定制的提取物来源菌株，但这些系统主要针对?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203