합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

요약

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

초록

CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템은 합성 세포의 상향식 조립을 용이하게 하기 위해 널리 사용되어 왔습니다. 그것은 Central Dogma의 핵심 기계의 호스트 역할을 하며, 다양한 인공 세포 모방 시스템의 통합 및 조립을 위한 최적의 섀시로 서 있습니다. 합성 세포 제조에 자주 사용됨에도 불구하고 특정 응용 분야에 대한 맞춤형 및 강력한 CFPS 시스템을 구축하는 것은 여전히 사소한 과제로 남아 있습니다. 이 방법 논문에서는 합성 전지를 구성하는 데 일상적으로 사용되는 CFPS 시스템에 대한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 세포 추출물, 템플릿 준비 및 형광 리포터 단백질을 활용한 일상적인 발현 최적화를 포함하여 CFPS 시스템 준비의 주요 단계를 포함합니다. 또한 단층 액적, 이중 에멀젼 소포 및 지지된 지질 이중층 위에 위치한 챔버와 같은 다양한 마이크로 구획 내에 CFPS 시스템을 캡슐화하여 대표적인 결과를 보여줍니다. 마지막으로, 서로 다른 환경에서 이러한 CFPS 시스템을 성공적으로 조립하는 데 필요한 중요한 단계와 조건을 설명합니다. 우리는 우리의 접근 방식이 지속적으로 확장되는 합성 세포 커뮤니티 내의 다양한 실험실 간에 우수한 작업 관행을 확립하는 데 도움이 될 것으로 기대하며, 이를 통해 합성 세포 개발 분야의 발전을 가속화할 것으로 기대합니다.

서문

합성 또는 인공 세포의 합성은 학제 간 연구에서 매우 두드러진 분야로 부상하여 합성 생물학, 화학 및 생물 물리학 분야의 과학자들로부터 상당한 관심을 끌고 있습니다. 이 과학자들은 최소한의 살아있는 세포 ^1,2,3을 구축한다는 공통의 목표로 뭉쳐 있습니다. 이 분야의 급속한 성장은 재조합 DNA 조작^{4, 생체} 모방 물질⁵, 무세포 단백질 합성(CFPS) 방법⁷을 포함한 구획화를 위한 미세 가공 기술⁶과 같은 중요한 기술의 상당한 발전과 보조를 맞추고 있습니다. CFPS 시스템은 전사 및 번역을 위한 필수 세포 메커니즘을 포괄하며, 다기능 인공 세포의 개발 및 통합을 위한 기본 프레임워크를 제공합니다.

CFPS 기술은 합성 세포 조립에 자주 사용되지만, 다양한 합성 세포 시스템 조립을 위한 견고하고 맞춤화된 CFPS 시스템을 개발하는 것은 여전히 복잡한 과제로 남아 있습니다. 현재, 원핵생물 및 진핵생물 모델 유기체⁸에서 파생된 수많은 CFPS 시스템을 사용할 수 있으며, 각각은 합성 세포 합성의 특정 응용 분야에 특화되어 있습니다. 전사 및 번역의 중심적인 역할 외에도 CFPS 시스템은 주요 구성 요소와 관련 준비 절차가 다양합니다. 세포 추출물, RNA 중합효소, 템플릿 준비 방법 및 완충액 조성의 차이를 포함하는 이러한 변화는 주로 최대 단백질 수율을 위해 시스템을 집중적으로 최적화한 연구 그룹이 추구하는 뚜렷한 개발 궤적 때문입니다.

CFPS 시스템의 다양한 구성 요소 중에서 세포 추출물은 전사 및 번역을 위한 중요한 효소 풀이며, 따라서 CFPS 성능의 핵심 결정 요인입니다⁹. 대장균(E. coli) 기반 CFPS는 가장 잘 알려진 원핵 생물이라는 지위 때문에 가장 일반적으로 사용되는 시스템입니다. 또한, Ueda의 연구 그룹에서는 개별적으로 정제된 단백질과 리보솜으로 구성된 완전히 재구성된 CFPS 시스템인 PURE¹⁰을 개발했으며, 이는 명확한 백그라운드가 필요한 응용 분야에 특히 적합합니다. 오늘날, 대장균 기반 CFPS 시스템조차도 특히 extrac¹¹ 및 제조 방법^(12,13), RNA 중합효소^(14,15), 에너지 원^(16,17) 및 완충 시스템^(18,19)의 소스 균주 측면에서 다양 해졌습니다. 가장 자주 사용되는 균주에는 A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² 및 Rossetta2²³과 같은 K12 및 B 균주 유도체와 유전자 변형 균주가 포함됩니다.

초기에는 RNase 및 단백질 분해 효소 활성이 감소된 E. coli 균주를 선택하여 mRNA 안정성과 새로 합성된 재조합 단백질의 안정성을 향상시켜 최종 단백질 수율을 증가시켰습니다²⁴. 그 후, 대장균 추출물은 글리코실화(glycosylation)²⁵, 인산화(phosphorylation)²⁶ 및 지질화^{(lipidation) 27}을 포함한 특정 번역 후 변형(post-translational modification)을 촉진하도록 조작되어 위의 번역 후 변형(posttranslational modifications)을 달성하도록 개발되었습니다. 또한, 분자 샤페론(molecular chaperons^{) 28} 및 화학적 안정제와 같은 일련의 첨가제가 표적 단백질의 접힘을 돕기 위해 통합되어 CFPS 시스템의 다양화에 기여했습니다. 높은 진행성으로 알려진 박테리오파지 T7 RNA 중합효소는 주로 전사에 사용되지만 SP6²⁹와 같은 다른 중합효소도 활용되었습니다. E. coli 내인성 RNA 중합효소는 sigma^{factors 30}을 활용하는 유전 회로의 프로토타이핑에 적용되었습니다. 마지막으로, 다양한 에너지 전구체(^31,32,33)와 다양한 염 및 완충 성분(19,34,35)이 생산성을 향상시키기 위해 체계적으로 최적화되었다.

CFPS 시스템 자체 외에도 캡슐화 방법과 구획화 재료도 성공적인 합성 셀 조립에 필수적입니다. CFPS 반응을 성공적으로 캡슐화하기 위해 개발된 다양한 시스템에는 계면활성제 안정화 물/오일 방울, 지질/폴리머 및 하이브리드 단층 소포(직경이 50nm에서 수 μm에 이르는 범위) 및 평면 지지 지질 이중층이 포함됩니다. 그러나 CFPS 시스템의 복잡한 분자 함량으로 인해 캡슐화의 성공률은 특정 사례, 특히 소포 형성에 따라 달라집니다. CFPS의 캡슐화의 성공률과 효율성을 향상시키기 위해, 액적과 소포 모두의 형성을 용이하게 하기 위해 다양한 미세유체 칩이 개발되었다(³⁶). 그럼에도 불구하고 추가 칩과 장치를 설정해야 합니다.

이 프로토콜은 재조합 단백질 생산에 일반적으로 사용되는 숙주인 BL21(DE3) 균주를 활용하는 E. coli CFPS 시스템을 설명합니다. 이 프로토콜은 형광 리포터 단백질을 사용한 세포 추출물 준비, 템플릿 준비 및 표준 발현 최적화에 대한 자세한 설명을 포함합니다. 또한, 단층 액적, 이중 에멀젼 소포 및 지지된 지질 이중층 위에 위치한 챔버를 포함한 다양한 마이크로 구획 내에 CFPS 시스템을 캡슐화하여 달성한 모범적인 결과를 제시합니다. 마지막으로, 우리는 뚜렷한 환경적 맥락에서 이러한 CFPS 시스템을 성공적으로 구축하기 위해 필수적인 중추적인 절차적 요소와 필수 조건에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 추출물 준비

1. 글리세롤 스톡의 E. coli BL21(DE3) 균주를 Luria Bertani(LB) 한천 플레이트에 스트리킹하고 37°C에서 최소 15시간 동안 배양합니다.
2. 갓 준비된 LB 플레이트의 단일 콜로니를 Luria Bertani(LB) 배지 50mL 플라스크에 접종하여 하룻밤 전배양을 준비합니다.
3. 500mL의 2xYTPG 배지에 5mL의 프리배양을 3L 당황한 Erlenmeyer 플라스크에 접종합니다. 37 °C에서 격렬한 쉐이크 (220 rpm에서 250 rpm 사이)로 성장시키고 중간 로그 단계 (OD₆₀₀ ~ 3)에 도달하면 세포를 수확합니다. 그런 다음 세포 배양액을 차가운 얼음물에 10분 동안 넣고 8,000× g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
   참고: 이 단계에서 2xYTPG 배지의 포도당은 특정 응용 분야에 대해 생략할 수 있습니다 ^9,12.
4. 생성된 세포 펠릿을 35mL의 사전 냉각된 S30 완충액 A에 재현탁시킨 다음 8,000× g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
5. 1.4단계를 두 번 반복합니다.
   알림: 셀 펠릿은 즉시 사용하지 않을 경우 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
6. S30 완충액 B에 최종 펠릿을 재현탁시키고(예: 세포 펠릿 1g당 1.1mL의 S30 완충액 B 사용) 17,000psi에서 프렌치 프레스를 한 번 통과하여 세포를 파괴합니다.
   1. 프렌치 프레스를 사용하려면 사용 설명서에 따라 셀 현탁액을 프렌치 프레스 금속 붕괴 챔버로 옮겨 모든 구성 요소가 조립되고 붕괴 챔버의 하단 밸브가 닫혀 있는지 확인하십시오.
   2. 조립된 붕괴 챔버를 유압 플랫폼으로 옮기고 안전 잠금 장치를 고정합니다.
   3. 유압 펌프를 켜고 중단을 시작하십시오.
   4. 배출 밸브를 제어하여 셀 현탁액이 배출 튜브에서 새로운 50mL 튜브로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다. 효율적인 중단을 보장하기 위해 유속을 조정하십시오(이상적으로는 한 번에 한 방울씩). 압력을 하한인 15,000psi 이상으로 유지하십시오.
7. 생성된 용해물을 30,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 수집합니다. 원심분리를 한 번 반복하고 상층액을 수집합니다. 채취한 상층액에 0.3 부피의 배양 전 완충액을 추가하고 37°C에서 80분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
   참고: 사전 배양 완충액을 사용하면 최종 수율을 높일 수 있지만, 빈 유출수(사전 배양 완충액 없이)도 효율성을 향상시킬 수 있다고 보고되었으며, 이는 해당 소스 변형률에 따라 다릅니다(^37,38).
8. 생성된 유출 혼합물을 2L의 S30 완충액 C에 대해 2시간 동안 투석하고, 투석 완충액을 2L의 신선한 S30 완충액 C로 한 번 교환하고, 4°C에서 밤새 투석한다³⁹.
   참고: 야간 투석의 두 번째 단계는 약 3시간으로 단축할 수 있습니다.
9. 투석된 샘플과 원심분리기를 30,000× 4 °C에서 30분 동안 채취합니다. 상층액과 분취액을 적절한 부피로 모으고 액체 질소에서 즉시 급속 동결합니다.
   참고: 냉동 샘플은 효율성 손실 없이 -80°C에서 최소 6개월에서 1년 동안 보관할 수 있습니다.

2. T7 RNA 중합효소

1. pAR1219 플라스미드를 BL21(DE3) 스타 대장균 유능한 세포로 형질전환⁴⁰.
2. 하룻밤 배양액 10mL를 1L의 LB 배지(100μg/mL 암피실린 함유)에 접종합니다. OD₆₀₀ 이 0.6-0.8에 도달할 때까지 37°C에서 세포를 성장시킵니다.
3. 최종 농도 1mM IPTG를 추가하여 유도를 시작합니다. 추가로 5시간 동안 세포를 유도하고 4°C에서 15분 동안 8,000× g 에서 원심분리하여 수확합니다. 세포 펠릿을 -80 °C에서 최대 몇 주 동안 보관하십시오.
4. 세포 펠릿을 T7 완충액 A 30mL에 재현탁시키고 15,000psi에서 French Press를 한 번 통과하여 세포를 파괴합니다. 4°C에서 30분 동안 20,000× g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
5. 이전 단계의 상층액에 스트렙토마이신 황산염을 한 방울씩 추가하여 최종 농도 4%(w/v)에 도달합니다. 얼음 위에서 잠시 배양한 후 20,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
6. 0.45μm 필터 멤브레인을 통해 상층액을 여과하고 여과된 샘플을 자동 액체 크로마토그래피 시스템을 통해 10개의 컬럼 부피의 T7 완충액 B로 사전 평형화된 강력한 음이온 교환 컬럼(40mL의 컬럼 부피)에 로드합니다.
7. 로드된 컬럼을 50 컬럼 부피의 T7 버퍼 B로 세척하고 저염(50mM NaCl) 및 고염(500mM) T7 버퍼 C 혼합물 10 컬럼 부피로 샘플을 용리하여 ~3mL/분⁴¹의 유속에서 50 - 500mM의 NaCl 선형 농도 구배를 설정합니다.
8. 피크 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석합니다.
   참고 : T7 중합 효소는 ~ 100 kDa에서 우세한 밴드를 나타내며 상당한 양의 불순물이 여전히 SDS-PAGE 겔에 나타납니다.
9. T7 중합효소를 함유한 분획을 모으고 하룻밤 동안 2L의 T7 완충액 C에 대해 투석합니다.
10. 글리세롤을 첨가하여 최종 농도 10%에 도달하고 생성된 혼합물을 한외여과⁴²에 의해 3-4mg/mL의 최종 농도로 농축합니다.
    알림: 농축 과정에서 침전물이 나타나면 즉시 중지하고 원심분리로 침전물을 제거하십시오.
11. 글리세롤 농도를 50%로 조정합니다. 부분 표본 및 급속 분석은 액체 질소로 샘플을 동결합니다. -80 °C에서 장기간 보관하십시오.
    참고: 작은 부분 표본도 효율 손실 없이 -20°C에서 최소 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. 완충액 준비

1. 사용 하루 전에 표 1 에 표시된 대로 버퍼를 준비하십시오.

4. 템플릿 디자인 및 준비

1. 관심 유전자를 T7 promoter 기반 벡터로 클로닝하거나 관심 유전자를 포함하는 선형 PCR 산물을 생성합니다.
   참고: 디자인 원칙에 대한 토론 섹션을 참조하십시오.
2. plasmid extraction kit를 사용하여 하룻밤 배양에서 plasmid를 준비합니다.
   참고: 이소프로판올 침전 단계와 70% 에탄올을 사용한 세척 절차가 포함된 플라스미드 키트를 선택하는 것이 좋습니다.
3. 마이크로 부피 분광 광도계로 측정한 대로 건조된 DNA를 소량의 초순수에 200μg/mL에서 500μg/mL 사이의 농도로 용해시킵니다.
4. 선택 사항: 선형 PCR 산물에서 단백질을 직접 발현합니다.
   참고: 이 경우 PCR 정제 단계가 필요합니다.

5. Mg²⁺ 및 K⁺ 최적화

1. 표 2에 표시된 바와 같이 Mg²⁺ 농도 스크리닝 또는 표 3에 나타난 바와 같이 K⁺ 농도 스크리닝을 위한 마스터 믹스를 준비합니다.
2. 마스터 혼합물을 개별 마이크로분리 튜브 또는 V자형 96웰 플레이트로 옮깁니다.
3. 정확한 부피의 Mg²⁺ 또는 K⁺ 원액을 개별 마이크로퓨지 튜브 또는 V자형 96웰 플레이트에 피펫팅하고 초순수로 CFPS 반응을 완료합니다. 최소 2시간 동안 반응을 배양합니다.
   알림: V자형 96웰 플레이트를 사용하는 경우 증발을 방지하기 위해 플레이트를 플라스틱 덮개로 밀봉하십시오.
4. 반응 혼합물 2μL를 꺼내 플레이트 리더로 형광 측정을 위해 검은색 96웰 플레이트로 옮깁니다.
   참고: 여기 /방출: 485/528, 게인: 50, 판독 높이: 7.00mm 설정으로 형광판 리더를 사용합니다. 그러나 정제된 형광 단백질을 사용하여 특정 보정 곡선을 생성하도록 플레이트 리더를 조정해야 합니다.

6. 캡슐화

1. 작은 물방울
   1. 계면활성제 함유 불소화유(HFE7500에서 2% PFPE-PEG) 또는 광유에 지질을 용해시켜 지질-광유 용액을 제조합니다(단계 6.2.1 참조)
   2. 표 4의 해당 시약 2-18을 결합하여 총 100μL의 CFPS 반응을 준비합니다. 1.5mL 튜브에 미리 준비한 오일 500μL에 CFPS 반응을 첨가한 다음 튜브를 튜브 랙에 50배 세게 문질러 미세한(유중수) 방울을 형성합니다. 30°C에서 튜브를 배양하여 반응을 수행합니다.
      참고: 간단한 미세유체역학 칩도 균일한 액적을 생성하는 데 사용할 수 있습니다⁴³.
2. 거대 단층 소포(GUV)
   1. 지질-미네랄 오일 용액 준비
      1. 4mL 유리 바이알에 클로로포름 57μL를 넣은 다음 18μL의 25mg/mL 1-팔미토일-2-올레오일-글리세롤-3-포스포콜린(POPC) 지질을 첨가하여 클로로포름 지질 용액을 형성하여 최종 농도 8mM(최종 농도가 비슷한 다른 지질 사용)을 달성합니다.
         참고: 이 혼합 단계는 서로 다른 지질의 균일한 혼합을 보장하기 위한 것입니다.
      2. 아르곤 흐름에서 클로로포름을 15분 동안 증발시킨 다음 진공 상태에서 1시간 동안 더 증발시킵니다.
      3. 생성 된 건조 지질을 1,500 μL의 미네랄 오일에 용해시켜 최종 농도 400 μM에 도달합니다. 혼합물을 실온에서 밤새 배양합니다.
   2. 계면 지질층 형성
      1. 500μL의 외부 용액( 표 5 참조)을 1.5mL 튜브에 넣고 250μL의 지질-미네랄 오일 용액을 외부 용액 위에 천천히 층을 이룹니다. 안정적인 계면 지질층을 형성하기 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   3. 내부 용액의 준비
      1. 표 6의 모든 시약을 혼합하여 프리너 용액을 형성하고 사용할 때까지 얼음 위에 두십시오. 표 4에 나열된 시약 16-18로 T7RNAP, S30 추출물 및 DNA 템플릿을 프리너 용액에 첨가하여 내부 용액을 완성합니다.
         주의: 캡슐화된 슈크로스 농도를 250mM 이상으로 증가시키면 cell-free translation이 억제될 수 있다⁴⁴.
   4. GUV의 형성
      1. 500 μL의 지질 미네랄 오일이 들어있는 1.5 mL의 새 튜브에 50 μL의 내부 용액을 추가하고 피펫을 빠르게 위아래로 피펫팅하고 세게 소용돌이칩니다.
      2. 튜브를 얼음 위에 10분 동안 그대로 두고 20단계에서 1.5mL 튜브의 오일 상 상단에 6.2.2μL의 에멀젼 혼합물을 천천히 추가합니다.
      3. 800 × g 에서 원심 분리 (100 × g 에서 1000 × g 범위의 원심 분리 속도 사용)에서 4 ° C에서 10 분 동안 튜브 바닥에서 GUV가 형성되는 것을 관찰합니다.
         참고: 더 높은 특정 원심분리 속도를 사용할 수 있습니다. 그러나, 원심분리 속도가 형성된 GUVs(⁴⁵)의 크기에 영향을 미칠 수 있다고 생각할 수 있다.
      4. 상부 오일상을 제거합니다.
      5. 튜브 바닥에서 30μL의 GUV를 조심스럽게 흡입합니다. 채취한 GUV를 30°C에서 배양합니다.
         참고: 최적의 배양 온도는 단백질에 따라 다릅니다.
      6. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(LSM)을 사용하여 형광 단백질의 발현을 모니터링할 수 있습니다.
3. 지원되는 지질 이중층(SLB)
   1. SLB 챔버 준비
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 커버슬립은 각 커버 슬라이드 중앙에 황산 7방울과 50% 과산화수소 2방울을 추가합니다. 커버슬립의 반응물을 최소 45분 동안 배양합니다. 초순수로 철저히 헹굽니다.
      2. 자외선 램프(365nm) 아래에서 경화된 광학 접착제를 사용하여 10분 동안 절단된 0.5mL 미세분리 튜브를 세척된 커버슬립에 부착하여 재구성 챔버를 형성합니다.
   2. SLB 형성
      1. 80 mol % 1,2- dioleoyl-sn- 글리세롤 -3- 포스 포 콜린 (DOPC), 19.95 몰 % 1,2- 디오 레오일 -sn- 글리세롤 -3- 포스 포 -L- 세린 (DOPS) 및 0.05 몰 % Atto488-DOPE (1,2- 디올레오일 -sn-글리세로 -3- 포스포에탄올 아민 = DOPE)를 용해시키고 클로로포름에 혼합하고 약한 질소 흐름으로 건조시키고 1 시간 동안 진공 처리하여 용매를 완전히 제거합니다.
      2. SLB 완충액 A에서 건조된 지질막을 재수화하여 최종 지질 농도가 4mg/mL가 되도록 합니다.
      3. 결과 샘플이 투명해질 때까지 소용돌이치고 초음파 처리합니다.
      4. 4mg/mL의 SUV를 130μL의 SLB 버퍼 A로 희석하고 75μL의 현탁액을 미리 형성된 반응 챔버로 옮긴 다음 37°C의 열 블록에서 1분 동안 배양합니다. 150μL의 SLB 버퍼 A를 반응 챔버에 추가하여 2분 동안 추가로 배양합니다.
      5. CFPS 반응을 위해 0.4%(w/v) BSA로 S30 완충액 C로 완충액을 교환하기 전에 2mL의 SLB 완충액 B(MgCl₂가 없는 SLB 완충액 A)로 챔버를 세척하고 챔버 내부에 100μL의 완충액을 남겨 형성된 SLB가 건조되는 것을 방지합니다.
      6. 잔류 S30 버퍼 C를 제거하고 CFPS 반응 혼합물을 SLB 챔버에 조심스럽게 추가합니다. 30°C에서 챔버를 배양하고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 발현을 모니터링합니다.

결과

세포 추출물 및 T7 RNA 중합효소의 새로운 배치마다 CFPS 시스템의 최적 성능을 보장하기 위해 Mg²⁺ 및 K⁺ 농도 모두에 대한 기본 스크리닝을 수행하는 것이 좋습니다. 슈퍼폴더 GFP의 형광은 그림 1A,B와 같이 다양한 조건에서 CFPS 시스템의 전체 수율을 나타내는 지표 역할을 할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 구획에 걸친 CFPS ?...

토론

이 원고는 수중(water-in-oil) 방울, GUV 및 SLB를 포함한 합성 세포 플랫폼 전반의 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 사용하도록 설계된 수정된 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 간략하게 설명합니다. 단백질 중심의 합성 세포 시스템을 구축하기 위한 원료 추출물로 표준 대장균 재조합 단백질 발현 숙주 균주인 BL21(DE3)을 활용했습니다. 이 접근법은 서로 다른 구획에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203