SYSTÈME DE SYNTHÈSE DE PROTÉINES ACELLULAIRES POUR LA CONSTRUCTION DE CELLULES SYNTHÉTIQUES

Résumé

Ce protocole décrit le système de synthèse des protéines libres (CFPS) utilisé dans la construction des cellules synthétiques. Il décrit les étapes clés avec des résultats représentatifs dans différents micro-compartiments. Le protocole vise à établir les meilleures pratiques pour divers laboratoires de la communauté des cellules synthétiques, faisant ainsi progresser le développement des cellules synthétiques.

Résumé

Le système de synthèse des protéines acellulaires (CFPS) a été largement utilisé pour faciliter l’assemblage ascendant des cellules synthétiques. Il sert d’hôte à la machinerie de base du Dogme Central, se dressant comme un châssis optimal pour l’intégration et l’assemblage de divers systèmes de mimétisme cellulaire artificiel. Malgré son utilisation fréquente dans la fabrication de cellules synthétiques, la mise en place d’un système CFPS adapté et robuste pour une application spécifique reste un défi non négligeable. Dans cet article sur les méthodes, nous présentons un protocole complet pour le système CFPS, couramment utilisé dans la construction de cellules synthétiques. Ce protocole englobe des étapes clés dans la préparation du système CFPS, y compris l’extrait cellulaire, la préparation de la matrice et l’optimisation de l’expression de routine à l’aide d’une protéine rapporteure fluorescente. De plus, nous montrons des résultats représentatifs en encapsulant le système CFPS dans divers micro-compartiments, tels que des gouttelettes monocouches, des vésicules à double émulsion et des chambres situées au sommet de bicouches lipidiques soutenues. Enfin, nous élucidons les étapes critiques et les conditions nécessaires à la réussite de l’assemblage de ces systèmes CFPS dans des environnements distincts. Nous nous attendons à ce que notre approche facilite l’établissement de bonnes pratiques de travail entre les différents laboratoires au sein de la communauté des cellules synthétiques en constante expansion, accélérant ainsi les progrès dans le domaine du développement des cellules synthétiques.

Introduction

La synthèse de cellules synthétiques ou artificielles est devenue un domaine de recherche interdisciplinaire très important, suscitant un intérêt considérable de la part des scientifiques dans les domaines de la biologie synthétique, de la chimie et de la biophysique. Ces scientifiques sont unis par l’objectif commun de construire une cellule vivante minimale ^1,2,3. La croissance rapide de ce domaine a été en phase avec des avancées significatives dans des technologies critiques, telles que la manipulation de l’ADN recombinant⁴, les matériaux biomimétiques⁵ et les techniques de microfabrication pour la compartimentation⁶, y compris la méthode de synthèse de protéines libres (CFPS)⁷. Les systèmes CFPS englobent la machinerie cellulaire essentielle à la transcription et à la traduction, fournissant le cadre fondamental pour le développement et l’intégration de cellules artificielles multifonctionnelles.

Bien que les techniques CFPS soient fréquemment utilisées dans l’assemblage de cellules synthétiques, le développement d’un système CFPS robuste et adapté à l’assemblage de divers systèmes de cellules synthétiques reste un défi complexe. À l’heure actuelle, il existe de nombreux systèmes CFPS, dérivés à la fois de procaryotes et d’organismes modèles eucaryotes⁸, chacun spécialisé pour des applications particulières dans la synthèse cellulaire synthétique. Au-delà de leur rôle central dans la transcription et la traduction, les systèmes CFPS varient dans leurs principaux composants et les procédures de préparation associées. Ces variations, qui incluent des différences dans les extraits cellulaires, les ARN polymérases, les méthodes de préparation des matrices et les compositions tampons, sont en grande partie dues aux trajectoires de développement distinctes poursuivies par les groupes de recherche qui ont intensivement optimisé leurs systèmes pour un rendement maximal en protéines.

Parmi les différents composants du système CFPS, l’extrait cellulaire est un pool enzymatique critique pour la transcription et la traduction, et donc un déterminant clé de la performance CFPS⁹. Le CFPS basé sur Escherichia coli (E. coli) est le système le plus couramment utilisé en raison de son statut d’organisme procaryote le mieux compris. De plus, un système CFPS entièrement reconstitué comprenant des protéines et des ribosomes purifiés individuellement, connu sous le nom de PURE¹⁰, a été développé par le groupe de recherche d’Ueda, qui est particulièrement adapté aux applications nécessitant un arrière-plan clair. Aujourd’hui, même les systèmes CFPS à base d’E. coli se sont diversifiés, notamment en termes de souches sources pour l’extrac¹¹ et de méthodes de préparation^12,13, d’ARN polymérase^14,15, de sources d’énergie^16,17 et de systèmes tampons^18,19. Les souches les plus fréquemment utilisées comprennent les dérivés des souches K12 et B, tels que A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² et Rossetta2²³, ainsi que leurs homologues génétiquement modifiés.

Initialement, les souches d’E. coli avec des activités RNases et protéases réduites ont été choisies pour améliorer la stabilité de l’ARNm et la stabilité des protéines recombinantes nouvellement synthétisées, conduisant à une augmentation des rendements finaux en protéines²⁴. Par la suite, des extraits d’E. coli ont été modifiés pour faciliter des modifications post-traductionnelles spécifiques, notamment la glycosylation²⁵, la phosphorylation²⁶ et la lipidation²⁷, ont été développés pour réaliser les modifications post-traductionnelles ci-dessus. De plus, une gamme d’additifs tels que des chaperons^{moléculaires 28} et des stabilisants chimiques ont été incorporés pour faciliter le repliement des protéines cibles, contribuant ainsi à la diversification des systèmes CFPS. L’ARN polymérase T7 du bactériophage, connu pour sa processivité élevée, est principalement utilisé pour la transcription, bien que d’autres polymérases telles que SP6²⁹ aient également été utilisées. L’ARN polymérase endogène d’E. coli a été adaptée pour le prototypage de circuits génétiques en exploitant les facteurs sigma³⁰. Enfin, une variété de précurseurs d’énergie 31,32,33 et différents sels et composants tampons 19,34,35 ont été systématiquement optimisés pour améliorer la productivité.

Outre le système CFPS lui-même, les méthodes d’encapsulation ainsi que les matériaux de compartimentation sont également essentiels pour la réussite de l’assemblage des cellules synthétiques. Divers systèmes qui ont été développés pour encapsuler avec succès la réaction CFPS comprennent des gouttelettes d’eau/d’huile stabilisées par des tensioactifs, des lipides/polymères et leurs vésicules unilamellaires hybrides (avec des diamètres allant de 50 nm à plusieurs μm), ainsi que des bicouches lipidiques à support planaire. Cependant, en raison de la teneur en molécules complexées du système CFPS, le taux de réussite de l’encapsulation dépend de cas spécifiques, notamment pour la formation de vésicules. Pour améliorer le taux de réussite et l’efficacité de l’encapsulation des CFPS, diverses puces de microfluides ont été développées pour faciliter la formation de gouttelettes et de vésicules³⁶. Néanmoins, des puces et des appareils supplémentaires devront être mis en place.

Ce protocole délimite un système CFPS d’E. coli utilisant la souche BL21(DE3), qui est un hôte couramment utilisé pour la production de protéines recombinantes. Le protocole comprend un compte rendu détaillé de la préparation de l’extrait cellulaire, de la préparation de la matrice et de l’optimisation de l’expression standard à l’aide d’une protéine rapporteure fluorescente. De plus, nous présentons des résultats exemplaires obtenus en encapsulant le système CFPS dans divers micro-compartiments, y compris des gouttelettes monocouches, des vésicules à double émulsion et des chambres situées au sommet de bicouches lipidiques soutenues. Enfin, nous exposons les éléments procéduraux essentiels et les conditions requises indispensables à la mise en place réussie de ces systèmes CFPS dans des contextes environnementaux distincts.

Protocole

1. Préparation de l’extrait

1. Épluchez la souche d’E. coli BL21 (DE3) à partir d’un stock de glycérol sur une plaque de gélose Luria Bertani (LB) et incubez pendant au moins 15 h à 37 °C.
2. Préparez une préculture d’une nuit en inoculant une seule colonie de la plaque LB fraîchement préparée dans une fiole de 50 mL de milieu Luria Bertani (LB).
3. Inoculer 5 mL de préculture dans 500 mL de milieu 2xYTPG dans un erlenmeyer à chicanes de 3 L. Cultivez-la à 37 °C en secouant vigoureusement (entre 220 tr/min et 250 tr/min) et récoltez les cellules lorsqu’elles atteignent la phase mi-logarithmique (OD₆₀₀ ~ 3). Ensuite, placez les cultures cellulaires dans de l’eau glacée froide pendant 10 min et centrifugez-les à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
   REMARQUE : Dans cette étape, le glucose dans le milieu 2xYTPG peut être omis pour des applications spécifiques ^9,12.
4. Remettre en suspension les pastilles obtenues dans 35 mL de tampon S30 A pré-refroidi, puis procéder à une centrifugation à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
5. Répétez l’étape 1.4 deux fois.
   REMARQUE : Les granulés de cellule peuvent être stockés à -80 °C s’ils ne sont pas utilisés immédiatement.
6. Remettez les pastilles finales en suspension dans la mémoire tampon S30 B (p. ex., utilisez 1,1 mL de tampon S30 B pour 1 g de pastille cellulaire) et perturbez les cellules en un seul passage dans la presse française à 17 000 psi.
   1. Pour utiliser la presse française, suivez le manuel d’utilisation et transférez la suspension de la cellule dans la chambre de dérivation du métal de la presse française, en vous assurant que tous les composants sont assemblés et que la soupape inférieure de la chambre de dérivation est fermée.
   2. Transférez la chambre de perturbation assemblée sur la plate-forme hydraulique et sécurisez le verrou de sécurité.
   3. Allumez la pompe hydraulique et commencez la perturbation.
   4. Contrôlez la soupape de sortie pour permettre à la suspension de la cellule de s’écouler du tube de sortie dans un nouveau tube de 50 ml. Ajustez la vitesse d’écoulement pour assurer une perturbation efficace, idéalement une goutte à la fois. Maintenez la pression au-dessus de la limite inférieure de 15 000 psi.
7. Centrifugez le lysat obtenu à 30 000 × g pendant 30 min à 4 °C et prélevez le surnageant. Répétez la centrifugation une fois et récupérez le surnageant. Ajouter 0,3 volume de tampon de préincubation dans le surnageant collecté et incuber en agitant doucement à 37 °C pendant 80 min.
   REMARQUE : L’utilisation d’un tampon de préincubation pourrait augmenter le rendement final, bien qu’il ait été signalé qu’un ruissellement vide (sans tampon de préincubation) pourrait également améliorer l’efficacité^37,38, qui dépend de la souche source correspondante.
8. Dialiser le mélange de ruissellement obtenu pendant 2 h contre 2 L de tampon S30 C, remplacer une fois le tampon de dialyse par 2 L de tampon S30 C frais et dialyser pendant une nuit à 4 °C³⁹.
   REMARQUE : La deuxième étape de la dialyse de nuit peut être raccourcie à environ 3 h.
9. Prélever l’échantillon dialysé et centrifuger à 30 000 × g pendant 30 min à 4 °C. Recueillir le surnageant et l’aliquote dans les volumes appropriés et congeler immédiatement dans de l’azote liquide.
   REMARQUE : L’échantillon congelé peut être stocké à -80 °C au moins pendant 6 mois à 1 an sans perte d’efficacité.

2. ARN polymérase T7

1. Transformer le plasmide pAR1219 en cellules compétentes BL21(DE3) star E. coli ⁴⁰.
2. Inoculer 10 mL d’une culture de nuit dans 1 L de milieu LB (contenant 100 μg/mL d’ampicilline). Cultivez les cellules à 37 °C jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne 0,6-0,8.
3. Démarrez l’induction en ajoutant une concentration finale de 1 mM d’IPTG. Induire les cellules pendant 5 h supplémentaires et récolter par centrifugation à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Conservez les granulés cellulaires à -80 °C pendant plusieurs semaines maximum.
4. Remettez les pastilles en suspension dans 30 mL de tampon T7 A et perturbez les cellules en un seul passage dans la presse française à 15 000 psi. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
5. Ajouter le sulfate de streptomycine goutte à goutte sur le surnageant de l’étape précédente, jusqu’à une concentration finale de 4 % (p/v). Après une courte incubation sur glace, centrifuger à 20 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
6. Filtrez le surnageant à travers une membrane filtrante de 0,45 μm et chargez l’échantillon filtré sur une colonne d’échange d’anions forte (volume de colonne de 40 mL), qui a été prééquilibrée avec 10 volumes de colonne de tampon T7 B, via un système de chromatographe liquide automatisé.
7. Laver la colonne chargée avec 50 volumes de colonne de tampon B T7 et éluer l’échantillon avec 10 volumes de colonne de mélanges de tampon C T7 à faible teneur en sel (50 mM) et à haute teneur en sel (500 mM), en établissant un gradient de concentration linéaire de NaCl de 50 à 500 mM à un débit de ~3 mL/min⁴¹.
8. Collectez les fractions de crête et analysez-les par SDS-PAGE.
   REMARQUE : La polymérase T7 présente une bande prédominante à ~100 kDa, tandis que des quantités importantes d’impuretés apparaissent encore sur le gel SDS-PAGE.
9. Regroupez les fractions contenant de la T7 polymérase et dialysez-les contre 2 L de tampon T7 C pendant la nuit.
10. Ajouter du glycérol pour atteindre une concentration finale de 10% et concentrer le mélange obtenu à une concentration finale de 3-4 mg/mL par ultrafiltration⁴².
    REMARQUE : Si des précipitations apparaissent pendant le processus de concentration, arrêtez-vous immédiatement et éliminez les précipités par centrifugation.
11. Ajustez la concentration de glycérol à 50%. Aliquote et congélation instantanée de l’échantillon avec de l’azote liquide. Conserver à −80 °C pendant une période plus longue.
    REMARQUE : Une petite aliquote peut également être stockée à -20 °C pendant au moins 1 mois sans perte d’efficacité.

3. Préparation du tampon

1. Préparez les tampons comme indiqué dans le tableau 1 un jour avant l’utilisation.

4. Conception et préparation du modèle

1. Clonez le gène d’intérêt dans un vecteur basé sur le promoteur T7 ou générez un produit de PCR linéaire contenant le gène d’intérêt.
   REMARQUE : Voir la section de discussion pour les principes de conception.
2. Préparez le plasmide à partir d’une culture nocturne à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide.
   REMARQUE : Nous vous recommandons de choisir un kit plasmidique qui comprend une étape de précipitation de l’isopropanol suivie d’une procédure de lavage avec de l’éthanol à 70%.
3. Dissoudre l’ADN séché dans un petit volume d’eau ultrapure jusqu’à une concentration comprise entre 200 μg/mL et 500 μg/mL, déterminée par un spectrophotomètre de microvolume.
4. Facultatif : Exprimer directement les protéines à partir de produits de PCR linéaire.
   REMARQUE : Dans ce cas, une étape de purification par PCR est nécessaire.

5. Optimisation Mg²⁺ et K⁺

1. Préparez un mélange maître pour le dépistage de la concentration en Mg²⁺ , comme indiqué dans le tableau 2, ou pour le dépistage de la concentration en K⁺ , comme indiqué dans le tableau 3.
2. Transférez le mélange principal dans des tubes microfuges individuels ou une plaque en forme de V à 96 puits.
3. Pipetez le volume exact de solutions mères de Mg²⁺ ou K⁺ dans des tubes microfuges individuels ou dans la plaque en forme de V à 96 puits et complétez les réactions CFPS avec de l’eau ultrapure. Incuber les réactions pendant au moins 2 h.
   REMARQUE : Si vous utilisez une plaque en forme de V à 96 puits, scellez la plaque avec un couvercle en plastique pour éviter l’évaporation.
4. Prélever 2 μL du mélange réactionnel et le transférer dans une plaque noire à 96 puits pour les mesures de fluorescence par un lecteur de plaques.
   REMARQUE : Nous utilisons un lecteur de plaques fluorescentes avec la configuration suivante : excitation / émission : 485/528, Gain : 50, Hauteur de lecture : 7,00 mm. Cependant, il faudrait régler son lecteur de plaques pour générer une courbe d’étalonnage spécifique à l’aide de protéines fluorescentes purifiées.

6. Encapsulation

1. Gouttelette
   1. Préparez une huile fluorée contenant un tensioactif (2 % de PFPE-PEG dans HFE7500) ou une solution d’huile lipidique-minérale en dissolvant les lipides dans de l’huile minérale (voir l’étape 6.2.1)
   2. Préparez un volume total de 100 μL de réaction CFPS en combinant les réactifs correspondants 2 à 18 du tableau 4. Ajouter la réaction CFPS à 500 μL d’huile préalablement préparée dans un tube de 1,5 mL, puis frotter vigoureusement le tube sur la grille du tube 50x pour former de fines gouttelettes (eau dans l’huile). Incuber le tube à 30 °C pour effectuer la réaction.
      REMARQUE : De simples puces microfluidiques pourraient également être utilisées pour générer des gouttelettes homogènes⁴³.
2. Vésicules unilamellaires géantes (GUV)
   1. Préparation de la solution d’huile lipidique-minérale
      1. Ajouter 57 μL de chloroforme dans un flacon en verre de 4 mL, puis ajouter 18 μL de lipides de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycérol-3-phosphocholine (POPC) de 25 mg/mL pour former la solution lipidique de chloroforme, atteignant une concentration finale de 8 mM (utiliser d’autres lipides ayant des concentrations finales similaires).
         REMARQUE : Cette étape de mélange visait à assurer un mélange homogène des différents lipides.
      2. Évaporez le chloroforme sous un flux d’argon pendant 15 min, puis évaporez davantage sous vide pendant 1 h.
      3. Dissoudre les lipides secs obtenus dans 1 500 μL d’huile minérale, jusqu’à une concentration finale de 400 μM. Incuber le mélange pendant la nuit à température ambiante.
   2. Formation d’une couche lipidique interfaciale
      1. Ajouter 500 μL de la solution externe (voir le tableau 5) dans un tube de 1,5 mL et superposer lentement 250 μL de solution d’huile lipidique et minérale sur la solution externe. Incuber à température ambiante pendant 30 min pour former une couche lipidique interfaciale stable.
   3. Préparation de la solution interne
      1. Mélangez tous les réactifs du tableau 6 pour former la solution de préinner et conservez-la sur de la glace jusqu’à utilisation. Complétez la solution interne en ajoutant du T7RNAP, de l’extrait S30 et une matrice d’ADN dans la solution préinterne en tant que réactifs 16 à 18 énumérés dans le tableau 4.
         REMARQUE : L’augmentation de la concentration de saccharose encapsulé au-dessus de 250 mM peut inhiber la traduction acellulaire⁴⁴.
   4. Formation des GUV
      1. Ajouter 50 μL de solution interne dans un tube neuf de 1,5 mL contenant 500 μL d’huile lipidique-minérale, pipeter de haut en bas rapidement et agiter vigoureusement.
      2. Laissez le tube sur de la glace pendant 10 minutes et ajoutez lentement 20 μL du mélange d’émulsion sur le dessus de la phase huileuse dans le tube de 1,5 mL à partir de l’étape 6.2.2.
      3. Centrifuger à 800 × g (utiliser une vitesse de centrifugation allant de 100 × g à 1000 × g) pendant 10 min à 4 °C et observer la formation de GUVs au fond du tube.
         REMARQUE : Une vitesse de centrifugation spécifique plus élevée peut être utilisée ; cependant, on pourrait considérer que la vitesse de centrifugation pourrait influencer la taille des GUV⁴⁵ formés.
      4. Retirez la phase d’huile supérieure.
      5. Aspirez soigneusement 30 μL de GUVs au fond du tube. Incuber les GUV collectés à 30 °C.
         REMARQUE : La température d’incubation optimale varie pour différentes protéines.
      6. Utilisez la microscopie confocale à balayage laser (LSM) pour surveiller l’expression des protéines fluorescentes.
3. Bicouche lipidique prise en charge (SLB)
   1. Préparation des chambres SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 en ajoutant sept gouttes d’acide sulfurique et deux gouttes de peroxyde d’hydrogène à 50 % au centre de chaque lame de couverture. Incuber les réactifs sur les lamelles pendant au moins 45 min ; Rincez abondamment à l’eau ultra-pure.
      2. Assemblez la chambre de reconstitution en fixant un tube de microfuge coupé de 0,5 mL sur les lamelles nettoyées à l’aide de colle optique durcie sous une lampe ultraviolette (365 nm) pendant 10 min pour former une chambre de réaction.
   2. Formation SLB
      1. Dissoudre 80 % molaire de 1,2-dioléoyl-sn-glycérol-3-phosphocholine (DOPC), 19,95 % molaire de 1,2-dioleoyl-sn-glycérol-3-phospho-L-sérine (DOPS) et 0,05 % molaire d’Atto488-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine = DOPE), mélanger dans du chloroforme, sécher sous un léger écoulement d’azote et mettre sous vide pendant 1 h pour éliminer complètement le solvant.
      2. Réhydratez le film lipidique séché dans le tampon SLB A, ce qui permet d’obtenir une concentration finale en lipides de 4 mg/mL.
      3. Vortex et sonicate les échantillons résultants jusqu’à ce qu’ils deviennent clairs.
      4. Diluer 4 mg/mL de SUV avec 130 μL de tampon SLB A, transférer 75 μL de la suspension dans les chambres de réaction préformées et l’incuber sur un bloc chauffant à 37 °C pendant 1 min. Ajouter 150 μL de tampon SLB A dans la chambre de réaction pour une incubation ultérieure pendant 2 min.
      5. Lavez la chambre avec 2 mL de tampon SLB B (tampon SLB A sans MgCl₂) avant de remplacer le tampon par le tampon S30 C avec 0,4 % (p/v) BSA pour les réactions CFPS, en laissant 100 μL de tampon à l’intérieur de la chambre pour éviter que le SLB formé ne se dessèche.
      6. Retirez le résidu du tampon S30 C et ajoutez soigneusement le mélange réactionnel CFPS dans la chambre SLB. Incuber la chambre à 30 °C et surveiller l’expression à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.

Résultats

Pour chaque nouveau lot d’extrait cellulaire et d’ARN polymérase T7, il est recommandé d’effectuer un dépistage de base des concentrations de Mg²⁺ et de K⁺ afin d’assurer les performances optimales du système CFPS. La fluorescence de la GFP du superplieur peut servir d’indicateur du rendement global du système CFPS dans des conditions variables, comme illustré à la figure 1A,B. De plus, une comparaison ...

Discussion

Ce manuscrit décrit un système modifié de synthèse de protéines libres (CFPS) conçu pour être utilisé dans divers micro-compartiments à travers des plateformes cellulaires synthétiques, y compris les gouttelettes d’eau dans l’huile, les GUV et les SLB. Nous avons utilisé la souche hôte standard d’expression de la protéine recombinante d’E. coli, BL21(DE3), comme extrait source pour construire des systèmes cellulaires synthétiques centrés sur les protéine...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203