Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

Resumen

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Resumen

El sistema de Síntesis de Proteínas Libres de Células (CFPS) se ha empleado ampliamente para facilitar el ensamblaje ascendente de células sintéticas. Sirve como anfitrión para la maquinaria central del Dogma Central, erigiéndose como un chasis óptimo para la integración y el ensamblaje de diversos sistemas de mimetismo celular artificial. A pesar de su uso frecuente en la fabricación de células sintéticas, el establecimiento de un sistema CFPS robusto y adaptado para una aplicación específica sigue siendo un reto no trivial. En este artículo de métodos, presentamos un protocolo completo para el sistema CFPS, empleado rutinariamente en la construcción de células sintéticas. Este protocolo abarca etapas clave en la preparación del sistema CFPS, incluido el extracto celular, la preparación de plantillas y la optimización de la expresión de rutina utilizando una proteína reportera fluorescente. Además, mostramos resultados representativos al encapsular el sistema CFPS dentro de varios microcompartimentos, como gotas monocapa, vesículas de doble emulsión y cámaras situadas sobre bicapas lipídicas soportadas. Finalmente, dilucidamos los pasos críticos y las condiciones necesarias para el ensamblaje exitoso de estos sistemas CFPS en distintos entornos. Esperamos que nuestro enfoque facilite el establecimiento de buenas prácticas de trabajo entre varios laboratorios dentro de la comunidad de células sintéticas en continua expansión, acelerando así el progreso en el campo del desarrollo de células sintéticas.

Introducción

La síntesis de células sintéticas o artificiales se ha convertido en un campo muy destacado de investigación interdisciplinaria, que atrae un interés sustancial de los científicos de todos los dominios de la biología sintética, la química y la biofísica. Estos científicos están unidos por el objetivo común de construir una célula viva mínima ^1,2,3. El rápido crecimiento de este campo ha ido en sintonía con avances significativos en tecnologías críticas, como la manipulación del ADN recombinante⁴, los materiales biomiméticos⁵ y las técnicas de microfabricación para la compartimentación⁶, incluido el método de síntesis de proteínas libres de células (CFPS)⁷. Los sistemas CFPS abarcan la maquinaria celular esencial para la transcripción y la traducción, proporcionando el marco fundamental para el desarrollo y la integración de células artificiales multifuncionales.

Aunque las técnicas de CFPS se utilizan con frecuencia en el ensamblaje de células sintéticas, el desarrollo de un sistema de CFPS robusto y adaptado para el ensamblaje de varios sistemas de células sintéticas sigue siendo un desafío complejo. En la actualidad, se dispone de numerosos sistemas de CFPS, derivados de organismos modelo tanto procariotas como eucariotas⁸, cada uno especializado para aplicaciones particulares en la síntesis de células sintéticas. Más allá de sus funciones centrales en la transcripción y la traducción, los sistemas CFPS varían en sus componentes principales y en los procedimientos de preparación asociados. Estas variaciones, que incluyen diferencias en los extractos celulares, las ARN polimerasas, los métodos de preparación de plantillas y las composiciones de los tampones, se deben en gran medida a las distintas trayectorias de desarrollo seguidas por los grupos de investigación que han optimizado intensamente sus sistemas para obtener el máximo rendimiento de proteínas.

Entre los diversos componentes del sistema CFPS, el extracto celular es un grupo enzimático crítico para la transcripción y la traducción y, por lo tanto, un determinante clave del rendimiento de CFPS⁹. El CFPS basado en Escherichia coli (E. coli) es el sistema más utilizado debido a su condición de organismo procariota mejor comprendido. Además, el grupo de investigación de Ueda ha desarrollado un sistema de CFPS totalmente reconstituido que comprende proteínas y ribosomas purificados individualmente, conocido como PURE¹⁰, que es especialmente adecuado para aplicaciones que requieren un fondo claro. Hoy en día, incluso los sistemas de CFPS basados en E. coli se han diversificado, especialmente en términos de las cepas fuente para el extracto¹¹ y los métodos de preparación^12,13, ARN polimerasa^14,15, fuentes de energía^16,17 y sistemas tampón^18,19. Las cepas más utilizadas incluyen derivados de la cepa K12 y B, como A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² y Rossetta2²³, junto con sus contrapartes modificadas genéticamente.

Inicialmente, se eligieron cepas de E. coli con actividades reducidas de ARNasa y proteasa para mejorar la estabilidad del ARNm y la estabilidad de las proteínas recombinantes recién sintetizadas, lo que condujo a un mayor rendimiento final de proteínas²⁴. Posteriormente, los extractos de E. coli se diseñaron para facilitar modificaciones postraduccionales específicas, incluida la glicosilación²⁵, la fosforilación²⁶ y la lipidación²⁷, para lograr las modificaciones postraduccionales anteriores. Además, se han incorporado una serie de aditivos como acompañantes moleculares²⁸ y estabilizadores químicos para ayudar al plegamiento de las proteínas objetivo, lo que contribuye a la diversificación de los sistemas CFPS. La ARN polimerasa del bacteriófago T7, conocida por su alta procesividad, se emplea predominantemente para la transcripción, aunque también se han utilizado otras polimerasas como la SP6²⁹. La ARN polimerasa endógena de E. coli ha sido adaptada para la creación de prototipos de circuitos genéticos aprovechando los factores sigma³⁰. Por último, se han optimizado sistemáticamente una variedad de precursores de energía 31,32,33 y diferentes sales y componentes tampón 19,34,35 para mejorar la productividad.

Además del propio sistema CFPS, los métodos de encapsulación y los materiales de compartimentación también son vitales para el éxito del ensamblaje de células sintéticas. Varios sistemas que se han desarrollado para encapsular con éxito la reacción CFPS incluyen gotas de agua/aceite estabilizadas con surfactante, lípidos/polímeros y sus vesículas unilaminares híbridas (con diámetros que van desde 50 nm hasta varios μm), así como bicapas lipídicas soportadas planas. Sin embargo, debido al contenido de moléculas complejadas del sistema CFPS, la tasa de éxito de la encapsulación depende de casos específicos, particularmente para la formación de vesículas. Para mejorar la tasa de éxito y la eficiencia de la encapsulación de CFPS, se han desarrollado varios chips de microfluidos para facilitar la formación de gotas y vesículas³⁶. Sin embargo, será necesario establecer chips y dispositivos adicionales.

Este protocolo delinea un sistema CFPS de E. coli que utiliza la cepa BL21 (DE3), que es un huésped comúnmente empleado para la producción de proteínas recombinantes. El protocolo abarca una descripción detallada de la preparación del extracto celular, la preparación de la plantilla y la optimización de la expresión estándar utilizando una proteína reportera fluorescente. Además, presentamos resultados ejemplares logrados al encapsular el sistema CFPS dentro de diversos microcompartimentos, incluidas gotas monocapa, vesículas de emulsión doble y cámaras situadas sobre bicapas lipídicas soportadas. Por último, exponemos los elementos procedimentales fundamentales y las condiciones necesarias indispensables para el establecimiento exitoso de estos sistemas de PPC en contextos ambientales distintos.

Protocolo

1. Preparación del extracto

1. Pasar la cepa de E. coli BL21 (DE3) de un caldo de glicerol a una placa de agar Luria Bertani (LB) e incubar durante al menos 15 h a 37 °C.
2. Prepare un precultivo durante la noche inoculando una sola colonia de la placa LB recién preparada en un matraz de 50 mL de medio Luria Bertani (LB).
3. Inocular 5 mL de precultivo en 500 mL de medio 2xYTPG en un matraz Erlenmeyer deflector de 3 L. Cultivarla a 37 °C con agitación vigorosa (entre 220 rpm y 250 rpm) y cosechar las células cuando alcancen la fase de registro medio (OD₆₀₀ ~ 3). A continuación, colocar los cultivos celulares en agua helada fría durante 10 min y centrifugar a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C.
   NOTA: En este paso, la glucosa en el medio 2xYTPG se puede omitir para aplicaciones específicas ^9,12.
4. Vuelva a suspender los gránulos de celda resultantes en 35 mL de tampón S30 A preenfriado, seguido de una centrifugación a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
5. Repita el paso 1.4 dos veces.
   NOTA: Los pellets de celda pueden almacenarse a -80 °C si no se utilizan inmediatamente.
6. Vuelva a suspender los gránulos finales en el tampón S30 B (por ejemplo, use 1,1 ml de tampón S30 B por 1 g de gránulo de celda) y rompa las celdas en una pasada a través de French Press a 17,000 psi.
   1. Para usar la prensa francesa, siga el manual del usuario y transfiera la suspensión de la celda a la cámara de disrupción metálica de la prensa francesa, asegurándose de que todos los componentes estén ensamblados y que la válvula inferior de la cámara de interrupción esté cerrada.
   2. Transfiera la cámara de interrupción ensamblada a la plataforma hidráulica y asegure el bloqueo de seguridad.
   3. Encienda la bomba hidráulica e inicie la interrupción.
   4. Controle la válvula de salida para permitir que la suspensión de la celda fluya fuera del tubo de salida a un nuevo tubo de 50 mL. Ajuste la velocidad del flujo para garantizar una interrupción eficiente, idealmente una gota a la vez. Mantenga la presión por encima del límite inferior de 15.000 psi.
7. Centrifugar el lisado resultante a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Repita la centrifugación una vez y recoja el sobrenadante. Añadir 0,3 volumen de tampón de preincubación en el sobrenadante recogido e incubar agitando suavemente a 37 °C durante 80 min.
   NOTA: El uso de tampón de preincubación podría aumentar el rendimiento final, aunque se ha reportado que una escorrentía vacía (sin tampón de preincubación) también podría mejorar la eficiencia^37,38, que depende de la cepa fuente correspondiente.
8. Diálisis la mezcla de escorrentía resultante durante 2 h frente a 2 L de tampón S30 C, cambio el tampón de diálisis una vez por 2 L de tampón S30 C fresco y dializamos durante la noche a 4 °C³⁹.
   NOTA: El segundo paso de la diálisis nocturna se puede acortar a aproximadamente 3 h.
9. Recoger la muestra dializada y centrifugar a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante y la alícuota en volúmenes apropiados y congele rápidamente en nitrógeno líquido.
   NOTA: La muestra congelada puede almacenarse a -80 °C al menos durante 6 meses a 1 año sin pérdida de eficiencia.

2. ARN polimerasa T7

1. Transformar el plásmido pAR1219 en células competentes de E. coli estrella BL21 (DE3)⁴⁰.
2. Inocular 10 mL de un cultivo nocturno en 1 L de medio LB (que contiene 100 μg/mL de ampicilina). Cultive las células a 37 °C hasta que el OD₆₀₀ alcance 0,6-0,8.
3. Inicie la inducción añadiendo una concentración final de 1 mM de IPTG. Inducir las células durante 5 h adicionales y cosechar por centrifugación a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C. Almacene los gránulos de celdas a -80 °C durante varias semanas.
4. Vuelva a suspender los gránulos de células en 30 ml de tampón T7 A y rompa las células en una sola pasada a través de la prensa francesa a 15.000 psi. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 20.000 × g durante 30 min a 4 °C.
5. Añadir sulfato de estreptomicina gota a gota al sobrenadante del paso anterior, alcanzando una concentración final del 4% (p/v). Después de una breve incubación en hielo, centrifugar a 20.000 × g durante 30 min a 4 °C.
6. Filtre el sobrenadante a través de una membrana filtrante de 0,45 μm y cargue la muestra filtrada en una columna de intercambio aniónico fuerte (volumen de columna de 40 mL), que se preequilibró con volúmenes de 10 columnas de tampón T7 B, a través de un sistema automatizado de cromatógrafo de líquidos.
7. Lave la columna cargada con 50 volúmenes de columna de tampón T7 B y eluya la muestra con 10 volúmenes de columna de mezclas de tampón C T7 con bajo contenido de sal (50 mM) y alto contenido de sal (500 mM), estableciendo un gradiente de concentración lineal de NaCl de 50 a 500 mM a un caudal de ~3 mL/min⁴¹.
8. Recoja las fracciones de pico y analícelas por SDS-PAGE.
   NOTA: La polimerasa T7 exhibe una banda predominante a ~ 100 kDa, mientras que aún aparecen cantidades significativas de impurezas en el gel SDS-PAGE.
9. Agrupar las fracciones que contienen T7 polimerasa y dializar contra 2 L de tampón T7 C durante la noche.
10. Añadir glicerol hasta alcanzar una concentración final del 10% y concentrar la mezcla resultante hasta una concentración final de 3-4 mg/mL por ultrafiltración⁴².
    NOTA: Si aparece precipitación durante el proceso de concentración, deténgase inmediatamente y elimine los precipitados por centrifugación.
11. Ajusta la concentración de glicerol al 50%. Alícuota y congelación instantánea de la muestra con nitrógeno líquido. Almacenar a -80 °C durante más tiempo.
    NOTA: Una pequeña alícuota también podría almacenarse a -20 °C durante al menos 1 mes sin pérdida de eficiencia.

3. Preparación del tampón

1. Prepare los tampones como se indica en la Tabla 1 un día antes de su uso.

4. Diseño y preparación de plantillas

1. Clone el gen de interés en un vector basado en el promotor T7 o genere un producto de PCR lineal que contenga el gen de interés.
   NOTA: Consulte la sección de discusión para conocer los principios de diseño.
2. Prepare el plásmido a partir de un cultivo nocturno utilizando un kit de extracción de plásmido.
   NOTA: Recomendamos seleccionar un kit de plásmidos que incluya un paso de precipitación de isopropanol seguido de un procedimiento de lavado con etanol al 70%.
3. Disuelva el ADN seco en un pequeño volumen de agua ultrapura hasta una concentración entre 200 μg/mL y 500 μg/mL, según lo determine un espectrofotómetro de microvolúmenes.
4. Opcional: Exprima directamente proteínas de productos de PCR lineal.
   NOTA: En este caso, se necesita un paso de purificación por PCR.

5. Optimización^{de Mg 2+} y K⁺

1. Prepare una mezcla maestra para el cribado de concentración de Mg²⁺ como se indica en la Tabla 2, o para el cribado de concentración de K⁺ como se indica en el Cuadro 3.
2. Transfiera la mezcla maestra a tubos de microfuga individuales o a una placa de 96 pocillos en forma de V.
3. Pipetear el volumen exacto de soluciones madre de Mg²⁺ o K⁺ en tubos de microfuga individuales o en la placa de 96 pocillos en forma de V y completar las reacciones CFPS con agua ultrapura. Incubar las reacciones durante al menos 2 h.
   NOTA: Si usa una placa de 96 pocillos en forma de V, selle la placa con una cubierta de plástico para evitar la evaporación.
4. Extraiga 2 μL de la mezcla de reacción y transfiéralo a una placa negra de 96 pocillos para mediciones de fluorescencia mediante un lector de placas.
   NOTA: Utilizamos un lector de placas fluorescentes con la siguiente configuración: excitación/emisión: 485/528, Ganancia: 50, Altura de lectura: 7,00 mm. Sin embargo, sería necesario ajustar su lector de placas para generar una curva de calibración específica utilizando proteínas fluorescentes purificadas.

6. Encapsulación

1. Gotita
   1. Prepare un aceite fluorado que contenga surfactante (2% de PFPE-PEG en HFE7500) o una solución de aceite mineral y lípidos disolviendo el lípido en aceite mineral (consulte el paso 6.2.1)
   2. Prepare un volumen total de 100 μL de reacción de CFPS combinando los reactivos correspondientes 2-18 de la Tabla 4. Agregue la reacción de CFPS a 500 μL del aceite previamente preparado en un tubo de 1,5 mL y luego, frote el tubo vigorosamente sobre la rejilla de tubos 50x para formar gotas finas (agua en aceite). Incubar el tubo a 30 °C para realizar la reacción.
      NOTA: Los chips de microfluídica simples también podrían usarse para generar gotas homogéneas⁴³.
2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs)
   1. Preparación de la solución de lípidos y aceite mineral
      1. Agregue 57 μL de cloroformo en un vial de vidrio de 4 mL y luego agregue 18 μL de 25 mg/mL de lípidos de 1-palmitoil-2-oleoil-glicerol-3-fosfocolina (POPC) para formar la solución lipídica de cloroformo, logrando una concentración final de 8 mM (use otros lípidos con concentraciones finales similares).
         NOTA: Este paso de mezcla fue para asegurar una mezcla homogénea de diferentes lípidos.
      2. Evapore el cloroformo bajo un flujo de argón durante 15 minutos y, a continuación, evapore aún más al vacío durante 1 h.
      3. Disolver los lípidos secos resultantes en 1.500 μL de aceite mineral, alcanzando una concentración final de 400 μM. Incubar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente.
   2. Formación de una capa lipídica interfacial
      1. Añada 500 μL de la solución exterior (véase la Tabla 5) a un tubo de 1,5 mL y coloque lentamente 250 μL de solución de aceite mineral y lípidos sobre la solución exterior. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para formar una capa lipídica interfacial estable.
   3. Preparación de la solución interna
      1. Mezcle todos los reactivos de la Tabla 6 para formar la solución preinterna y manténgala en hielo hasta su uso. Complete la solución interna agregando T7RNAP, extracto S30 y plantilla de ADN en la solución preinterna como los reactivos 16-18 enumerados en la Tabla 4.
         NOTA: El aumento de la concentración de sacarosa encapsulada por encima de 250 mM podría inhibir la traducción libre de células⁴⁴.
   4. Formación de GUVs
      1. Añada 50 μL de solución interna a un tubo nuevo de 1,5 mL que contenga 500 μL de aceite mineral lipídico, pipetee hacia arriba y hacia abajo rápidamente y haga un vórtice vigoroso.
      2. Deje el tubo en hielo durante 10 minutos y añada lentamente 20 μL de la mezcla de emulsión en la parte superior de la fase oleosa en el tubo de 1,5 mL del paso 6.2.2.
      3. Centrifugar a 800 × g (utilizar una velocidad de centrifugación que oscile entre 100 × g y 1000 × g) durante 10 min a 4 °C y observar la formación de GUV en el fondo del tubo.
         NOTA: Se podría utilizar una velocidad de centrifugación específica más alta; sin embargo, se podría considerar que la velocidad de centrifugación podría influir en el tamaño de los GUV formados⁴⁵.
      4. Retire la fase superior de aceite.
      5. Aspire 30 μL de GUV en la parte inferior del tubo con cuidado. Incubar los GUV recolectados a 30 °C.
         NOTA: La temperatura óptima de incubación varía para las diferentes proteínas.
      6. Utilice la microscopía de barrido láser confocal (LSM) para monitorizar la expresión de proteínas fluorescentes.
3. Bicapa lipídica compatible (SLB)
   1. Preparación de cámaras SLB
      1. Cubreobjetos Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 agregando siete gotas de ácido sulfúrico y dos gotas de peróxido de hidrógeno al 50% en el centro de cada portaobjetos de cubierta. Incubar los reactivos en los cubreobjetos durante al menos 45 min; Enjuague bien con agua ultrapura.
      2. Ensamble la cámara de reconstitución conectando un tubo de microfuga cortado de 0,5 mL en los cubreobjetos limpios con pegamento óptico curado bajo una lámpara ultravioleta (365 nm) durante 10 minutos para formar una cámara de reacción.
   2. Formación de SLB
      1. Disuelva 80% mol 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC), 19,95 mol% 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfo-L-serina (DOPS) y 0,05 mol% Atto488-DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina = DOPE), mezcle en cloroformo, seque con un flujo de nitrógeno suave y aspire durante 1 h para eliminar el solvente por completo.
      2. Rehidratar la película lipídica seca en el tampón SLB A, lo que da como resultado una concentración final de lípidos de 4 mg/mL.
      3. Vórtice y sonique las muestras resultantes hasta que se aclaren.
      4. Diluir 4 mg/mL de SUV con 130 μL de tampón SLB A, transferir 75 μL de la suspensión a las cámaras de reacción preformadas e incubar en un bloque de calor a 37 °C durante 1 min. Añada 150 μL de tampón SLB A a la cámara de reacción para una mayor incubación durante 2 min.
      5. Lave la cámara con 2 mL de tampón SLB B (tampón SLB A sin MgCl₂) antes de un cambio de tampón al tampón S30 C con 0,4% (p/v) de BSA para reacciones de CFPS, dejando 100 μL de tampón dentro de la cámara para evitar que el SLB formado se seque.
      6. Retire el tampón S30 C residual y añada la mezcla de reacción CFPS en la cámara SLB con cuidado. Incubar la cámara a 30 °C y monitorizar la expresión bajo un microscopio de barrido láser confocal.

Resultados

Para cada nuevo lote de extracto celular y ARN polimerasa T7, se recomienda realizar un cribado básico de las concentraciones de Mg²⁺ y K⁺ para garantizar el rendimiento óptimo del sistema CFPS. La fluorescencia de la GFP de la superplegadora puede servir como indicador del rendimiento general del sistema CFPS en condiciones variables, como se ilustra en la Figura 1A, B. Además, en la Figura 1C

Discusión

Este manuscrito describe un sistema modificado de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) diseñado para su uso en varios microcompartimentos en plataformas celulares sintéticas, incluidas gotas de agua en aceite, GUV y SLB. Utilizamos la cepa huésped estándar de expresión de proteínas recombinantes de E. coli, BL21 (DE3), como extracto fuente para la construcción de sistemas celulares sintéticos centrados en proteínas. Este enfoque produjo aproximadamente 0,5 ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203