Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

Riepilogo

Questo protocollo descrive il sistema di sintesi proteica senza cellule (CFPS) utilizzato nella costruzione di cellule sintetiche. Delinea le fasi chiave con risultati rappresentativi in diversi micro-compartimenti. Il protocollo mira a stabilire le migliori pratiche per i diversi laboratori della comunità delle cellule sintetiche, facendo avanzare i progressi nello sviluppo delle cellule sintetiche.

Abstract

Il sistema di sintesi proteica senza cellule (CFPS) è stato ampiamente impiegato per facilitare l'assemblaggio dal basso verso l'alto di cellule sintetiche. Funge da ospite per il macchinario centrale del Dogma Centrale, rappresentando un telaio ottimale per l'integrazione e l'assemblaggio di diversi sistemi di mimetismo cellulare artificiale. Nonostante il suo uso frequente nella fabbricazione di celle sintetiche, la creazione di un sistema CFPS robusto e su misura per un'applicazione specifica rimane una sfida non banale. In questo articolo sui metodi, presentiamo un protocollo completo per il sistema CFPS, abitualmente impiegato nella costruzione di cellule sintetiche. Questo protocollo comprende le fasi chiave della preparazione del sistema CFPS, tra cui l'estratto cellulare, la preparazione del modello e l'ottimizzazione dell'espressione di routine utilizzando una proteina reporter fluorescente. Inoltre, mostriamo risultati rappresentativi incapsulando il sistema CFPS all'interno di vari micro-compartimenti, come goccioline monostrato, vescicole a doppia emulsione e camere situate sopra doppi strati lipidici supportati. Infine, chiariamo i passaggi critici e le condizioni necessarie per il corretto assemblaggio di questi sistemi CFPS in ambienti distinti. Ci aspettiamo che il nostro approccio faciliti la creazione di buone pratiche di lavoro tra i vari laboratori all'interno della comunità delle cellule sintetiche in continua espansione, accelerando così i progressi nel campo dello sviluppo delle cellule sintetiche.

Introduzione

La sintesi di cellule sintetiche o artificiali è emersa come un campo di ricerca interdisciplinare molto importante, attirando un notevole interesse da parte di scienziati nei settori della biologia sintetica, della chimica e della biofisica. Questi scienziati sono uniti dall'obiettivo comune di costruire una cellula vivente minima ^1,2,3. La rapida crescita di questo campo è andata di pari passo con i progressi significativi nelle tecnologie critiche, come la manipolazione del DNA ricombinante⁴, i materiali biomimetici⁵ e le tecniche di microfabbricazione per la compartimentazione⁶, incluso il metodo di sintesi proteica libera da cellule (CFPS)⁷. I sistemi CFPS comprendono il macchinario cellulare essenziale per la trascrizione e la traduzione, fornendo il quadro di base per lo sviluppo e l'integrazione di cellule artificiali multifunzionali.

Sebbene le tecniche CFPS siano spesso utilizzate nell'assemblaggio di celle sintetiche, lo sviluppo di un sistema CFPS robusto e su misura per l'assemblaggio di vari sistemi di celle sintetiche rimane una sfida complessa. Attualmente, sono disponibili numerosi sistemi CFPS, derivati sia da organismi modello di procarioti che di eucarioti⁸, ciascuno specializzato per particolari applicazioni nella sintesi cellulare sintetica. Oltre al loro ruolo centrale nella trascrizione e nella traduzione, i sistemi CFPS variano nei loro componenti principali e nelle procedure di preparazione associate. Queste variazioni, che includono differenze negli estratti cellulari, nelle RNA polimerasi, nei metodi di preparazione dei modelli e nelle composizioni dei tamponi, sono in gran parte dovute alle distinte traiettorie di sviluppo perseguite dai gruppi di ricerca che hanno ottimizzato intensamente i loro sistemi per la massima resa proteica.

Tra i vari componenti del sistema CFPS, l'estratto cellulare è un pool enzimatico critico per la trascrizione e la traduzione, e quindi un determinante chiave delle prestazioni della CFPS⁹. La CFPS a base di Escherichia coli (E. coli) è il sistema più comunemente utilizzato grazie al suo status di organismo procariotico meglio conosciuto. Inoltre, il gruppo di ricerca di Ueda ha sviluppato un sistema CFPS completamente ricostituito che comprende proteine e ribosomi purificati individualmente, noto come PURE¹⁰, particolarmente adatto per applicazioni che richiedono un background chiaro. Oggi, anche i sistemi CFPS basati su E. coli si sono diversificati, soprattutto in termini di ceppi sorgente per l'extrac¹¹ e i metodi di preparazione^12,13, RNA polimerasi^14,15, fonti di energia^16,17 e sistemi tampone^18,19. I ceppi più frequentemente utilizzati includono i derivati dei ceppi K12 e B, come A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² e Rossetta2²³, insieme alle loro controparti geneticamente modificate.

Inizialmente, sono stati scelti ceppi di E. coli con ridotte attività di RNasi e proteasi per migliorare la stabilità dell'mRNA e la stabilità delle proteine ricombinanti di nuova sintesi, portando a un aumento delle rese proteiche finali²⁴. Successivamente, gli estratti di E. coli sono stati ingegnerizzati per facilitare specifiche modifiche post-traduzionali, tra cui la glicosilazione²⁵, la fosforilazione²⁶ e la lipidazione²⁷, sono stati sviluppati per ottenere le modifiche post-traduzionali di cui sopra. Inoltre, è stata incorporata una serie di additivi come chaperon molecolari²⁸ e stabilizzanti chimici per aiutare il ripiegamento delle proteine bersaglio, contribuendo alla diversificazione dei sistemi CFPS. La batteriofago T7 RNA polimerasi, nota per la sua elevata processività, è prevalentemente impiegata per la trascrizione, sebbene siano state utilizzate anche altre polimerasi come SP6²⁹. L'RNA polimerasi endogena di E. coli è stata adattata per la prototipazione di circuiti genetici sfruttando i fattori sigma³⁰. Infine, una varietà di precursori energetici 31,32,33 e diversi sali e componenti tampone 19,34,35 sono stati sistematicamente ottimizzati per migliorare la produttività.

Oltre al sistema CFPS stesso, anche i metodi di incapsulamento e i materiali di compartimentazione sono vitali per il successo dell'assemblaggio di celle sintetiche. Vari sistemi che sono stati sviluppati per incapsulare con successo la reazione CFPS includono goccioline di acqua/olio stabilizzate con tensioattivo, lipidi/polimero e le loro vescicole unilamellari ibride (con diametri che vanno da 50 nm a diversi μm), nonché doppi strati lipidici supportati da planari. Tuttavia, a causa del contenuto di molecole complessate del sistema CFPS, il tasso di successo dell'incapsulamento dipende da casi specifici, in particolare per la formazione di vescicole. Per migliorare il tasso di successo e l'efficienza dell'incapsulamento della CFPS, sono stati sviluppati vari chip di microfluidi per facilitare la formazione di goccioline e vescicole³⁶. Tuttavia, sarà necessario stabilire chip e dispositivi aggiuntivi.

Questo protocollo delinea un sistema CFPS di E. coli che utilizza il ceppo BL21(DE3), che è un ospite comunemente impiegato per la produzione di proteine ricombinanti. Il protocollo comprende un resoconto dettagliato della preparazione dell'estratto cellulare, della preparazione del modello e dell'ottimizzazione dell'espressione standard utilizzando una proteina reporter fluorescente. Inoltre, presentiamo risultati esemplari ottenuti incapsulando il sistema CFPS all'interno di diversi micro-compartimenti, tra cui goccioline monostrato, vescicole a doppia emulsione e camere situate sopra doppi strati lipidici supportati. Infine, vengono illustrati gli elementi procedurali fondamentali e le condizioni necessarie per il successo dell'istituzione di questi sistemi di PCPS in contesti ambientali distinti.

Protocollo

1. Preparazione dell'estratto

1. Strisciare il ceppo di E. coli BL21 (DE3) da uno stock di glicerolo su una piastra di agar Luria Bertani (LB) e incubare per almeno 15 ore a 37 °C.
2. Preparare una precoltura notturna inoculando una singola colonia dalla piastra LB appena preparata in un pallone da 50 ml di terreno Luria Bertani (LB).
3. Inoculare 5 mL di precoltura in 500 mL di terreno 2xYTPG in un pallone di Erlenmeyer da 3 L sconcertato. Coltivatela a 37 °C agitandola vigorosamente (tra 220 giri/min e 250 giri/min) e raccogliete le cellule quando raggiungono la fase di metà log (OD₆₀₀ ~ 3). Quindi, immergere le colture cellulari in acqua fredda e ghiacciata per 10 minuti e centrifugare a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
   NOTA: In questa fase, il glucosio nel terreno 2xYTPG può essere omesso per applicazioni specifiche ^9,12.
4. Risospendere i pellet di cellule risultanti in 35 mL di tampone S30 A preraffreddato, quindi centrifugare a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
5. Ripetere il passaggio 1.4 due volte.
   NOTA: I pellet della cella possono essere conservati a -80 °C se non vengono utilizzati immediatamente.
6. Risospendere i pellet finali nel tampone S30 B (ad esempio, utilizzare 1,1 mL di tampone S30 B per 1 g di pellet cellulare) e disgregare le celle con un passaggio attraverso la French Press a 17.000 psi.
   1. Per l'utilizzo della French Press, seguire il manuale dell'utente e trasferire la sospensione della cella nella camera di disgregazione metallica della French Press, assicurandosi che tutti i componenti siano assemblati e che la valvola inferiore della camera di disgregazione sia chiusa.
   2. Trasferire la camera di disgregazione assemblata sulla piattaforma idraulica e fissare il blocco di sicurezza.
   3. Accendere la pompa idraulica e avviare l'interruzione.
   4. Controllare la valvola di uscita per consentire alla sospensione cellulare di defluire dal tubo di uscita in una nuova provetta da 50 mL. Regola la velocità del flusso per garantire un'interruzione efficiente, idealmente una goccia alla volta. Mantenere la pressione al di sopra del limite inferiore di 15.000 psi.
7. Centrifugare il lisato risultante a 30.000 × g per 30 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Ripetere la centrifugazione una volta e raccogliere il surnatante. Aggiungere 0,3 volumi di tampone di preincubazione nel surnatante raccolto e incubare agitando delicatamente a 37 °C per 80 minuti.
   NOTA: L'uso del tampone di preincubazione potrebbe aumentare la resa finale, anche se è stato riportato che un run-off vuoto (senza tampone di preincubazione) potrebbe anche migliorare l'efficienza^37,38, che dipende dal ceppo sorgente corrispondente.
8. Dializzare la miscela di deflusso risultante per 2 ore contro 2 L di tampone S30 C, sostituire una volta il tampone di dialisi con 2 L di tampone S30 C fresco e dializzare per una notte a 4 °C³⁹.
   NOTA: La seconda fase della dialisi notturna può essere ridotta a circa 3 ore.
9. Raccogliere il campione dializzato e centrifugare a 30.000 × g per 30 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante e l'aliquota in volumi appropriati e congelare immediatamente in azoto liquido.
   NOTA: Il campione congelato può essere conservato a -80 °C almeno per 6 mesi o 1 anno senza perdita di efficienza.

2. RNA polimerasi T7

1. Trasformare il plasmide pAR1219 in cellule competenti di E. coli stella BL21(DE3)⁴⁰.
2. Inoculare 10 ml di una coltura notturna in 1 litro di terreno LB (contenente 100 μg/mL di ampicillina). Far crescere le cellule a 37 °C fino a quando OD₆₀₀ raggiunge 0,6-0,8.
3. Iniziare l'induzione aggiungendo una concentrazione finale di 1 mM IPTG. Indurre le celle per altre 5 ore e raccogliere per centrifugazione a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Conservare i pellet di celle a -80 °C per un massimo di diverse settimane.
4. Risospendere i pellet cellulari in 30 mL di tampone T7 A e disgregare le cellule con un passaggio attraverso la French Press a 15.000 psi. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
5. Aggiungere streptomicina solfato goccia a goccia al surnatante del passaggio precedente, raggiungendo una concentrazione finale del 4% (p/v). Dopo una breve incubazione su ghiaccio, centrifugare a 20.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
6. Filtrare il surnatante attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm e caricare il campione filtrato su una colonna a scambio anionico forte (volume della colonna di 40 mL), che è stata prebilanciata con 10 volumi di colonna del tampone T7 B, tramite un sistema cromatografo liquido automatizzato.
7. Lavare la colonna caricata con 50 volumi di tampone T7 B ed eluire il campione con 10 volumi di colonne di miscele di tampone C T7 a basso contenuto di sale (50 mM NaCl) e ad alto contenuto di sale (500 mM), stabilendo un gradiente di concentrazione lineare di NaCl da 50 a 500 mM a una velocità di flusso di ~3 mL/min⁴¹.
8. Raccogli le frazioni di picco e analizzale con SDS-PAGE.
   NOTA: La polimerasi T7 mostra una banda predominante a ~100 kDa, mentre quantità significative di impurità appaiono ancora sul gel SDS-PAGE.
9. Raggruppare le frazioni contenenti T7 polimerasi e dializzare contro 2 L di tampone T7 C durante la notte.
10. Aggiungere glicerolo per raggiungere una concentrazione finale del 10% e concentrare la miscela risultante fino a una concentrazione finale di 3-4 mg/mL mediante ultrafiltrazione⁴².
    NOTA: Se durante il processo di concentrazione compaiono precipitazioni, arrestare immediatamente e rimuovere i precipitati mediante centrifugazione.
11. Regolare la concentrazione di glicerolo al 50%. Aliquotare e congelare il campione con azoto liquido. Conservare a −80 °C per un periodo più lungo.
    NOTA: Una piccola aliquota può anche essere conservata a -20 °C per almeno 1 mese senza perdita di efficienza.

3. Preparazione del tampone

1. Preparare i tamponi come indicato nella Tabella 1 un giorno prima dell'uso.

4. Progettazione e preparazione del modello

1. Clonare il gene di interesse in un vettore basato sul promotore T7 o generare un prodotto di PCR lineare contenente il gene di interesse.
   NOTA: Vedere la sezione di discussione per i principi di progettazione.
2. Preparare il plasmide da una coltura notturna utilizzando un kit di estrazione del plasmide.
   NOTA: Si consiglia di selezionare un kit plasmidico che includa una fase di precipitazione dell'isopropanolo seguita da una procedura di lavaggio con etanolo al 70%.
3. Sciogliere il DNA essiccato in un piccolo volume di acqua ultrapura a una concentrazione compresa tra 200 μg/mL e 500 μg/mL, come determinato da uno spettrofotometro a micro volume.
4. Opzionale: Esprimere direttamente le proteine dai prodotti di PCR lineare.
   NOTA: In questo caso, è necessaria una fase di purificazione PCR.

5. Ottimizzazione di Mg²⁺ e K⁺

1. Preparare una miscela master per lo screening della concentrazione di Mg²⁺ come indicato nella tabella 2 o per lo screening della concentrazione di K⁺ come indicato nella tabella 3.
2. Trasferire la miscela master in provette per microfusibili individuali o in una piastra a 96 pozzetti a forma di V.
3. Pipettare il volume esatto delle soluzioni madre di Mg²⁺ o K⁺ in provette per microfusi individuali o nella piastra a 96 pozzetti a forma di V e completare le reazioni CFPS con acqua ultrapura. Incubare le reazioni per almeno 2 ore.
   NOTA: Se si utilizza una piastra a 96 pozzetti a forma di V, sigillare la piastra con un coperchio di plastica per evitare l'evaporazione.
4. Prelevare 2 μl della miscela di reazione e trasferirla in una piastra nera a 96 pozzetti per le misure di fluorescenza con un lettore di piastre.
   NOTA: Utilizziamo un lettore di piastre fluorescenti con la seguente configurazione: eccitazione/emissione: 485/528, guadagno: 50, altezza di lettura: 7,00 mm. Tuttavia, è necessario regolare il lettore di piastre per generare una curva di calibrazione specifica utilizzando proteine fluorescenti purificate.

6. Incapsulamento

1. Gocciolina
   1. Preparare un olio fluorurato contenente tensioattivo (2% PFPE-PEG in HFE7500) o una soluzione di olio lipidico-minerale sciogliendo il lipide in olio minerale (fare riferimento al passaggio 6.2.1)
   2. Preparare un volume totale di 100 μl di reazione CFPS combinando i corrispondenti reagenti 2-18 della Tabella 4. Aggiungere la reazione CFPS a 500 μl di olio precedentemente preparato in una provetta da 1,5 mL, quindi strofinare energicamente la provetta sulla rastrelliera per provette 50 volte per formare goccioline fini (acqua nell'olio). Incubare la provetta a 30 °C per eseguire la reazione.
      NOTA: Semplici chip microfluidici potrebbero anche essere utilizzati per generare goccioline omogenee⁴³.
2. Vescicole unilamellari giganti (GUV)
   1. Preparazione della soluzione di olio lipidico-minerale
      1. Aggiungere 57 μL di cloroformio in un flaconcino di vetro da 4 mL e quindi aggiungere 18 μL di lipidi 25 mg/mL di 1-palmitoil-2-oleoil-glicerolo-3-fosfocolina (POPC) per formare la soluzione lipidica di cloroformio, raggiungendo una concentrazione finale di 8 mM (utilizzare altri lipidi con concentrazioni finali simili).
         NOTA: Questa fase di miscelazione ha lo scopo di garantire una miscelazione omogenea di diversi lipidi.
      2. Far evaporare il cloroformio sotto un flusso di argon per 15 minuti, quindi evaporare ulteriormente sotto vuoto per 1 ora.
      3. Sciogliere i lipidi secchi risultanti in 1.500 μL di olio minerale, raggiungendo una concentrazione finale di 400 μM. Incubare la miscela per una notte a temperatura ambiente.
   2. Formazione di uno strato lipidico interfacciale
      1. Aggiungere 500 μl della soluzione esterna (vedere Tabella 5) in una provetta da 1,5 mL e sovrapporre lentamente 250 μl di soluzione di olio lipidico-minerale sopra la soluzione esterna. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per formare uno strato lipidico interfacciale stabile.
   3. Preparazione della soluzione interna
      1. Mescolare tutti i reagenti della Tabella 6 per formare la soluzione interna e tenerla in ghiaccio fino all'uso. Completare la soluzione interna aggiungendo T7RNAP, estratto S30 e stampo di DNA nella soluzione preinterna come reagenti 16-18 elencati nella Tabella 4.
         NOTA: L'aumento della concentrazione di saccarosio incapsulato al di sopra di 250 mM potrebbe inibire la traduzione senza cellule⁴⁴.
   4. Formazione di GUV
      1. Aggiungere 50 μl di soluzione interna a una nuova provetta da 1,5 mL contenente 500 μl di olio lipidico-minerale, pipettare rapidamente su e giù e agitare energicamente.
      2. Lasciare la provetta in ghiaccio per 10 minuti e aggiungere lentamente 20 μl della miscela di emulsione alla parte superiore della fase oleosa nella provetta da 1,5 mL del passaggio 6.2.2.
      3. Centrifugare a 800 × g (utilizzare una velocità di centrifugazione compresa tra 100 × g e 1000 × g) per 10 minuti a 4 °C e osservare la formazione di GUV sul fondo della provetta.
         NOTA: Potrebbe essere utilizzata una velocità di centrifugazione specifica più elevata; tuttavia, si potrebbe considerare che la velocità di centrifugazione potrebbe influenzare la dimensione dei GUV formati⁴⁵.
      4. Rimuovere la fase superiore dell'olio.
      5. Aspirare con cura 30 μl di GUV sul fondo della provetta. Incubare i GUV raccolti a 30 °C.
         NOTA: La temperatura di incubazione ottimale varia a seconda delle proteine.
      6. Utilizzare la microscopia confocale a scansione laser (LSM) per monitorare l'espressione delle proteine fluorescenti.
3. Doppio strato lipidico supportato (SLB)
   1. Preparazione delle camere SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 vetrini coprioggetti aggiungendo sette gocce di acido solforico e due gocce di perossido di idrogeno al 50% al centro di ciascun vetrino di copertura. Incubare i reagenti sui vetrini coprioggetti per almeno 45 minuti; Sciacquare abbondantemente con acqua ultrapura.
      2. Assemblare la camera di ricostituzione applicando una provetta per microfuge da 0,5 mL sui vetrini coprioggetti puliti utilizzando colla ottica polimerizzata sotto una lampada a raggi ultravioletti (365 nm) per 10 minuti per formare una camera di reazione.
   2. Formazione di SLB
      1. Sciogliere l'80 mol% di 1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina (DOPC), il 19,95 mol% di 1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfo-L-serina (DOPS) e lo 0,05 mol% di Atto488-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina = DOPE), mescolare in cloroformio, asciugare con un flusso di azoto delicato e aspirare per 1 ora per rimuovere completamente il solvente.
      2. Reidratare il film lipidico essiccato nel tampone SLB A, ottenendo una concentrazione lipidica finale di 4 mg/mL.
      3. Vorticare e sonicare i campioni risultanti fino a quando non diventano chiari.
      4. Diluire 4 mg/mL di SUV con 130 μL di tampone SLB A, trasferire 75 μL della sospensione nelle camere di reazione preformate e incubarla su un blocco termico a 37 °C per 1 minuto. Aggiungere 150 μl di tampone SLB A alla camera di reazione per un'ulteriore incubazione per 2 minuti.
      5. Lavare la camera con 2 mL di tampone SLB B (tampone SLB A senza MgCl₂) prima di sostituire il tampone S30 C con BSA allo 0,4% (p/v) per le reazioni CFPS, lasciando 100 μL di tampone all'interno della camera per evitare che l'SLB formato si secchi.
      6. Rimuovere il tampone S30 C residuo e aggiungere con cautela la miscela di reazione CFPS nella camera SLB. Incubare la camera a 30 °C e monitorare l'espressione al microscopio confocale a scansione laser.

Risultati

Per ogni nuovo lotto di estratto cellulare e di RNA polimerasi T7, si raccomanda di eseguire uno screening di base delle concentrazioni di Mg²⁺ e K⁺ per garantire le prestazioni ottimali del sistema CFPS. La fluorescenza della supercartella GFP può fungere da indicatore della resa complessiva del sistema CFPS in condizioni variabili, come illustrato nella Figura 1A, B. Inoltre, nella Figura 1C

Discussione

Questo manoscritto delinea un sistema di sintesi proteica libera da cellule (CFPS) modificato progettato per l'uso in vari micro-compartimenti attraverso piattaforme cellulari sintetiche, tra cui goccioline di acqua in olio, GUV e SLB. Abbiamo utilizzato il ceppo ospite standard di espressione proteica ricombinante di E. coli, BL21(DE3), come estratto di origine per la costruzione di sistemi cellulari sintetici incentrati sulle proteine. Questo approccio ha prodotto circa 0,5 mg...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203