Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

Resumo

Este protocolo descreve o sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) usado na construção de células sintéticas. Ele descreve os principais estágios com resultados representativos em diferentes microcompartimentos. O protocolo visa estabelecer as melhores práticas para diversos laboratórios na comunidade de células sintéticas, promovendo o progresso no desenvolvimento de células sintéticas.

Resumo

O sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) tem sido amplamente empregado para facilitar a montagem de baixo para cima de células sintéticas. Ele serve como hospedeiro para o maquinário central do Dogma Central, permanecendo como um chassi ideal para a integração e montagem de diversos sistemas artificiais de mimetismo celular. Apesar de seu uso frequente na fabricação de células sintéticas, estabelecer um sistema CFPS personalizado e robusto para uma aplicação específica continua sendo um desafio não trivial. Neste artigo de métodos, apresentamos um protocolo abrangente para o sistema CFPS, rotineiramente empregado na construção de células sintéticas. Este protocolo engloba os principais estágios na preparação do sistema CFPS, incluindo o extrato celular, a preparação do molde e a otimização da expressão de rotina utilizando uma proteína repórter fluorescente. Além disso, mostramos resultados representativos encapsulando o sistema CFPS em vários microcompartimentos, como gotículas de monocamada, vesículas de emulsão dupla e câmaras situadas sobre bicamadas lipídicas suportadas. Por fim, elucidamos as etapas e condições críticas necessárias para a montagem bem-sucedida desses sistemas CFPS em ambientes distintos. Esperamos que nossa abordagem facilite o estabelecimento de boas práticas de trabalho entre vários laboratórios dentro da comunidade de células sintéticas em constante expansão, acelerando assim o progresso no campo do desenvolvimento de células sintéticas.

Introdução

A síntese de células sintéticas ou artificiais emergiu como um campo altamente proeminente de pesquisa interdisciplinar, atraindo interesse substancial de cientistas nos domínios da biologia sintética, química e biofísica. Esses cientistas estão unidos pelo objetivo comum de construir uma célula viva mínima ^1,2,3. O rápido crescimento deste campo tem estado em sintonia com avanços significativos em tecnologias críticas, como manipulação de DNA recombinante⁴, materiais biomiméticos⁵ e técnicas de microfabricação para compartimentalização⁶, incluindo o método Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)⁷. Os sistemas CFPS abrangem a maquinaria celular essencial para transcrição e tradução, fornecendo a estrutura fundamental para o desenvolvimento e integração de células artificiais multifuncionais.

Embora as técnicas de CFPS sejam frequentemente usadas na montagem de células sintéticas, o desenvolvimento de um sistema CFPS robusto e personalizado para a montagem de vários sistemas de células sintéticas continua sendo um desafio complexo. Atualmente, vários sistemas CFPS estão disponíveis, derivados de organismos modelo procariotos e eucariotos⁸, cada um especializado para aplicações específicas na síntese de células sintéticas. Além de seus papéis centrais na transcrição e tradução, os sistemas CFPS variam em seus principais componentes e procedimentos de preparação associados. Essas variações, que incluem diferenças em extratos celulares, RNA polimerases, métodos de preparação de moldes e composições de tampão, são em grande parte devidas às distintas trajetórias de desenvolvimento perseguidas por grupos de pesquisa que otimizaram intensamente seus sistemas para obter o máximo rendimento de proteínas.

Entre os vários componentes do sistema CFPS, o extrato celular é um pool enzimático crítico para transcrição e tradução e, portanto, um determinante chave do desempenho do CFPS⁹. A CFPS baseada em Escherichia coli (E. coli) é o sistema mais comumente utilizado devido ao seu status como o organismo procariótico mais bem compreendido. Além disso, um sistema CFPS totalmente reconstituído composto por proteínas e ribossomos purificados individualmente, conhecido como PURE¹⁰, foi desenvolvido pelo grupo de pesquisa de Ueda, que é particularmente adequado para aplicações que exigem um fundo claro. Hoje, até mesmo os sistemas CFPS baseados em E. coli se diversificaram, especialmente em termos de cepas de origem para o extrac¹¹ e métodos de preparação^12,13, RNA polimerase^14,15, fontes de energia^16,17 e sistemas tampão^18,19. As cepas mais usadas incluem derivados de cepas K12 e B, como A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² e Rossetta2²³, juntamente com suas contrapartes geneticamente modificadas.

Inicialmente, cepas de E. coli com atividades reduzidas de RNase e protease foram escolhidas para aumentar a estabilidade do mRNA e a estabilidade de proteínas recombinantes recém-sintetizadas, levando ao aumento da produção final de proteínas²⁴. Posteriormente, os extratos de E. coli foram projetados para facilitar modificações pós-traducionais específicas, incluindo glicosilação²⁵, fosforilação²⁶ e lipidação²⁷, foram desenvolvidos para alcançar as modificações pós-traducionais acima. Além disso, uma série de aditivos, como chaperons moleculares²⁸ e estabilizadores químicos, foram incorporados para auxiliar no dobramento de proteínas-alvo, contribuindo para a diversificação dos sistemas CFPS. A RNA polimerase do bacteriófago T7, conhecida por sua alta processividade, é predominantemente empregada para transcrição, embora outras polimerases como a SP6²⁹ também tenham sido utilizadas. A RNA polimerase endógena de E. coli foi adaptada para a prototipagem de circuitos genéticos alavancando fatores sigma³⁰. Por fim, uma variedade de precursores de energia 31,32,33 e diferentes sais e componentes tampão 19,34,35 foram sistematicamente otimizados para aumentar a produtividade.

Além do próprio sistema CFPS, os métodos de encapsulamento, bem como os materiais de compartimentalização, também são vitais para a montagem bem-sucedida de células sintéticas. Vários sistemas que foram desenvolvidos para encapsular com sucesso a reação CFPS incluem gotículas de água/óleo estabilizadas com surfactante, lipídios/polímeros e suas vesículas unilamelares híbridas (com diâmetros variando de 50 nm a vários μm), bem como bicamadas lipídicas suportadas por planos. No entanto, devido ao conteúdo de moléculas complexadas do sistema CFPS, a taxa de sucesso do encapsulamento depende de casos específicos, particularmente para a formação de vesículas. Para melhorar a taxa de sucesso e a eficiência do encapsulamento da CFPS, vários chips de microfluidos foram desenvolvidos para facilitar a formação de gotículas e vesículas³⁶. No entanto, chips e dispositivos adicionais precisarão ser estabelecidos.

Este protocolo delineia um sistema CFPS de E. coli utilizando a cepa BL21 (DE3), que é um hospedeiro comumente empregado para a produção de proteínas recombinantes. O protocolo abrange um relato detalhado da preparação do extrato celular, preparação do molde e otimização da expressão padrão usando uma proteína repórter fluorescente. Além disso, apresentamos resultados exemplares alcançados encapsulando o sistema CFPS em diversos microcompartimentos, incluindo gotículas de monocamada, vesículas de emulsão dupla e câmaras situadas sobre bicamadas lipídicas suportadas. Por fim, expomos os elementos processuais fundamentais e as condições necessárias indispensáveis para o estabelecimento bem-sucedido desses sistemas de CFPS em contextos ambientais distintos.

Protocolo

1. Preparação do extrato

1. Risque a cepa de E. coli BL21 (DE3) de um estoque de glicerol em uma placa de ágar Luria Bertani (LB) e incube por pelo menos 15 h a 37 ° C.
2. Preparar uma pré-cultura durante a noite inoculando uma única colónia da placa LB recentemente preparada para um balão de 50 ml de meio Luria Bertani (LB).
3. Inocular 5 ml de pré-cultura em 500 ml de meio 2xYTPG num Erlenmeyer de 3 L defletido. Cultive-o a 37 °C com agitação vigorosa (entre 220 rpm e 250 rpm) e colha as células quando atingirem a fase intermediária (OD₆₀₀ ~ 3). Em seguida, coloque as culturas de células em água gelada fria por 10 min e centrifugue a 8.000 × g por 15 min a 4 ° C.
   NOTA: Nesta etapa, a glicose no meio 2xYTPG pode ser omitida para aplicações específicas ^9,12.
4. Ressuspenda os grânulos de células resultantes em 35 mL de tampão S30 A pré-resfriado, seguido de centrifugação a 8.000 × g por 15 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante.
5. Repita a etapa 1.4 duas vezes.
   NOTA: Os pellets de células podem ser armazenados a -80 °C se não forem usados imediatamente.
6. Ressuspenda os pellets finais no tampão S30 B (por exemplo, use 1,1 mL de tampão S30 B por 1 g de pellet celular) e interrompa as células em uma passagem pela prensa francesa a 17.000 psi.
   1. Para usar a prensa francesa, siga o manual do usuário e transfira a suspensão da célula para a câmara de ruptura de metal da prensa francesa, garantindo que todos os componentes estejam montados e a válvula inferior da câmara de ruptura esteja fechada.
   2. Transfira a câmara de disrupção montada para a plataforma hidráulica e prenda a trava de segurança.
   3. Ligue a bomba hidráulica e inicie a interrupção.
   4. Controle a válvula de saída para permitir que a suspensão da célula flua para fora do tubo de saída para um novo tubo de 50 mL. Ajuste a velocidade do fluxo para garantir uma interrupção eficiente, idealmente uma gota de cada vez. Mantenha a pressão acima do limite inferior de 15.000 psi.
7. Centrifugar o lisado resultante a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Repita a centrifugação uma vez e colete o sobrenadante. Adicione 0,3 volume de tampão de pré-incubação ao sobrenadante coletado e incube com agitação suave a 37 ° C por 80 min.
   NOTA: O uso de tampão de pré-incubação pode aumentar o rendimento final, embora tenha sido relatado que um escoamento vazio (sem tampão de pré-incubação) também pode melhorar a eficiência^37,38, que depende da cepa de origem correspondente.
8. Dialisar a mistura de escoamento resultante durante 2 h contra 2 L de tampão S30 C, trocar o tampão de diálise uma vez por 2 L de tampão S30 C fresco e dialisar durante a noite a 4 °C³⁹.
   NOTA: A segunda etapa da diálise noturna pode ser encurtada para aproximadamente 3 h.
9. Colete a amostra dialisada e centrifugue a 30.000 × g por 30 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante e a alíquota em volumes adequados e congelar imediatamente em azoto líquido.
   NOTA: A amostra congelada pode ser armazenada a -80 °C pelo menos por 6 meses a 1 ano sem perda de eficiência.

2. RNA polimerase T7

1. Transforme o plasmídeo pAR1219 em células competentes em estrela BL21 (DE3) de E. coli ⁴⁰.
2. Inocular 10 ml de uma cultura durante a noite em 1 l de LB de meio (contendo 100 μg/ml de ampicilina). Cultive as células a 37 ° C até que OD₆₀₀ atinja 0,6-0,8.
3. Inicie a indução adicionando uma concentração final de 1 mM IPTG. Induzir as células por mais 5 h e colher por centrifugação a 8.000 × g por 15 min a 4 °C. Armazene os pellets celulares a -80 °C por várias semanas.
4. Ressuspenda os grânulos celulares em 30 mL de tampão T7 A e interrompa as células em uma passagem pela prensa francesa a 15.000 psi. Remover os restos celulares por centrifugação a 20.000 × g durante 30 min a 4 °C.
5. Adicionar sulfato de estreptomicina gota a gota ao sobrenadante da etapa anterior, atingindo uma concentração final de 4% (p/v). Após uma curta incubação no gelo, centrifugue a 20.000 × g por 30 min a 4 °C.
6. Filtre o sobrenadante através de uma membrana de filtro de 0,45 μm e carregue a amostra filtrada em uma coluna de troca aniônica forte (volume de coluna de 40 mL), que foi pré-equilibrada com 10 volumes de coluna de tampão T7 B, por meio de um sistema automatizado de cromatografia líquida.
7. Lave a coluna carregada com 50 volumes de coluna de tampão T7 B e elua a amostra com 10 volumes de coluna de misturas de tampão C T7 com baixo teor de sal (50 mM) e alto teor de sal (500 mM), estabelecendo um gradiente de concentração linear de NaCl de 50 a 500 mM a uma taxa de fluxo de ~ 3 mL / min⁴¹.
8. Colete as frações de pico e analise por SDS-PAGE.
   NOTA: A polimerase T7 exibe uma banda predominante em ~ 100 kDa, enquanto quantidades significativas de impurezas ainda aparecem no gel SDS-PAGE.
9. Agrupar as fracções que contêm T7 polimerase e dialisar contra 2 L de tampão C T7 durante a noite.
10. Adicione glicerol para atingir uma concentração final de 10% e concentre a mistura resultante em uma concentração final de 3-4 mg / mL por ultrafiltração⁴².
    NOTA: Se aparecer precipitação durante o processo de concentração, pare imediatamente e remova os precipitados por centrifugação.
11. Ajuste a concentração de glicerol para 50%. Alíquota e congelamento rápido da amostra com nitrogênio líquido. Conservar a -80 °C durante um período mais longo.
    NOTA: Uma pequena alíquota também pode ser armazenada a -20 °C por pelo menos 1 mês sem perda de eficiência.

3. Preparação do tampão

1. Prepare os tampões conforme indicado na Tabela 1 um dia antes do uso.

4. Design e preparação do modelo

1. Clone o gene de interesse em um vetor baseado em promotor T7 ou gere um produto de PCR linear contendo o gene de interesse.
   NOTA: Consulte a seção de discussão para obter os princípios de design.
2. Preparar o plasmídeo a partir de uma cultura durante a noite utilizando um kit de extracção de plasmídeos.
   NOTA: Recomendamos selecionar um kit de plasmídeo que inclua uma etapa de precipitação de isopropanol seguida de um procedimento de lavagem com etanol a 70%.
3. Dissolver o ADN seco num pequeno volume de água ultrapura até atingir uma concentração compreendida entre 200 μg/ml e 500 μg/ml, determinada por um espectrofotómetro de micro volume.
4. Opcional: Expresse proteínas diretamente de produtos de PCR linear.
   NOTA: Neste caso, é necessária uma etapa de purificação por PCR.

5. Otimização de Mg²⁺ e K⁺

1. Preparar uma mistura principal para o rastreio da concentração de Mg²⁺ , conforme indicado no quadro 2, ou para o rastreio da concentração de K⁺ , conforme indicado no quadro 3.
2. Transfira a mistura principal para tubos de microcentrífugas individuais ou uma placa de 96 poços em forma de V.
3. Pipetar o volume exato de soluções estoque de Mg²⁺ ou K⁺ em tubos de microcentrífugas individuais ou na placa de 96 poços em forma de V e completar as reações de CFPS com água ultrapura. Incubar as reações durante pelo menos 2 h.
   NOTA: Se estiver usando uma placa de 96 poços em forma de V, sele a placa com uma tampa de plástico para evitar a evaporação.
4. Retire 2 μL da mistura de reação e transfira para uma placa preta de 96 poços para medições de fluorescência por um leitor de placas.
   NOTA: Usamos um leitor de placa fluorescente com a seguinte configuração: excitação/emissão: 485/528, Ganho: 50, Altura de leitura: 7.00 mm. No entanto, seria necessário ajustar seu leitor de placas para gerar uma curva de calibração específica usando proteínas fluorescentes purificadas.

6. Encapsulamento

1. Gotícula
   1. Prepare um óleo fluorado contendo surfactante (2% PFPE-PEG em HFE7500) ou uma solução de óleo lipídico-mineral dissolvendo o lipídio em óleo mineral (consulte a etapa 6.2.1)
   2. Preparar um volume total de 100 μL de reação CFPS combinando os reagentes correspondentes 2-18 da Tabela 4. Adicione a reação CFPS a 500 μL do óleo previamente preparado em um tubo de 1,5 mL e, em seguida, esfregue o tubo vigorosamente no rack de tubos 50x para formar gotículas finas (água em óleo). Incubar o tubo a 30 °C para realizar a reação.
      NOTA: Chips microfluídicos simples também podem ser usados para gerar gotículas homogêneas⁴³.
2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs)
   1. Preparando a solução de óleo lipídico-mineral
      1. Adicione 57 μL de clorofórmio em um frasco de vidro de 4 mL e, em seguida, adicione 18 μL de lipídios de 1-palmitoil-2-oleoil-glicerol-3-fosfocolina (POPC) a 25 mg / mL para formar a solução lipídica de clorofórmio, atingindo uma concentração final de 8 mM (use outros lipídios com concentrações finais semelhantes).
         NOTA: Esta etapa de mistura foi para garantir uma mistura homogênea de diferentes lipídios.
      2. Evapore o clorofórmio sob um fluxo de argônio por 15 min e, em seguida, evapore ainda mais sob vácuo por 1 h.
      3. Dissolva os lipídios secos resultantes em 1.500 μL de óleo mineral, atingindo uma concentração final de 400 μM. Incube a mistura durante a noite em temperatura ambiente.
   2. Formando uma camada lipídica interfacial
      1. Adicione 500 μL da solução externa (ver Tabela 5) a um tubo de 1,5 mL e coloque lentamente 250 μL de solução de óleo lipídico-mineral sobre a solução externa. Incube em temperatura ambiente por 30 min para formar uma camada lipídica interfacial estável.
   3. Preparação da solução interna
      1. Misturar todos os reagentes do quadro 6 para formar a solução pré-interior e mantê-la congelada até à utilização. Complete a solução interna adicionando T7RNAP, extrato S30 e molde de DNA na solução pré-interna como reagentes 16-18 listados na Tabela 4.
         NOTA: Aumentar a concentração de sacarose encapsulada acima de 250 mM pode inibir a tradução livre de células⁴⁴.
   4. Formação de GUVs
      1. Adicione 50 μL de solução interna a um novo tubo de 1,5 mL contendo 500 μL de óleo lipídico-mineral, pipete para cima e para baixo rapidamente e vortex vigorosamente.
      2. Deixe o tubo no gelo por 10 min e adicione lentamente 20 μL da mistura de emulsão ao topo da fase oleosa no tubo de 1,5 mL da etapa 6.2.2.
      3. Centrifugue a 800 × g (use uma velocidade de centrifugação variando de 100 × g a 1000 × g) por 10 min a 4 °C e observe a formação de GUVs no fundo do tubo.
         NOTA: Uma velocidade de centrifugação específica mais alta pode ser usada; no entanto, pode-se considerar que a velocidade de centrifugação pode influenciar o tamanho dos GUVs formados⁴⁵.
      4. Remova a fase oleosa superior.
      5. Aspire 30 μL de GUVs no fundo do tubo com cuidado. Incubar os GUVs coletados a 30 °C.
         NOTA: A temperatura ideal de incubação varia para diferentes proteínas.
      6. Use a Microscopia Confocal de Varredura a Laser (LSM) para monitorar a expressão de proteínas fluorescentes.
3. Bicamada lipídica suportada (SLB)
   1. Preparação de câmaras SLB
      1. Limpe as lamínulas de 24 x 24 mm #1,5 da piranha adicionando sete gotas de ácido sulfúrico e duas gotas de peróxido de hidrogênio a 50% no centro de cada lâmina de cobertura. Incubar os reagentes nas lamínulas por pelo menos 45 min; Enxágue abundantemente com água ultrapura.
      2. Monte a câmara de reconstituição fixando um tubo de microcentrífugas de 0,5 ml nas lamínulas limpas com cola ótica curada sob uma lâmpada ultravioleta (365 nm) durante 10 min para formar uma câmara de reação.
   2. Formação de SLB
      1. Dissolver 80 mol% de 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC), 19,95% mol de 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfo-L-serina (DOPS) e 0,05% mol de Atto488-DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina = DOPE), misturar em clorofórmio, secar sob fluxo suave de nitrogênio e aspirar por 1 h para remover completamente o solvente.
      2. Reidrate o filme lipídico seco no tampão A do SLB, resultando em uma concentração lipídica final de 4 mg / mL.
      3. Vórtice e sonicar as amostras resultantes até que fiquem claras.
      4. Diluir 4 mg/ml de SUVs com 130 μL de tampão SLB A, transferir 75 μL da suspensão para as câmaras de reação pré-formadas e incubá-lo num bloco de calor a 37 °C durante 1 min. Adicione 150 μL de tampão SLB A à câmara de reação para posterior incubação por 2 min.
      5. Lave a câmara com 2 mL de tampão SLB B (tampão SLB A sem MgCl₂) antes de uma troca de tampão para o tampão S30 C com 0,4% (p / v) BSA para reações CFPS, deixando 100 μL de tampão dentro da câmara para evitar que o SLB formado seque.
      6. Remova o tampão S30 residual C e adicione a mistura de reação CFPS na câmara SLB com cuidado. Incubar a câmara a 30 °C e monitorizar a expressão num microscópio confocal de varrimento a laser.

Resultados

Para cada novo lote de extrato celular e RNA polimerase T7, recomenda-se realizar uma triagem básica das concentrações de Mg²⁺ e K⁺ para garantir o desempenho ideal do sistema CFPS. A fluorescência da superpasta GFP pode servir como um indicador do rendimento geral do sistema CFPS sob condições variadas, conforme ilustrado na Figura 1A, B. Além disso, uma comparação paralela do rendimento do sistema CFPS em dif...

Discussão

Este manuscrito descreve um sistema modificado de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) projetado para uso em vários microcompartimentos em plataformas de células sintéticas, incluindo gotículas de água em óleo, GUVs e SLBs. Utilizamos a cepa hospedeira de expressão de proteína recombinante padrão de E. coli, BL21 (DE3), como extrato fonte para a construção de sistemas de células sintéticas centradas em proteínas. Essa abordagem rendeu aproximadamente 0,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203