JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Özet

Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemi, sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya montajını kolaylaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Merkezi Dogma'nın çekirdek makineleri için ev sahibi olarak hizmet eder ve çeşitli yapay hücresel taklit sistemlerinin entegrasyonu ve montajı için en uygun şasi olarak durur. Sentetik hücrelerin imalatında sıklıkla kullanılmasına rağmen, belirli bir uygulama için özel ve sağlam bir CFPS sistemi kurmak önemsiz bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu yöntem belgesinde, sentetik hücrelerin yapımında rutin olarak kullanılan CFPS sistemi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, hücre ekstraktı, şablon hazırlama ve bir floresan raportör proteini kullanan rutin ekspresyon optimizasyonu dahil olmak üzere CFPS sisteminin hazırlanmasındaki temel aşamaları kapsar. Ek olarak, CFPS sistemini tek katmanlı damlacıklar, çift emülsiyonlu veziküller ve desteklenen lipid çift katmanlarının üzerine yerleştirilmiş odalar gibi çeşitli mikro bölmeler içinde kapsülleyerek temsili sonuçlar gösteriyoruz. Son olarak, bu CFPS sistemlerinin farklı ortamlarda başarılı bir şekilde monte edilmesi için gerekli kritik adımları ve koşulları açıklıyoruz. Yaklaşımımızın, sürekli genişleyen sentetik hücre topluluğu içindeki çeşitli laboratuvarlar arasında iyi çalışma uygulamalarının oluşturulmasını kolaylaştırmasını ve böylece sentetik hücre geliştirme alanındaki ilerlemeyi hızlandırmasını bekliyoruz.

Giriş

Sentetik veya yapay hücrelerin sentezi, sentetik biyoloji, kimya ve biyofizik alanlarındaki bilim adamlarından büyük ilgi çeken, disiplinler arası araştırmaların oldukça belirgin bir alanı olarak ortaya çıkmıştır. Bu bilim adamları, minimal bir canlı hücre 1,2,3 inşa etme ortak hedefiyle birleşiyorlar. Bu alanın hızlı büyümesi, rekombinant DNA manipülasyonu4, biyomimetik malzemeler5 ve Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) yöntemi 7 dahil olmak üzere bölümlendirme6 için mikrofabrikasyon teknikleri gibi kritik teknolojilerdeki önemli ilerlemelerle adım adım ilerlemiştir. CFPS sistemleri, çok işlevli yapay hücrelerin geliştirilmesi ve entegrasyonu için temel çerçeveyi sağlayarak, transkripsiyon ve translasyon için gerekli hücresel mekanizmayı kapsar.

CFPS teknikleri sentetik hücrelerin montajında sıklıkla kullanılsa da, çeşitli sentetik hücre sistemlerinin montajı için sağlam ve özel bir CFPS sistemi geliştirmek karmaşık bir zorluk olmaya devam etmektedir. Şu anda, hem prokaryotlardan hem de ökaryot model organizmalardantüretilen çok sayıda CFPS sistemi mevcuttur 8 ve her biri sentetik hücre sentezindeki belirli uygulamalar için uzmanlaşmıştır. Transkripsiyon ve translasyondaki merkezi rollerinin ötesinde, CFPS sistemleri ana bileşenlerinde ve ilgili hazırlık prosedürlerinde farklılık gösterir. Hücre ekstraktları, RNA polimerazları, şablon hazırlama yöntemleri ve tampon bileşimlerindeki farklılıkları içeren bu varyasyonlar, büyük ölçüde, sistemlerini maksimum protein verimi için yoğun bir şekilde optimize eden araştırma grupları tarafından izlenen farklı geliştirme yörüngelerinden kaynaklanmaktadır.

CFPS sisteminin çeşitli bileşenleri arasında, hücre ekstraktı, transkripsiyon ve translasyon için kritik bir enzimatik havuzdur ve bu nedenle CFPS performansının önemli bir belirleyicisidir9. Escherichia coli (E. coli) bazlı CFPS, en iyi anlaşılan prokaryotik organizma statüsü nedeniyle en yaygın kullanılan sistemdir. Ayrıca, Ueda'nın araştırma grubu tarafından PURE10 olarak bilinen, ayrı ayrı saflaştırılmış proteinler ve ribozomlardan oluşan, tamamen yeniden yapılandırılmış bir CFPS sistemi geliştirilmiştir ve bu, özellikle net bir arka plan gerektiren uygulamalar için uygundur. Günümüzde, E. coli bazlı CFPS sistemleri bile, özellikle ekstrac11 için kaynak suşları ve hazırlama yöntemleri 12,13, RNA polimeraz14,15, enerji kaynakları 16,17 ve tampon sistemleri 18,19 açısından çeşitlenmiştir. En sık kullanılan suşlar, genetiği değiştirilmiş muadillerinin yanı sıra A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 ve Rossetta223 gibi K12 ve B suş türevlerini içerir.

Başlangıçta, mRNA stabilitesini ve yeni sentezlenen rekombinant proteinlerin stabilitesini arttırmak için azaltılmış RNaz ve proteaz aktivitelerine sahip E. coli suşları seçildi ve bu da nihai protein verimlerinin artmasına yol açtı24. Daha sonra, E. coli ekstraktları, yukarıdaki posttranslasyon modifikasyonlarını elde etmek için glikosilasyon25, fosforilasyon26 ve lipidasyon27 dahil olmak üzere spesifik translasyon sonrası modifikasyonları kolaylaştırmak için tasarlandı. Ek olarak, hedef proteinlerin katlanmasına yardımcı olmak için moleküler şaperonlar28 ve kimyasal stabilizatörler gibi bir dizi katkı maddesi dahil edilmiştir ve CFPS sistemlerinin çeşitlendirilmesine katkıda bulunmuştur. Yüksek işlemselliği ile bilinen bakteriyofaj T7 RNA polimeraz, SP629 gibi diğer polimerazlar da kullanılmış olmasına rağmen, ağırlıklı olarak transkripsiyon için kullanılır. E. coli endojen RNA polimeraz, sigma faktörleri30'dan yararlanan genetik devrelerin prototiplenmesi için uyarlanmıştır. Son olarak, üretkenliği artırmak için çeşitli enerji öncüleri 31,32,33 ve farklı tuzlar ve tampon bileşenleri 19,34,35 sistematik olarak optimize edilmiştir.

CFPS sisteminin kendisinin yanı sıra, kapsülleme yöntemleri ve bölümlendirme malzemeleri de başarılı sentetik hücre montajı için hayati önem taşır. CFPS reaksiyonunu başarılı bir şekilde kapsüllemek için geliştirilen çeşitli sistemler arasında yüzey aktif madde ile stabilize edilmiş su/yağ damlacıkları, lipit/polimer ve bunların hibrit unilamellar vezikülleri (çapları 50 nm ila birkaç μm arasında değişen) ve ayrıca düzlemsel destekli lipid çift katmanları bulunur. Bununla birlikte, CFPS sisteminin kompleks molekül içeriği nedeniyle, kapsüllemenin başarı oranı, özellikle vezikül oluşumu için belirli durumlara bağlıdır. CFPS'nin kapsüllenmesinin başarı oranını ve verimliliğini artırmak için, hem damlacıkların hem de veziküllerin oluşumunu kolaylaştırmak için çeşitli mikroakışkan çipleri geliştirilmiştir36. Bununla birlikte, ek çipler ve cihazların kurulması gerekecektir.

Bu protokol, rekombinant protein üretimi için yaygın olarak kullanılan bir konakçı olan BL21 (DE3) suşunu kullanan bir E. coli CFPS sistemini tanımlar. Protokol, bir floresan raportör proteini kullanılarak hücre ekstraktı hazırlığı, şablon hazırlama ve standart ekspresyon optimizasyonunun ayrıntılı bir hesabını kapsar. Ayrıca, CFPS sistemini tek katmanlı damlacıklar, çift emülsiyon vezikülleri ve desteklenen lipid çift katmanlarının üzerine yerleştirilmiş odalar dahil olmak üzere çeşitli mikro bölmeler içinde kapsülleyerek elde edilen örnek sonuçlar sunuyoruz. Son olarak, bu CFPS sistemlerinin farklı çevresel bağlamlarda başarılı bir şekilde kurulması için vazgeçilmez olan önemli prosedür unsurlarını ve gerekli koşulları açıklıyoruz.

Protokol

1. Ekstrakt hazırlama

  1. E. coli BL21 (DE3) suşunu bir gliserol stoğundan bir Luria Bertani (LB) agar plakasına geçirin ve 37 ° C'de en az 15 saat inkübe edin.
  2. Taze hazırlanmış LB plakasından tek bir koloniyi 50 mL'lik bir Luria Bertani (LB) ortamı şişesine aşılayarak bir gece ön kültür hazırlayın.
  3. 3 L'lik şaşkın bir Erlenmeyer şişesinde 500 mL 2xYTPG ortamına 5 mL ön kültür aşılayın. 37 ° C'de kuvvetli çalkalama ile büyütün (220 rpm ile 250 rpm arasında) ve hücreleri orta log fazına ulaştıklarında hasat edin (OD600 ~ 3). Daha sonra hücre kültürlerini 10 dakika soğuk buzlu suya koyun ve 8.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Bu adımda, belirli uygulamalar için 2xYTPG ortamındaki glikozatlanabilir 9,12.
  4. Elde edilen hücre peletlerini 35 mL önceden soğutulmuş S30 tamponu A içinde yeniden süspanse edin, ardından 4 ° C'de 15 dakika boyunca 8.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  5. Adım 1.4'ü iki kez tekrarlayın.
    NOT: Hücre peletleri hemen kullanılmazsa -80 °C'de saklanabilir.
  6. S30 tampon B'deki son peletleri yeniden süspanse edin (örneğin, 1 g hücre peleti başına 1.1 mL S30 tampon B kullanın) ve hücreleri 17.000 psi'de French Press'ten bir geçişle parçalayın.
    1. French Press'i kullanmak için kullanım kılavuzunu takip edin ve hücre süspansiyonunu French press metal bozma odasına aktarın, tüm bileşenlerin monte edildiğinden ve bozulma odasının alt valfinin kapalı olduğundan emin olun.
    2. Monte edilmiş bozulma odasını hidrolik platforma aktarın ve güvenlik kilidini sabitleyin.
    3. Hidrolik pompayı açın ve bozulmayı başlatın.
    4. Hücre süspansiyonunun çıkış borusundan yeni bir 50 mL tüpe akmasını sağlamak için çıkış valfini kontrol edin. İdeal olarak her seferinde bir damla olmak üzere verimli bir kesinti sağlamak için akış hızını ayarlayın. Basıncı 15.000 psi alt sınırının üzerinde tutun.
  7. Elde edilen lizatı 30.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın. Santrifüjlemeyi bir kez tekrarlayın ve süpernatanı toplayın. Toplanan süpernatanıma 0.3 hacim ön inkübasyon tamponu ekleyin ve 37 ° C'de 80 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
    NOT: Ön inkübasyon tamponunun kullanılması nihai verimi artırabilir, ancak boş bir akışın (ön inkübasyon tamponu olmadan) ilgili kaynak suşuna bağlı olarak verimliliği37,38 de artırabileceği bildirilmiştir.
  8. Elde edilen akış karışımını 2 L S30 tamponu C'ye karşı 2 saat diyaliz edin, diyaliz tamponunu bir kez 2 L taze S30 tamponu C ile değiştirin ve gece boyunca 4 ° C'dediyalize edin 39.
    NOT: Gece diyalizinin ikinci adımı yaklaşık 3 saate kadar kısaltılabilir.
  9. Diyaliz numunesini toplayın ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 30.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatan ve alikotu uygun hacimlerde toplayın ve hemen sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.
    NOT: Dondurulmuş numune -80 °C'de en az 6 ay ila 1 yıl arasında verim kaybı olmadan saklanabilir.

2. T7 RNA polimeraz

  1. pAR1219 plazmitini BL21(DE3) yıldızına dönüştürün E. coli yetkin hücreler40.
  2. 10 mL gece boyunca kültürü 1 L LB ortamına (100 μg / mL ampisilin içeren) aşılayın. OD600 0.6-0.8'e ulaşana kadar hücreleri 37 ° C'de büyütün.
  3. 1 mM IPTG'lik bir son konsantrasyon ekleyerek indüksiyonu başlatın. Hücreleri 5 saat daha indükleyin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 8.000 × g'da santrifüjleme ile hasat edin. Hücre peletlerini -80 °C'de birkaç haftaya kadar saklayın.
  4. Hücre peletlerini 30 mL T7 tamponu A'da yeniden süspanse edin ve hücreleri 15.000 psi'de French Press'ten bir geçişle parçalayın. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 × g'da santrifüjleme ile hücre kalıntılarını çıkarın.
  5. Streptomisin sülfatı önceki adımdan süpernatanıma damla damla ekleyin ve% 4'lük (a / h) bir nihai konsantrasyona ulaşın. Buz üzerinde kısa bir inkübasyondan sonra, 20.000 × g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı 0.45 μm'lik bir filtre membranından süzün ve filtrelenmiş numuneyi, otomatik bir sıvı kromatograf sistemi aracılığıyla 10 kolon hacmi T7 tamponu B ile önceden dengelenmiş güçlü bir anyon değişim kolonuna (40 mL'lik kolon hacmi) yükleyin.
  7. Yüklenen kolonu 50 kolon hacmi T7 tamponu B ile yıkayın ve numuneyi 10 kolon hacmi düşük tuz (50 mM NaCl) ve yüksek tuz (500 mM) T7 tampon C karışımları ile elüte edin, ~3 mL/dak41 akış hızında 50 ila 500 mM arasında doğrusal bir NaCl konsantrasyon gradyanı oluşturun.
  8. Tepe kesirlerini toplayın ve SDS-PAGE ile analiz edin.
    NOT: T7 polimeraz, ~ 100 kDa'da baskın bir bant sergilerken, SDS-PAGE jeli üzerinde hala önemli miktarda safsızlık görülmektedir.
  9. T7 polimeraz içeren fraksiyonları bir araya getirin ve gece boyunca 2 L T7 tampon C'ye karşı diyalize edin.
  10. % 10'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için gliserol ekleyin ve elde edilen karışımı ultrafiltrasyon42 ile 3-4 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona konsantre edin.
    NOT: Konsantrasyon işlemi sırasında çökelme meydana gelirse, hemen durdurun ve çökeltileri santrifüjleme ile uzaklaştırın.
  11. Gliserol konsantrasyonunu% 50'ye ayarlayın. Aliquot ve flaş, numuneyi sıvı nitrojen ile dondurun. -80 °C'de daha uzun süre saklayın.
    NOT: Küçük bir alikot da -20 °C'de en az 1 ay boyunca verim kaybı olmadan saklanabilir.

3. Tampon hazırlama

  1. Tamponları kullanımdan bir gün önce Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlayın.

4. Şablon tasarımı ve hazırlanması

  1. İlgilenilen geni T7 promotör tabanlı bir vektöre klonlayın veya ilgilenilen geni içeren doğrusal bir PCR ürünü oluşturun.
    NOT: Tasarım ilkeleri için tartışma bölümüne bakın.
  2. Bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmidi bir gece kültüründen hazırlayın.
    NOT: Bir izopropanol çökeltme adımı ve ardından %70 etanol ile yıkama prosedürü içeren bir plazmit kiti seçmenizi öneririz.
  3. Kurutulmuş DNA'yı, bir mikro hacim spektrofotometresi ile belirlendiği gibi, 200 μg/mL ile 500 μg/mL arasında bir konsantrasyona kadar küçük bir hacimde ultra saf suda çözün.
  4. İsteğe bağlı: Doğrusal PCR ürünlerinden proteinleri doğrudan eksprese edin.
    NOT: Bu durumda, bir PCR saflaştırma adımına ihtiyaç vardır.

5. Mg2+ ve K + optimizasyonu

  1. Tablo 2'de belirtildiği gibi Mg 2 + konsantrasyon taraması için veya Tablo 3'te belirtildiği gibi K + konsantrasyon taraması için bir ana karışım hazırlayın.
  2. Ana karışımı ayrı mikrofüj tüplerine veya V şeklinde 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
  3. Mg2+ veya K+ stok çözeltilerinin tam hacmini ayrı mikrofüj tüplerine veya V şeklindeki 96 oyuklu plakaya pipetleyin ve CFPS reaksiyonlarını ultra saf su ile tamamlayın. Reaksiyonları en az 2 saat inkübe edin.
    NOT: V şeklinde 96 oyuklu bir plaka kullanıyorsanız, buharlaşmayı önlemek için plakayı plastik bir kapakla kapatın.
  4. Reaksiyon karışımının 2 μL'sini çıkarın ve bir plaka okuyucu tarafından floresan ölçümleri için 96 oyuklu siyah bir plakaya aktarın.
    NOT: Aşağıdaki kuruluma sahip bir floresan plaka okuyucu kullanıyoruz: uyarma/emisyon: 485/528, Kazanç: 50, Okuma yüksekliği: 7.00 mm. Bununla birlikte, saflaştırılmış floresan proteinleri kullanarak belirli bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için plaka okuyucularını ayarlamak gerekir.

6. Kapsülleme

  1. Damlacık
    1. Lipidi mineral yağda çözerek yüzey aktif madde içeren florlu bir yağ (HFE7500 içinde %2 PFPE-PEG) veya bir lipit-mineral yağ çözeltisi hazırlayın (bkz. adım 6.2.1)
    2. Tablo 4'ten karşılık gelen reaktifleri 2-18 birleştirerek toplam 100 μL CFPS reaksiyonu hacmi hazırlayın. 1,5 mL'lik bir tüpte önceden hazırlanmış 500 μL'lik yağa CFPS reaksiyonu ekleyin ve ardından ince (yağda su) damlacıklar oluşturmak için tüpü tüp rafına 50x kuvvetlice ovalayın. Reaksiyonu gerçekleştirmek için tüpü 30 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Basit mikroakışkan çipler, homojen damlacıklar oluşturmak için de kullanılabilir43.
  2. Dev unilamellar veziküller (GUV'ler)
    1. Lipit-mineral yağ çözeltisinin hazırlanması
      1. 4 mL'lik bir cam şişeye 57 μL kloroform ekleyin ve daha sonra kloroform lipid çözeltisini oluşturmak için 18 μL 25 mg / mL 1-palmitoil-2-oleoil-gliserol-3-fosfokolin (POPC) lipidleri ekleyin ve 8 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde edin (benzer nihai konsantrasyonlara sahip diğer lipitleri kullanın).
        NOT: Bu karıştırma adımı, farklı lipitlerin homojen bir şekilde karıştırılmasını sağlamak içindi.
      2. Kloroformu 15 dakika boyunca bir argon akışı altında buharlaştırın ve ardından 1 saat boyunca vakum altında daha fazla buharlaştırın.
      3. Elde edilen kuru lipitleri 1.500 μL mineral yağ içinde çözün ve 400 μM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşın. Karışımı gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    2. Arayüzey lipid tabakası oluşturma
      1. 1.5 mL'lik bir tüpe 500 μL dış çözelti (bakınız Tablo 5) ekleyin ve dış çözeltinin üzerine yavaşça 250 μL lipit-mineral yağ çözeltisi yerleştirin. Stabil bir arayüzey lipid tabakası oluşturmak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    3. İç çözeltinin hazırlanması
      1. Ön iç çözeltiyi oluşturmak için Tablo 6'daki tüm reaktifleri karıştırın ve kullanana kadar buz üzerinde tutun. Tablo 4'te listelenen reaktifler 16-18 olarak ön iç çözeltiye T7RNAP, S30 özü ve DNA şablonu ekleyerek iç çözeltiyi tamamlayın.
        NOT: Kapsüllenmiş sükroz konsantrasyonunun 250 mM'nin üzerine çıkarılması, hücresiz translasyonu inhibe edebilir44.
    4. GUV'lerin oluşumu
      1. 500 μL lipid-mineral yağ içeren 1,5 mL'lik yeni bir tüpe 50 μL iç çözelti ekleyin, hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin ve kuvvetlice girdap yapın.
      2. Tüpü 10 dakika buz üzerinde bırakın ve adım 6.2.2'den itibaren 1.5 mL'lik tüpteki yağ fazının üstüne 20 μL emülsiyon karışımını yavaşça ekleyin.
      3. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 800 × g'da (100 × g ila 1000 × g arasında değişen bir santrifüj hızı kullanın) santrifüjleyin ve tüpün dibinde GUV oluşumunu gözlemleyin.
        NOT: Daha yüksek bir spesifik santrifüjleme hızı kullanılabilir; bununla birlikte, santrifüjleme hızının oluşan GUV'lerin45 boyutunu etkileyebileceği düşünülebilir.
      4. Üst yağ fazını çıkarın.
      5. Tüpün altındaki 30 μL GUV'leri dikkatlice aspire edin. Toplanan GUV'leri 30 °C'de inkübe edin.
        NOT: Optimum inkübasyon sıcaklığı, farklı proteinler için değişir.
      6. Floresan proteinlerin ekspresyonunu izlemek için Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (LSM) kullanın.
  3. Desteklenen lipid çift tabakası (SLB)
    1. SLB odalarının hazırlanması
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm # 1.5 lameller, her kapak slaytının ortasına yedi damla sülfürik asit ve iki damla% 50 hidrojen peroksit eklenerek. Reaktanları lameller üzerinde en az 45 dakika inkübe edin; Ultra saf su ile iyice durulayın.
      2. Bir reaksiyon odası oluşturmak için 10 dakika boyunca bir ultraviyole lamba (365 nm) altında kürlenmiş optik yapıştırıcı kullanarak temizlenmiş lamellerin üzerine kesilmiş 0,5 mL'lik bir mikrofüj tüpü takarak sulandırma odasını monte edin.
    2. SLB oluşumu
      1. 80 mol% 1,2-dioleoil-sn-gliserol-3-fosfokolin (DOPC), 19.95 mol% 1,2-dioleoil-sn-gliserol-3-fosfo-L-serin (DOPS) ve% 0.05 mol Atto488-DOPE (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin = DOPE) çözün, kloroformda karıştırın, hafif nitrojen akışı altında kurutun ve çözücüyü tamamen çıkarmak için 1 saat vakumlayın.
      2. Kurutulmuş lipit filmini SLB tamponu A'da yeniden sulandırın, bu da 4 mg / mL'lik bir nihai lipit konsantrasyonu ile sonuçlanır.
      3. Elde edilen örnekleri berraklaşana kadar girdap ve sonikleştirin.
      4. 4 mg / mL SUV'yi 130 μL SLB tamponu A ile seyreltin, 75 μL süspansiyonu önceden oluşturulmuş reaksiyon odalarına aktarın ve 37 ° C'de 1 dakika boyunca bir ısı bloğu üzerinde inkübe edin. 2 dakika boyunca daha fazla inkübasyon için reaksiyon odasına 150 μL SLB tamponu A ekleyin.
      5. CFPS reaksiyonları için %0,4 (a/h) BSA'lı S30 tampon C'ye tampon değişiminden önce hazneyi 2 mL SLB tamponu B (MgCl2'siz SLB tamponu A) ile yıkayın ve oluşan SLB'nin kurumasını önlemek için haznenin içinde 100 μL tampon bırakın.
      6. Kalan S30 tamponu C'yi çıkarın ve CFPS reaksiyon karışımını dikkatlice SLB haznesine ekleyin. Odayı 30 ° C'de inkübe edin ve konfokal lazer tarama mikroskobu altında ekspresyonunu izleyin.

Sonuçlar

Her yeni hücre ekstraktı ve T7 RNA polimeraz partisi için, CFPS sisteminin optimum performansını sağlamak için hem Mg2+ hem de K+ konsantrasyonlarının temel bir taramasının yapılması önerilir. Süper klasör GFP'nin floresansı, Şekil 1A,B'de gösterildiği gibi, değişen koşullar altında CFPS sisteminin genel veriminin bir göstergesi olarak hizmet edebilir. Ek olarak, CFPS sisteminin farklı bölmel...

Tartışmalar

Bu el yazması, yağda su damlacıkları, GUV'ler ve SLB'ler dahil olmak üzere sentetik hücre platformlarında çeşitli mikro bölmelerde kullanılmak üzere tasarlanmış modifiye edilmiş bir Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini özetlemektedir. Protein merkezli sentetik hücre sistemleri oluşturmak için kaynak ekstrakt olarak standart E. coli rekombinant protein ekspresyon konak suşu, BL21 (DE3) kullandık. Bu yaklaşım, farklı bölmelerde yaklaşık 0.5 mg / mL...

Açıklamalar

Yazarlar, bu yazıda rapor edilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

M. Y., Çin'in Jiangsu Eyaleti Lisansüstü Araştırma ve Uygulama İnovasyon Programından sağlanan finansmanı kabul eder (Hibe No. KYCX22_2803). LK, Çin, Çin Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Araştırmaları (Hibe No. 17KJB180003), Çin Jiangsu Normal Üniversitesi Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 17XLR037), Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme, Çin ve Jiangsu Özel Olarak Atanmış Profesör programı, Çin.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)Avanti840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mL tubesEppendorfEppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxideSigma-Aldrich516813
AcetateSigma-AldrichA6283
Agar powderSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Stirred CellsMerckMilliporeUFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Baffled Erlenmeyer flaskShuniu250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)Roche10711454001
CentrifugetubeEppendorfEppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rackEppendorf0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging systemUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)Roche10127566001
Creatine phosphate (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Culture dishHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)aladdinC101487
Dialysis membraneSpectrumStandard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature CultivatorYiheng instrumentDHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)Biosharp1100027
Fluorescent plate readerBioTekSynergy 2
Fluorinated oilSuzhou CChip scientific instrument2%HFE7500
Folinic acidSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucoseSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminSigma-AldrichG5792
GlycerolSigma-AldrichG5516
GlycinSigma-AldrichG7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Magnesium chloride(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MethioninSigma-AldrichM8439
MicrocentrifugeEppendorf5424 R
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Multipurpose CentrifugeEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay MeasurementsIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene platesSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
PhenylalaninSigma-AldrichP8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Potassium Acetate(KOAc)Sigma-AldrichP5708
Potassium chloride(KCl)Sigma-AldrichP9541
Potassium glutamate (K-glutamate)Sigma-AldrichG1501
Potassium hydroxide(KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Pyruvate kinase (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
ShakerZhichushakersZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sodium hydroxide(NaOH)Sigma-AldrichS5881
SucrosealaddinS112226
Sulfuric acidSigma-Aldrich339741
Syringe FiltersJinteng0.45 μm
Test tubeShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TryptoneSigma-AldrichT7293
TryptophanSigma-AldrichT8941
TyrosinSigma-AldrichT8566
UTP Trisodium salt (UTP)aladdinU100365
Vacuum Pump with Circulated Water SystemZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-8150
ValinSigma-AldrichV4638
Vortex MixersKylin-BellVortex QL-861
Water purification systemMerckMilliporeDirect ultrapure water (Type 1)
Yeast extractSigma-Aldrich70161
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich444203

Referanslar

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187 (2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663 (2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882 (2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8 (2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045 (2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580 (2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686 (2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637 (2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, W126-W131 (2007).
  51. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495 (2019).
  52. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  53. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  54. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  55. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar kelime ler H cresiz Protein SenteziCFPSSentetik H crelerA a dan Yukar ya MontajMerkezi DogmaasiYapay H cresel TaklitEkspresyon OptimizasyonuFloresan Raport rMikro B lmelerTek Katmanl Damlac klarift Em lsiyonlu Vezik llerDesteklenen Lipid ift Tabakal larSentetik H cre Geli imi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır