JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

Abstract

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) נמצאת בשימוש נרחב כדי להקל על הרכבה מלמטה למעלה של תאים סינתטיים. הוא משמש כמארח של מכונות הליבה של הדוגמה המרכזית, ועומד כשלדה אופטימלית לאינטגרציה והרכבה של מערכות חיקוי תאיות מלאכותיות מגוונות. למרות השימוש התכוף בייצור תאים סינתטיים, הקמת מערכת CFPS מותאמת וחזקה ליישום ספציפי נותרה אתגר לא טריוויאלי. במאמר שיטות זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור מערכת CFPS, המשמשת באופן שגרתי בבניית תאים סינתטיים. פרוטוקול זה מקיף שלבים מרכזיים בהכנת מערכת CFPS, כולל תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה שגרתית של ביטוי באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. בנוסף, אנו מציגים תוצאות מייצגות על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים שונים, כגון טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפול ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מבהירים את השלבים והתנאים הקריטיים הדרושים להרכבה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בסביבות נפרדות. אנו מצפים כי גישתנו תאפשר ביסוס שיטות עבודה טובות בין מעבדות שונות בתוך קהילת התאים הסינתטיים המתרחבת ללא הרף, ובכך תאיץ את ההתקדמות בתחום התפתחות התאים הסינתטיים.

Introduction

הסינתזה של תאים סינתטיים או מלאכותיים התפתחה כתחום בולט ביותר של מחקר בין-תחומי, ומשכה עניין רב מצד מדענים בתחומי הביולוגיה הסינתטית, הכימיה והביופיזיקה. מדענים אלה מאוחדים על ידי המטרה המשותפת של בניית תא חי מינימלי 1,2,3. הצמיחה המהירה של תחום זה באה במקביל להתקדמות משמעותית בטכנולוגיות קריטיות, כגון מניפולציה רקומביננטית של דנ"א4, חומרים ביומימטיים5, וטכניקות מיקרו-פבריקציה למידור6, כולל שיטת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS)7. מערכות CFPS מקיפות את המנגנון התאי החיוני לשעתוק ותרגום, ומספקות את המסגרת הבסיסית לפיתוח ואינטגרציה של תאים מלאכותיים רב-תכליתיים.

למרות שטכניקות CFPS משמשות לעתים קרובות בהרכבה של תאים סינתטיים, פיתוח מערכת CFPS חזקה ומותאמת אישית להרכבה של מערכות תאים סינתטיים שונות נותר אתגר מורכב. נכון לעכשיו, קיימות מערכות CFPS רבות, הנגזרות הן מאורגניזמי מודל פרוקריוטים והן מאוקריוטים8, שכל אחד מהם מתמחה ביישומים מסוימים בסינתזה של תאים סינתטיים. מעבר לתפקידיהן המרכזיים בתמלול ובתרגום, מערכות CFPS נבדלות זו מזו במרכיביהן העיקריים ובהליכי ההכנה הקשורים אליהן. שינויים אלה, הכוללים הבדלים בתמציות תאים, RNA פולימראזות, שיטות הכנת תבניות והרכבי חיץ, נובעות במידה רבה ממסלולי הפיתוח הייחודיים של קבוצות מחקר שביצעו אופטימיזציה אינטנסיבית של המערכות שלהן לתפוקת חלבון מרבית.

בין המרכיבים השונים של מערכת CFPS, תמצית התא היא מאגר אנזימטי קריטי לשעתוק ותרגום, ולכן גורם מפתח בביצועי CFPS9. CFPS מבוסס Escherichia coli (E. coli) הוא המערכת הנפוצה ביותר בשל מעמדו כאורגניזם הפרוקריוטי המובן ביותר. יתר על כן, מערכת CFPS משוחזרת במלואה הכוללת חלבונים וריבוזומים מטוהרים בנפרד, המכונה PURE10, פותחה על ידי קבוצת המחקר של Ueda, המתאימה במיוחד ליישומים הדורשים רקע ברור. כיום, אפילו מערכות CFPS מבוססות E. coli התגוונו, במיוחד במונחים של זני המקור עבור extrac11 ושיטות הכנה12,13, RNA פולימראז14,15, מקורות אנרגיה16,17, ומערכות חיץ18,19. הזנים הנפוצים ביותר כוללים נגזרות של זני K12 ו-B, כגון A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 ו-Rossetta223, לצד מקביליהם המהונדסים גנטית.

בתחילה, זני E. coli עם פעילויות RNase ופרוטאז מופחתות נבחרו כדי לשפר את יציבות mRNA ואת היציבות של חלבונים רקומביננטיים מסונתזים חדשים, מה שהוביל להגדלת תפוקת החלבון הסופי24. לאחר מכן, תמציות E. coli הונדסו כדי להקל על שינויים ספציפיים לאחר תרגום, כולל גליקוזילציה25, זרחן26, ושומנים27, פותחו כדי להשיג את השינויים שלאחר התרגום לעיל. בנוסף, שולבו מגוון תוספים כגון מלווים מולקולריים28 ומייצבים כימיים כדי לסייע בקיפול חלבוני מטרה, ולתרום לגיוון מערכות CFPS. הבקטריופאג' T7 RNA פולימראז, הידוע בתהליכיות הגבוהה שלו, משמש בעיקר לשעתוק, אם כי פולימרזות אחרות כגון SP629 שימשו גם כן. E. coli אנדוגני RNA פולימראז הותאם לאב טיפוס של מעגלים גנטיים הממנפים גורמי סיגמא30. לבסוף, מגוון של מבשרי אנרגיה 31,32,33 ומלחים שונים ורכיבי חיץ 19,34,35 עברו אופטימיזציה שיטתית כדי לשפר את הפרודוקטיביות.

מלבד מערכת CFPS עצמה, שיטות האנקפסולציה כמו גם חומרי המידור חיוניים גם להרכבת תאים סינתטיים מוצלחת. מערכות שונות שפותחו כדי לתמצת בהצלחה את תגובת CFPS כוללות טיפות מים/שמן המיוצבות על ידי פעילי שטח, ליפידים/פולימר ושלפוחיות חד-למלריות היברידיות שלהן (בקטרים הנעים בין 50 ננומטר למספר מיקרומטר), כמו גם דו-שכבות ליפידים הנתמכות על ידי מישורים. עם זאת, בשל תכולת המולקולות המורכבות של מערכת CFPS, שיעור ההצלחה של אנקפסולציה תלוי במקרים ספציפיים, במיוחד עבור היווצרות שלפוחיות. כדי לשפר את שיעור ההצלחה והיעילות של אנקפסולציה של CFPS, שבבי microfluid שונים פותחו כדי להקל על היווצרות של טיפות ובועיות36. עם זאת, יהיה צורך להקים שבבים ומכשירים נוספים.

פרוטוקול זה מתאר מערכת E . coli CFPS המשתמשת בזן BL21(DE3), שהוא מארח נפוץ לייצור חלבונים רקומביננטיים. הפרוטוקול כולל תיאור מפורט של הכנת תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה סטנדרטית של ביטויים באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. יתר על כן, אנו מציגים תוצאות מופתיות שהושגו על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים מגוונים, כולל טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפולות ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מסבירים את המרכיבים הפרוצדורליים המרכזיים ואת התנאים ההכרחיים להקמה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בהקשרים סביבתיים נפרדים.

Protocol

1. הכנת התמצית

  1. פזרו את זן E. coli BL21 (DE3) ממלאי גליצרול על צלחת אגר Luria Bertani (LB) ודגרו במשך 15 שעות לפחות בטמפרטורה של 37°C.
  2. הכינו טרום גידול לילה על ידי חיסון מושבה אחת מצלחת LB שזה עתה הוכנה לבקבוק 50 מ"ל של Luria Bertani (LB) בינוני.
  3. לחסן 5 מ"ל של preculture לתוך 500 מ"ל של 2xYTPG בינוני בבקבוק 3 L מבולבל Erlenmeyer. לגדל אותו ב 37 ° C עם רעידות נמרצות (בין 220 סל"ד ל 250 סל"ד) ולקצור את התאים כאשר הם מגיעים לשלב אמצע לוג (OD600 ~ 3). לאחר מכן, הניחו את תרביות התאים במי קרח קרים למשך 10 דקות ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 × למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: בשלב זה, ניתן להשמיט את הגלוקוז בתווך 2xYTPG עבור יישומים ספציפיים 9,12.
  4. השהה מחדש את כדורי התא המתקבלים ב- 35 מ"ל של חיץ A S30 מקורר מראש, ולאחר מכן צנטריפוגה ב- 8,000 × גרם למשך 15 דקות ב- 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
  5. חזור על שלב 1.4 פעמיים.
    הערה: ניתן לאחסן את כדורי התא בטמפרטורה של -80°C אם לא משתמשים בהם מיד.
  6. השהה מחדש את הכדוריות הסופיות בחיץ S30 B (למשל, השתמש ב-1.1 מ"ל של חיץ S30 B לכל 1 גרם של כדורי תא) ושיבש את התאים במעבר אחד דרך French Press ב-17,000 psi.
    1. לשימוש במכבש הצרפתי, עקוב אחר המדריך למשתמש והעבר את מתלה התא לתא שיבוש המתכת של העיתונות הצרפתית, תוך הקפדה על הרכבה של כל הרכיבים ועל סגירת השסתום התחתון של תא השיבוש.
    2. העבירו את תא ההפרעה המורכב לפלטפורמה הידראולית ואבטחו את מנעול הבטיחות.
    3. הפעל את המשאבה ההידראולית והתחל את ההפרעה.
    4. שלוט בשסתום היציאה כדי לאפשר למתלה התא לזרום החוצה מצינור היציאה לתוך צינור חדש של 50 מ"ל. כוונן את מהירות הזרימה כדי להבטיח הפרעה יעילה, באופן אידיאלי טיפה אחת בכל פעם. שמור על הלחץ מעל הגבול התחתון של 15,000 psi.
  7. צנטריפוגו את הליזט שנוצר ב 30,000 × גרם למשך 30 דקות ב 4 °C ולאסוף את supernatant. חזרו על הצנטריפוגה פעם אחת ואספו את הסופרנטנט. יש להוסיף 0.3 נפח של חיץ קדם-דגירה לסופרנאטנט שנאסף ולדגור בניעור עדין ב-37°C למשך 80 דקות.
    הערה: השימוש במאגר הדגירה יכול להגדיל את התשואה הסופית, אם כי דווח כי נגר ריק (ללא מאגר דגירה מראש) יכול גם לשפר את היעילות37,38, התלויה בזן המקור המתאים.
  8. יש לנטרל את תערובת הדיאליזה המתקבלת למשך שעתיים כנגד 2 ליטר של חיץ S30 C, להחליף את מאגר הדיאליזה פעם אחת ב-2 ליטר של חיץ S30 טרי C, ולדיאליזה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C39.
    הערה: ניתן לקצר את השלב השני של דיאליזה לילה לכ-3 שעות.
  9. אסוף את הדגימה והצנטריפוגה בטמפרטורה של 30,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C. אוספים את הסופרנאטנט והאליקוט לנפחים מתאימים ומקפיאים מיד בחנקן נוזלי.
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימה הקפואה בטמפרטורה של -80°C לפחות למשך 6 חודשים עד שנה ללא אובדן יעילות.

2. T7 RNA פולימראז

  1. הפוך פלסמיד pAR1219 לכוכב BL21(DE3) E . coli תאים מוכשרים40.
  2. יש לחסן 10 מ"ל של תרבית לילה לתוך 1 ליטר של LB בינוני (המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין). גדל את התאים ב 37 ° C עד OD600 מגיע 0.6-0.8.
  3. התחל את האינדוקציה על ידי הוספת ריכוז סופי של 1 mM IPTG. השרית התאים במשך 5 שעות נוספות וקציר על ידי צנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. אחסנו את כדורי התא בטמפרטורה של -80°C למשך עד מספר שבועות.
  4. להשהות מחדש את כדורי התא ב 30 מ"ל של T7 חיץ A ולשבש את התאים על ידי מעבר אחד דרך העיתונות הצרפתית ב 15,000 psi. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 20,000 × גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  5. מוסיפים סטרפטומיצין סולפט טיפה אחר טיפה לסופרנאטנט מהשלב הקודם, ומגיעים לריכוז סופי של 4% (w/v). לאחר דגירה קצרה על קרח, צנטריפוגה ב 20,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (75 °F).
  6. סננו את הסופרנאטנט דרך קרום מסנן של 0.45 מיקרומטר וטענו את הדגימה המסוננת על עמודת חילופי אניון חזקה (נפח עמודה של 40 מ"ל), אשר שוקלה מראש עם נפחי 10 טורים של חיץ T7 B, באמצעות מערכת כרומטוגרף נוזלי אוטומטית.
  7. שטף את העמודה הטעונה עם 50 נפחי עמודות של T7 חיץ B ומחק את הדגימה עם 10 נפחי עמודות של תערובות מלח נמוך (50 מ"מ NaCl) ומלח גבוה (500 מ"מ) T7 חיץ C, תוך יצירת שיפוע ריכוז ליניארי של NaCl בין 50 ל 500 מילימטר בקצב זרימה של ~ 3 מ"ל / דקה41.
  8. אסוף את שברי השיא ונתח באמצעות SDS-PAGE.
    הערה: T7 פולימראז מציג פס דומיננטי ב~100 kDa, בעוד כמויות משמעותיות של זיהומים עדיין מופיעות על ג'ל SDS-PAGE.
  9. אגרו את השברים המכילים T7 פולימראז והדיאליזה כנגד 2 ליטר של חיץ T7 C למשך הלילה.
  10. מוסיפים גליצרול כדי להגיע לריכוז סופי של 10% ומרכזים את התערובת המתקבלת לריכוז סופי של 3-4 מ"ג/מ"ל על ידי אולטרה-סינון42.
    הערה: אם משקעים מופיעים במהלך תהליך הריכוז, עצור מיד והסר את המשקעים באמצעות צנטריפוגה.
  11. התאם את ריכוז הגליצרול ל -50%. Aliquot ו פלאש להקפיא את הדגימה עם חנקן נוזלי. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לתקופה ארוכה יותר.
    הערה: aliquot קטן יכול גם להיות מאוחסן ב -20 ° C לפחות 1 חודש ללא אובדן יעילות.

3. הכנת חיץ

  1. הכינו מאגרים כמצוין בטבלה 1 יום לפני השימוש.

4. עיצוב והכנת תבניות

  1. לשכפל את הגן המעניין לווקטור מבוסס מקדם T7 או ליצור מוצר PCR ליניארי המכיל את הגן המעניין.
    הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת עקרונות עיצוב.
  2. הכינו את הפלסמיד מתרבית לילה באמצעות ערכת מיצוי פלסמיד.
    הערה: אנו ממליצים לבחור ערכת פלסמיד הכוללת שלב משקעים איזופרופנול ואחריו הליך שטיפה עם אתנול 70%.
  3. ממיסים את הדנ"א המיובש בנפח קטן של מים אולטרה-טהורים לריכוז שבין 200 מיקרוגרם/מ"ל ל-500 מק"ג/מ"ל, כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
  4. אופציונלי: לבטא ישירות חלבונים ממוצרי PCR ליניאריים.
    הערה: במקרה זה, יש צורך בשלב טיהור PCR.

5. אופטימיזציה של Mg2+ ו- K+

  1. הכינו תערובת אב לבדיקת ריכוז Mg2+ כמצוין בטבלה 2, או לבדיקת ריכוז K+ כמצוין בטבלה 3.
  2. העבירו את תערובת האב לצינורות מיקרופוגה בודדים או לצלחת בצורת V בעלת 96 בארות.
  3. פיפטה את הנפח המדויק של תמיסות מלאי Mg2+ או K+ לתוך צינורות מיקרופוגה בודדים או צלחת בצורת V בצורת 96 בארות והשלם את תגובות CFPS עם מים טהורים במיוחד. לדגור על התגובות במשך שעתיים לפחות.
    הערה: אם אתם משתמשים בפלטה בצורת V עם 96 בארות, אטמו את הצלחת עם כיסוי פלסטיק כדי למנוע אידוי.
  4. מוציאים 2 מיקרוליטר מתערובת התגובה ומעבירים לצלחת שחורה בת 96 בארות למדידות פלואורסצנטיות על ידי קורא לוחות.
    הערה: אנו משתמשים בקורא לוחות פלואורסצנטי עם ההגדרה הבאה: עירור/פליטה: 485/528, רווח: 50, גובה קריאה: 7.00 מ"מ. עם זאת, יהיה צורך לכוונן את קורא הלוחות שלהם כדי ליצור עקומת כיול ספציפית באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים מטוהרים.

6. אנקפסולציה

  1. טיפה
    1. הכינו שמן מופלר המכיל חומרים פעילי שטח (2% PFPE-PEG ב-HFE7500) או תמיסת שמן שומנים-מינרליים על ידי המסת שומנים בשמן מינרלי (עיין בשלב 6.2.1)
    2. הכן נפח כולל של 100 μL של תגובת CFPS על ידי שילוב ריאגנטים 2-18 המתאימים מטבלה 4. הוסף תגובת CFPS ל- 500 μL של השמן שהוכן בעבר בצינור של 1.5 מ"ל ולאחר מכן, שפשף את הצינור במרץ על מדף הצינור 50x כדי ליצור טיפות עדינות (מים בשמן). לדגור על הצינור ב 30 ° C כדי לבצע את התגובה.
      הערה: שבבי מיקרופלואידיקה פשוטים יכולים לשמש גם ליצירת טיפות הומוגניות43.
  2. שלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs)
    1. הכנת תמיסת שמן שומנים-מינרליים
      1. הוסף 57 μL של כלורופורם לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 18 μL של 25 מ"ג / מ"ל 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycerol-3-phosphocholine (POPC) שומנים כדי ליצור את תמיסת השומנים כלורופורם, השגת ריכוז סופי של 8 mM (להשתמש שומנים אחרים עם ריכוזים סופיים דומים).
        הערה: שלב ערבוב זה נועד להבטיח ערבוב הומוגני של שומנים שונים.
      2. אידוי הכלורופורם תחת זרימת ארגון למשך 15 דקות, ולאחר מכן, אידוי נוסף תחת ואקום למשך שעה אחת.
      3. ממיסים את השומנים היבשים המתקבלים ב-1,500 מיקרוליטר שמן מינרלי, ומגיעים לריכוז סופי של 400 מיקרומטר. דוגרים על התערובת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    2. יצירת שכבת שומנים בין פנים
      1. הוסף 500 μL של התמיסה החיצונית (ראה טבלה 5) לצינור של 1.5 מ"ל, ושכבה איטית של 250 μL של תמיסת שמן שומני-מינרלי על גבי התמיסה החיצונית. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ליצירת שכבת שומנים יציבה בין הפנים.
    3. הכנת הפתרון הפנימי
      1. ערבבו את כל הריאגנטים בטבלה 6 ליצירת התמיסה הפרה-פנימית ושמרו אותה על קרח עד לשימוש. השלם את הפתרון הפנימי על-ידי הוספת T7RNAP, תמצית S30 ותבנית DNA לתמיסה הפרה-פנימית כריאגנטים 16-18 המפורטים בטבלה 4.
        הערה: הגדלת ריכוז הסוכרוז בכמוסה מעל 250 מילימטר עלולה לעכב תרגום ללא תאים44.
    4. היווצרות של GUVs
      1. הוסף 50 μL של תמיסה פנימית לצינור חדש של 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של שמן שומנים-מינרלים, פיפטה למעלה ולמטה במהירות, ומערבולת במרץ.
      2. השאירו את הצינור על קרח למשך 10 דקות והוסיפו באיטיות 20 מיקרוליטר של תערובת התחליב לחלק העליון של שלב השמן בצינור 1.5 מ"ל משלב 6.2.2.
      3. צנטריפוגה ב 800 × גרם (להשתמש במהירות צנטריפוגה הנעה בין 100 × גרם ל 1000 × גרם) במשך 10 דקות ב 4 ° C ולצפות היווצרות של GUV בתחתית הצינור.
        הערה: ניתן להשתמש במהירות צנטריפוגה ספציפית גבוהה יותר; עם זאת, ניתן לקחת בחשבון כי מהירות הצנטריפוגה יכולה להשפיע על גודלם של GUV45 שנוצרו.
      4. מוציאים את שלב השמן העליון.
      5. יש לשאוף בזהירות 30 μL של GUV בתחתית הצינור. לדגור את GUV שנאספו ב 30 ° C.
        הערה: טמפרטורת הדגירה האופטימלית משתנה עבור חלבונים שונים.
      6. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (LSM) כדי לפקח על ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים.
  3. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLB)
    1. הכנת תאי SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 מ"מ #1.5 מכסה על ידי הוספת שבע טיפות של חומצה גופרתית ושתי טיפות של 50% מי חמצן למרכז כל שקופית כיסוי. לדגור על המגיבים על הכיסויים במשך 45 דקות לפחות; יש לשטוף היטב במים טהורים במיוחד.
      2. הרכיבו את תא ההרכבה מחדש על ידי חיבור צינור מיקרופוגה חתוך בנפח 0.5 מ"ל על הכיסויים המנוקים באמצעות דבק אופטי שנרפא תחת מנורה אולטרה סגולה (365 ננומטר) למשך 10 דקות ליצירת תא תגובה.
    2. היווצרות SLB
      1. להמיס 80 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (DOPC), 19.95 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phospho-L-serine (DOPS), ו 0.05 mol% Atto488-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine = DOPE), לערבב כלורופורם, יבש תחת זרימת חנקן קלה ואקום במשך 1 שעה כדי להסיר את הממס לחלוטין.
      2. יש לייבש מחדש את שכבת השומנים המיובשת בחיץ SLB A, והתוצאה היא ריכוז שומנים סופי של 4 מ"ג/מ"ל.
      3. מערבלים ומפעילים את הדגימות המתקבלות עד שהן מתבהרות.
      4. לדלל 4 מ"ג / מ"ל של רכבי שטח עם 130 μL של חיץ SLB A, להעביר 75 μL של המתלים לתאי התגובה שהוכנו מראש, ולדגור אותו על בלוק חום ב 37 ° C במשך 1 דקות. הוסף 150 μL של חיץ SLB A לתא התגובה לדגירה נוספת למשך 2 דקות.
      5. שטף את התא עם 2 מ"ל של חיץ SLB B (חיץ SLB A ללא MgCl2) לפני החלפת חיץ למאגר C S30 עם BSA של 0.4% (w/v) עבור תגובות CFPS, תוך השארת 100 μL של חיץ בתוך התא כדי למנוע מה-SLB שנוצר להתייבש.
      6. הסר את שארית חיץ C S30 והוסף בזהירות את תערובת התגובה CFPS לתא SLB. יש לדגור על התא בטמפרטורה של 30°C ולנטר את הביטוי תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

תוצאות

עבור כל אצווה חדשה של תמצית תאים ו- T7 RNA פולימראז, מומלץ לבצע סינון בסיסי של ריכוזי Mg2+ ו- K+ כדי להבטיח את הביצועים האופטימליים של מערכת CFPS. הפלואורסצנטיות של GFP של תיקיות העל יכולה לשמש אינדיקטור לתשואה הכוללת של מערכת CFPS בתנאים משתנים, כפי שמודגם באי...

Discussion

כתב יד זה מתאר מערכת שונה של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) המיועדת לשימוש במיקרו-תאים שונים על פני פלטפורמות תאים סינתטיים, כולל טיפות מים בשמן, GUV ו- SLBs. השתמשנו בזן המארח הסטנדרטי של E. coli recombinant protein expression host, BL21(DE3), כתמצית המקור לבניית מערכות תאים סינתטיים הממוקדות בחל?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgements

מ 'י' מכיר במימון מתוכנית המחקר והחדשנות לתארים מתקדמים של מחוז ג'יאנגסו, סין (מענק מס '. KYCX22_2803). L.K. אסירת תודה על התמיכה במחקר מדעי הטבע של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו בסין, סין (מענק מס '17KJB180003), הקרן למדעי הטבע של אוניברסיטת ג'יאנגסו נורמל, סין (מענק מס '17XLR037), פיתוח תוכנית אקדמית מועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו, סין, ותוכנית הפרופסור המיוחדת של ג'יאנגסו, סין.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)Avanti840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mL tubesEppendorfEppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxideSigma-Aldrich516813
AcetateSigma-AldrichA6283
Agar powderSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Stirred CellsMerckMilliporeUFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Baffled Erlenmeyer flaskShuniu250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)Roche10711454001
CentrifugetubeEppendorfEppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rackEppendorf0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging systemUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)Roche10127566001
Creatine phosphate (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Culture dishHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)aladdinC101487
Dialysis membraneSpectrumStandard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature CultivatorYiheng instrumentDHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)Biosharp1100027
Fluorescent plate readerBioTekSynergy 2
Fluorinated oilSuzhou CChip scientific instrument2%HFE7500
Folinic acidSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucoseSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminSigma-AldrichG5792
GlycerolSigma-AldrichG5516
GlycinSigma-AldrichG7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Magnesium chloride(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MethioninSigma-AldrichM8439
MicrocentrifugeEppendorf5424 R
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Multipurpose CentrifugeEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay MeasurementsIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene platesSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
PhenylalaninSigma-AldrichP8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Potassium Acetate(KOAc)Sigma-AldrichP5708
Potassium chloride(KCl)Sigma-AldrichP9541
Potassium glutamate (K-glutamate)Sigma-AldrichG1501
Potassium hydroxide(KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Pyruvate kinase (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
ShakerZhichushakersZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sodium hydroxide(NaOH)Sigma-AldrichS5881
SucrosealaddinS112226
Sulfuric acidSigma-Aldrich339741
Syringe FiltersJinteng0.45 μm
Test tubeShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TryptoneSigma-AldrichT7293
TryptophanSigma-AldrichT8941
TyrosinSigma-AldrichT8566
UTP Trisodium salt (UTP)aladdinU100365
Vacuum Pump with Circulated Water SystemZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-8150
ValinSigma-AldrichV4638
Vortex MixersKylin-BellVortex QL-861
Water purification systemMerckMilliporeDirect ultrapure water (Type 1)
Yeast extractSigma-Aldrich70161
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich444203

References

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187 (2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663 (2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882 (2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8 (2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045 (2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580 (2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686 (2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637 (2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, W126-W131 (2007).
  51. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495 (2019).
  52. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  53. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  54. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  55. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CFPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved