Longa 大脑中动脉闭塞方法的优化

摘要

该协议为研究人员提供了使用改良的 Longa 颈外动脉方法对小鼠进行大脑中动脉闭塞手术的分步指南。本文中介绍的改良旨在提高大脑中动脉闭塞的准确性并确保完全再灌注。

摘要

大脑中动脉闭塞模型是研究缺血性中风的主要动物模型。尽管在研究中使用了三十多年，但其标准化仍然不足。该程序主要在大鼠和小鼠身上进行，由于小鼠的体积更小、更脆弱，因此带来了挑战。与 Koizumi 颈总动脉方法不同，Longa 颈外动脉是唯一确保缺血后完全再灌注的腔内细丝卒中模型。这方面对于研究再灌注现象具有至关重要的意义。本文中演示的手术修改可确保在整个缺血期和再灌注开始后从颈总动脉连续流血。这些修改的目标是在缺血期间，通过在大脑中动脉近端的分支中保持灌注不间断，选择性地闭塞大脑中动脉。此外，再灌注的发生是突然的，可以精确控制，从而更准确地模拟人类医学中的血管内血栓切除术。我们展示这篇全面的视频文章的目的是简化新外科医生的培训，并促进科学界外科手术的标准化。

引言

中风是第二大死亡原因，也是导致死亡和残疾的第三大原因¹。就其原因而言，中风可以是缺血性或出血性，缺血性中风在临床实践中明显更为普遍。缺血性中风是由于向脑组织供血的动脉阻塞引起的，导致缺血、细胞死亡和炎症。自溶栓和机械血栓切除术等再灌注疗法问世以来，中风的治疗取得了长足的进步。然而，所有再灌注疗法都存在导致通常所说的再灌注损伤而加剧患者病情的风险²。再灌注损伤的确切机制尚不清楚，需要进行临床前研究来确定潜在原因和预防措施。为此，为缺血性卒中后的再灌注损伤开发一个相关的动物模型变得至关重要。

大脑中动脉闭塞 （MCAO） 是研究缺血性卒中最常用的动物模型。它主要在啮齿动物中进行，到目前为止，科学文献中描述了许多不同的变体 ^3,4。两种主要类型，小泉和 Longa，被称为颈总动脉 （CCA） 和颈外动脉 （ECA） 变体，在技术上区别在于细丝插入的动脉切开部位 ^5,6。在我们最近的文章中，通过血管灌注的体内监测，我们表明只有 Longa 方法可以真正被视为脑缺血/再灌注模型⁷。该过程包括将细丝插入 ECA，将其推进 ICA，并将其固定在大脑中动脉 （MCA） 的分支点以诱导脑组织缺血。在预定的缺血期之后，丝的退出允许再灌注，模拟短暂性脑缺血。中风发作后，研究中使用的主要结果变量通常是梗死病变的体积，可以使用离体组织学或体内脑部扫描进行测量。MCAO 模型的挑战围绕着归因于变体间、运算符间和受试者间差异的低重现性，后者在临床前卒中研究中构成了重大限制⁴。

此外，相对于啮齿动物大脑的大小，啮齿动物 MCAO 后的梗死区域是巨大的。此外，大脑的海马后部区域经常被募集到梗死体积中，尽管这些区域主要依赖于大脑后动脉 （PCA） 的血流，而不是 MCA⁸。与文献中描述的 Koizumi 和 Longa 方法一样，由于小鼠 Willis 环的通畅不完全，CCA 在缺血期间保持连接状态，导致缺血诱导区域比预期要宽得多 ^5,6,9。即使在缺血期后重新开放或修复 CCA 的方法中，通常的 30-60 分钟缺血也会导致非 MCA 区域出现不可逆的组织损伤¹⁰。此外，与预期相反，先前的研究表明，细丝的硅涂层长度对病变大小¹¹ 没有影响。然而，在闭塞期间，细丝硅涂层长度的选择仅在具有连接 CCA 的模型中得到解决。

该方法的目标是修改小鼠的 Longa MCAO 方法，使其在缺血期间能够不间断地从 CCA 流出，从而提高 MCAO 的选择性，并确保手术后梗死区域的完全再灌注。这些修改将通过降低死亡率和减少受试者间方差，极大地有利于研究小鼠缺血再灌注损伤的纵向研究。

研究方案

所有动物处理和程序均已获得萨格勒布大学医学院伦理许可委员会和克罗地亚共和国农业部用于科学目的的动物保护伦理委员会的批准。根据克罗地亚动物保护法 （NN 102/17， 32/19）、动物保护法修正案 （NN 37/13） 和用于科学目的的动物保护指南 （NN 55/13） 进行实验程序，这些指南符合欧洲实验动物护理和使用指南（指令 2010/63/EU）。

1. 动物和手术部位的准备

1. 将动物置于敲除盒中，并在氧/氮混合物（1:2 比例）中使用 5% 体积的异氟醚诱导麻醉。
2. 目视检查动物的意识状态和呼吸频率后，将其带到实验室秤上称重。
3. 通过捏住下肢的指间皮肤来检查反射，以确保适当的麻醉深度。
4. 将动物放在加热的手术台上，并将其鼻子放入麻醉面罩中。将初始操作台温度设置为 36 °C 并调节它以将动物的体温保持在 37 °C（通过后续步骤中引入的直肠探针测量）。在所有进一步的步骤中，调整异氟醚的体积分数，以保持动物的呼吸频率为 100 次呼吸/分钟。
   注意:手术前必须彻底消毒所有与动物直接接触的表面和材料。
5. 将眼药膏涂抹在动物的眼睛上，以保护它们免受脱水和异氟醚气体的影响。
6. 将动物仰卧并伸展脖子，在其下方放置一个由手术胶带制成的小枕头。
7. 使用手术胶带将动物的四肢固定到位。注意不要过度伸展前肢，以免无意中导致肩关节脱位。
8. 使用凡士林润滑直肠探头，并将其插入直肠进行连续体温测量。使用手术胶带将探头与尾部一起固定到位。
9. 术前腹膜内注射生理盐水和丁丙诺啡 （0.5 mg/kg），以保持动物在手术过程中水分充足和镇痛。
10. 使用无线动物剪剃掉动物颈部区域的皮毛。使用手术胶带收集所有剃光的毛皮。此外，用剃须刀剃掉该区域，使其完全没有毛皮。
11. 根据被测动物的体重和/或年龄选择 MCAO 细丝。将其从容器中取出，放入可见位置的培养皿中。在细丝的硅胶部分滴一滴盐水，保持其清洁无尘。
    注意: 对于 12-16 周龄的鼠标，应根据制造商的官方建议选择细丝硅胶涂层的厚度。此外，应事先仔细规划硅胶涂层的长度，具体取决于要封闭的灌溉区域的大小（见 讨论）。
12. 将干净的手术单放在手术台上。
13. 将一滴 Betadine 涂抹在动物剃光的皮肤上。使用棉签将消毒剂从内到外以圆周方式擦入皮肤。之后，用浸有乙醇的棉签做同样的事情。每次重复时，用一对新的无菌棉签重复此步骤 3 次。
14. 将少许利多卡因凝胶涂抹在未来切口部位的消毒区域，以进行局部伤口镇痛。

2. 缺血诱导手术

1. 使用手术刀在消毒过的皮肤上做一个初始切口。将皮肤切口敲击的次数保持在最低限度，以使手术伤口更容易愈合。
   注意:所有器械必须事先消毒过。读者应参考其有关使用无菌或外科手套的机构指南。
2. 使用 7 型和 5 型镊子撕开浅筋膜，并将唾液腺从底层组织中分离。
   注意:始终使用闭合的镊子前进，并在远离时伸展镊子以将组织推开。这样，可以以最小的组织创伤穿越解剖空间。
3. 将金属丝牵开器置于初始位置，同时确保唾液腺不会干扰后续步骤。
4. 使用 7 型镊子去除深颈筋膜，并从颈动脉区域分离胸锁乳突肌以重新定位牵开器。
5. 重新定位牵开器以到达胸锁乳突肌下方，以便进入颈动脉区域。
6. 切除舌骨肌，以便清晰、直观地接近颈动脉区域。
7. 将颈动脉及其分支从颈动脉静脉和迷走神经中释放出来，它们一起固定在颈动脉筋膜中。
   注意:必须小心去除此筋膜，以免损伤迷走神经或导致任何严重出血。
   1. 捏住颈动脉三联征外侧的颈动脉筋膜，轻轻地向外侧拉动，以直观地识别动脉、神经、静脉和周围的所有血管分支。
   2. 在横向拉动筋膜的同时，使用 5 型镊子将 CCA 与相邻的神经和静脉分开，直到分支点和穿过 CCA 的甲状腺上静脉。
   3. 使用弯曲的 7 型镊子将 CCA 的下部与下面的组织和筋膜完全分离，确保它准备好在未来的步骤中夹紧。
   4. 在 CCA 分支点上方的区域沿颅骨前进，使用两个镊子撕开颈动脉筋膜。
   5. 同样，向内侧和外侧拉动颈动脉筋膜的松散端，以分别将 ECA 和颈内动脉 （ICA） 与筋膜和周围组织精确分离。
   6. 使用弯曲的 7 型镊子将 ECA 和 ICA 从底层组织中释放出来。
8. 用两个各自的分支精心准备 CCA，使用弯曲的 7 型镊子抬起 ECA，并用 N0 型自闭合镊子夹住它。
9. 小心地将 N0 型自闭合镊子放在手术台上。
   注意: 要重新定位 ECA 的夹紧点，有时需要稍微松开夹具并向尾部推动 ECA 分支点。此时，重要的是要确保在 ECA 夹紧和分支点之间保留超过 1 mm 的 ECA。
10. 用 N0 型镊子夹住 ECA 并牢固固定后，在 ECA 后面引入两根编织丝线。
    注意:颅骨线将形成结扎结，必须从夹钳部位放在颅骨上。
11. 完全系住颅线，因为它是永久性的，然后用剪刀剪掉多余的线。
12. 将尾线打成一个松散的固定结。
    注意:必须将其放在靠近 ECA 分支点的位置，并保持松散，以便 MCAO 细丝通过。
13. 使用血管微夹，夹住 CCA 和 ICA，以防止动脉切开术后出血。
    注意:确保应用于 CCA 的微夹具有足够强的抓地力至关重要，因为 CCA 是一条搏动的高通量动脉，如果不这样做，可能会导致动物在后续步骤中大量出血和死亡。
14. 使用微弹簧剪刀，在 ECA 夹紧部位正下方进行小动脉切开术。
    注意:动脉切开术需要足够大，以便细丝的硅部分进入，但不能大于 ECA 周长的一半，以免损害 N0 型镊子保持的张力。
15. 以与 ECA 的角度匹配的角度，将细丝沿 CCA 近端方向插入动脉切开部位，穿过 ECA 分支部位的松散固定结，并与细丝一起插入 CCA 的管腔。
16. 拧紧灯丝硅部分周围的固定结。
    注意:此时需要非常小心，因为细丝往往会在最后一次机动的中途从 ECA 中滑出，此时将其放回去非常困难。
17. 小心地打开 ICA 微型夹并将其取下。
18. 将细丝部分插入 ECA 并固定下来，进行完整的动脉切开术，从而使 ECA 残端松散，MCAO 细丝在里面。此时，松开 N0 型自闭合镊子并将其取出。
19. 用一套 5 型镊子，用力捏住 ECA 残端并稍微抬起。在用另一把镊子抓住部分插入的细丝的同时，降低并轻轻拉动 ECA 残端，使细丝的内端朝向 ICA。切勿夹住细丝的硅胶部分。
20. 用镊子抓住细丝，慢慢地将细丝穿过 ICA 推向 Wills 的圆圈。
    注意:ICA 的第一个分支点也是操作员唯一可能错过所需 MCA 分支点的分支点。因此，需要一个轻微的横向前进角才能将细丝引导到 MCA 分支点。随着轻微的横向推进角，细丝从翼腭动脉 （PPA） 弯曲，使前进端更有可能进入 Willis 环（图 1）。

图 1:大脑中动脉闭塞丝推进超过翼腭动脉分支点的图示。 适当的细丝推进（左）是通过调整 MCAO 细丝的方向来实现的，使其背靠 ICA 的侧壁并弯曲远离 PPA 分支点。否则（右侧）可能会导致细丝进入 PPA 而不引起中风。在后一种情况下，细丝将无法达到应有的程度，外科医生应撤回细丝，直到其末端在 ICA 分支点可见，然后再次开始推进细丝。绿色动脉代表后交通动脉 （PcomA），在小鼠中大多为非通畅动脉。使用 BioRender.com 创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

21. 慢慢地将 MCAO 细丝推进穿过 Willis 圈，直到感觉到阻力突然增加。
    注意:此时，观察细丝的剩余长度很重要。细丝应毫不费力地从成年小鼠的 ICA 分支点开始至少 7 毫米。
22. 拧紧固定结，以确保细丝在缺血期间不会移位。
23. 移除 CCA 剪辑并记下时间。
    注意:这标志着缺血发作的开始。
24. 将 MCAO 细丝的松散端塞入颈动脉三角和同侧胸锁乳突肌之间的凹槽中，使其不会从手术伤口中伸出。
25. 取下金属丝牵开器，使手术伤口的边缘彼此靠近。让手术部位停留几秒钟，让组织恢复到其解剖位置。
26. 使用胶带伤口闭合闭合手术伤口，以促进缺血期后伤口更快地重新开放。
    注意:如果研究人员希望让动物在缺血期间醒来，建议缝合伤口以防止伤口过早重新打开。

3. 缺血期

1. 使用 MRI 或其他一些定量灌注测量方法验证手术是否成功。
   注意:在进行 MRI 扫描的情况下，灌注加权成像 （PWI） 应显示宽 MCA 区域的严重缺血，弥散加权成像 （DWI） 应概述由于细胞水肿导致表观弥散系数 （ADC） 降低的部位。
2. 将动物放入干净的笼子中，直到缺血期结束。

4. 细丝撤离手术

1. 在分配的缺血时间结束前大约 5 分钟，将动物定位并再次固定在手术台上。
2. 取下胶带缠绕闭合处，然后用导丝牵开器重新打开手术伤口。
3. 将 MCAO 细丝的松散端从周围组织和固定结线的末端松开。
4. 用 N0 型镊子，捏住并向腹侧拉动 ECA 残端的边缘，使其施加张力。小心地将捏镊子放下，类似于第一次外科手术。
   注意:操作员必须避免捏住固定结，因为这会使结无法解开。
5. 用微血管夹再次夹住 CCA。
6. 使用 5 型镊子，松开固定结以提取细丝。
   注意:开始松开打结的最佳方法是不断捏它，直到它分成单独的部分，然后将线末端推向打结。
7. 慢慢抽出 MCAO 细丝，直到硅部分开始从 ECA 残端伸出。稍微收紧固定结，为完全抽出细丝做好准备。
8. 当靠近灯丝的硅端时，拧紧固定结，使其推出 MCAO 灯丝并一次性闭合 ECA 残端。细丝滑出后，将结完全收紧。
9. 打开并取出捏合镊子和 CCA 夹。
   注意:这标志着缺血期的结束和再灌注过程的开始。
10. 拆下金属丝牵开器，将手术伤口的边缘再次合拢。
11. 从外围开始缝合手术伤口，完全闭合伤口，看不到任何底层组织。
    注意:所需的缝合线数量取决于手术伤口的大小。
12. 使用外用酒精湿巾清洁和消毒手术部位。

5. 术后护理

1. 将动物放在干净的笼子里，让它从麻醉中自发醒来。
2. 将颗粒状食物放在笼子底部，以便于取用。用饮用水软化食物颗粒。在一个小培养皿中装满饮用水，并将其也带到笼子的地板上。
3. 在接下来的 48 小时内，每 24 小时腹膜内注射 0.25 mL 盐水和丁丙诺啡 （0.5 mg/kg）。

结果

术中或术后 MRI 扫描，特别是灌注加权成像 （PWI） 和/或弥散加权成像 （DWI） 扫描（图 2）可以提供手术成功的明确证据。术中 PWI 显示同侧 MCA 区域严重缺血，从而证实细丝放置导致完全闭塞。成功手术的术后 PWI 显示病灶核心高灌注，以及 MCA 区域边界有一定程度的再灌注。术中 DWI 病灶对应于术中 PWI 上观察到的缺血区域。术后 DWI 病灶向缺血病?...

讨论

MCAO 对操作者来说是一个要求很高的程序，对动物来说是一个使人衰弱的程序。出于这个原因，研究人员拥有一个标准操作程序至关重要，该程序可以最大限度地减少中风的严重程度，减少手术失败，并改善动物术后的健康状况。该 MCAO 协议强调了在鼠标上执行此过程时需要考虑的一些关键方面。

MCAO 细丝的选择会影响诱发的中风病变的大小和位置?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine cutaneous solution 10g/100ml	Alkaloid Skopje	N/A
Braided silk suture	Fine Science Tools	18020-60
Dafilon suture 5/0 DS16	B. Braun	C0936154
Dolokain 20 mg/g gel	Jadran-Galenski Laboratorij	N/A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	2 pieces
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools	11271-30
Dumont N0 self-closing forceps	Fine Science Tools	11480-11
Durapore Surgical Tape 1,25cm x 9,1m	3M	7100057169
Durapore Surgical Tape 2,5cm x 9,1m	3M	7100057168
External thermostat	Petnap	1012536
Halsey needle holders	Fine Science Tools	12500-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Iris scissors	Fine Science Tools	14060-10
Isoflurane USP	Piramal critical care	N/A
Laser Doppler Monitor	Moor	MOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat Pad	Petnap	1012525
Micro Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Mini-colibri retractor	Fine Science Tools	17000-01
Recugel eye ointment	Bausch&Lomb	N/A
S&T B-1 vessel micro clamp	Fine Science Tools	00396-01	2 pieces
S&T micro clamp applying forceps	Fine Science Tools	00071-14
Schwartz micro serrefines	Fine Science Tools	18052-01
Stemi DV4 Spot stereo microscope	Zeiss	000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced Adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm	3M	7100236545
Straight tissue forceps	Fine Science Tools	11023-10
SZX Stand Arm	Olympus	SZ2-STS
Tec III 300 series calibrated vaporizer	Vaporizer Sales and Service inc.	N/A
Universal Stand Type 2	Olympus	SZ2-STU2
VetFlo Six Channel Anesthesia Stand	Kent Scientific	VetFlo-1225	Modified for O2/N2 mixing