Otimização do Método de Oclusão da Artéria Cerebral Média Longa para Reperfusão Completa

Resumo

Este protocolo apresenta um guia passo a passo para os pesquisadores realizarem o procedimento de oclusão da artéria cerebral média em camundongos usando o método modificado da artéria carótida externa Longa. As modificações apresentadas neste artigo visam aumentar a acurácia da oclusão da artéria cerebral média e garantir a reperfusão completa.

Resumo

O modelo de oclusão da artéria cerebral média serve como modelo animal primário para o estudo do AVC isquêmico. Apesar de ser utilizado em pesquisas há mais de três décadas, sua padronização permanece inadequada. Predominantemente realizado em ratos e camundongos, o procedimento apresenta desafios devido à natureza menor e mais frágil dos camundongos. Ao contrário do método da artéria carótida comum de Koizumi, a artéria carótida externa Longa é o único modelo de AVC de filamento intraluminal que garante a reperfusão completa pós-isquemia. Esse aspecto tem importância crítica para estudos que investigam fenômenos de reperfusão. As modificações cirúrgicas demonstradas neste artigo garantem o fluxo sanguíneo contínuo da artéria carótida comum durante toda a fase isquêmica e após o início da reperfusão. O objetivo dessas modificações é ocluir seletivamente a artéria cerebral média, mantendo a perfusão ininterrupta em ramos proximais à artéria cerebral média durante o período de isquemia. Além disso, o início da reperfusão é súbito e pode ser controlado com precisão, modelando com mais precisão a trombectomia endovascular na medicina humana. Nosso objetivo ao apresentar este artigo em vídeo abrangente é facilitar o treinamento de novos cirurgiões e promover a padronização dos procedimentos cirúrgicos dentro da comunidade científica.

Introdução

O acidente vascular cerebral é a segunda principal causa de morte e a terceira principal causa de morte e incapacidade combinadas¹. Por sua causa, o AVC pode ser isquêmico ou hemorrágico, sendo o AVC isquêmico significativamente mais prevalente na prática clínica. O AVC isquêmico surge de um bloqueio em uma artéria que fornece sangue ao tecido cerebral, levando à isquemia, morte celular e inflamação. Desde o advento das terapias de reperfusão, como trombólise e trombectomia mecânica, um grande avanço foi feito no tratamento do AVC. No entanto, todas as terapias de reperfusão apresentam o risco de exacerbar a condição do paciente, causando o que é comumente referido como lesão de reperfusão². O mecanismo exato da lesão de reperfusão permanece obscuro, cabendo aos estudos pré-clínicos identificar possíveis causas e medidas preventivas. Para isso, o desenvolvimento de um modelo animal pertinente para lesão de reperfusão após AVC isquêmico torna-se crucial.

A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é o modelo animal mais comumente usado para estudar o AVC isquêmico. É conduzido predominantemente em roedores e tem muitas variantes diferentes descritas na literatura científica até o momento ^3,4. Os dois tipos principais, Koizumi e Longa, conhecidos como variantes da artéria carótida comum (ACC) e da artéria carótida externa (AEC), diferem tecnicamente pelo local da arteriotomia para inserção do^filamento5,6. Em nosso artigo recente, por meio do monitoramento in vivo da perfusão vascular, mostramos que apenas o método de Longa pode ser verdadeiramente considerado um modelo de isquemia/reperfusão cerebral⁷. O procedimento envolve a inserção do filamento no ECA, avançando-o através do ICA e prendendo-o no ponto de ramificação da artéria cerebral média (MCA) para induzir a isquemia do tecido cerebral. Após um período pré-determinado de isquemia, a retirada do filamento permite a reperfusão, simulando isquemia cerebral transitória. Após o início do AVC, a variável de desfecho primário usada na pesquisa é na maioria das vezes o volume da lesão infartada, que pode ser medido usando histologia ex vivo ou exames cerebrais in vivo. Os desafios nos modelos MCAO giram em torno da baixa reprodutibilidade atribuída a variâncias intervariantes, interoperadores e intersujeitos, com esta última apresentando uma limitação significativa na pesquisa pré-clínica de AVC⁴.

Além disso, as regiões infartadas após MCAO em roedores são maciças em relação ao tamanho do cérebro do roedor. Além disso, as regiões posteriores do hipocampo do cérebro geralmente são recrutadas para o volume do infarto, apesar de essas regiões serem dependentes principalmente do fluxo sanguíneo da artéria cerebral posterior (PCA), e não da ACM⁸. Como nos métodos de Koizumi e Longa descritos na literatura, a ACC é mantida ligada durante o período de isquemia devido à permeabilidade incompleta do círculo de Willis em camundongos, levando à indução de isquemia em uma região muito mais ampla do que o pretendido ^5,6,9. Mesmo em métodos em que a ACC é reaberta ou reparada após o período de isquemia, os habituais 30-60 min de isquemia resultam em lesão tecidual irreversível em regiões não MCA¹⁰. Além disso, ao contrário do esperado, pesquisas anteriores mostraram que o comprimento do revestimento de silicone de um filamento não tem impacto no tamanho da lesão¹¹. No entanto, a escolha do comprimento do revestimento de silicone do filamento foi abordada apenas em modelos com CCA ligado durante o período de oclusão.

O objetivo deste método foi modificar o método Longa MCAO em camundongos para permitir o fluxo sanguíneo ininterrupto da ACC durante o período de isquemia, aumentando assim a seletividade da MCAO, bem como garantindo a reperfusão completa da região infartada após o procedimento. Essas modificações beneficiariam muito os estudos longitudinais que pesquisam a lesão de isquemia-reperfusão em camundongos, diminuindo a taxa de mortalidade e reduzindo a variância entre os sujeitos.

Protocolo

Todo o manejo e procedimentos dos animais foram aprovados pelo Comitê de Licenciamento de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Zagreb e pelo Comitê de Ética para a proteção de animais usados para fins científicos do Ministério da Agricultura da República da Croácia. Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com a Lei Croata de Proteção Animal (NN 102/17, 32/19), Emendas à Lei de Proteção Animal (NN 37/13) e as Diretrizes sobre a Proteção de Animais Usados para Fins Científicos (NN 55/13) que estão de acordo com o Guia Europeu para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Diretiva 2010/63/UE).

1. Preparação do animal e do sítio cirúrgico

1. Colocar o animal em uma caixa knock-out e induzir a anestesia com 5% de isoflurano em uma mistura de oxigênio/nitrogênio (proporção 1:2).
2. Depois de inspecionar visualmente o estado de consciência e a frequência respiratória do animal, leve-o a uma balança de laboratório e pese-o.
3. Verifique o reflexo beliscando a pele interdigital de um membro inferior para garantir a profundidade adequada da anestesia.
4. Posicione o animal na mesa de operação aquecida e coloque o nariz na máscara de anestesia. Defina a temperatura inicial da mesa de operação para 36 °C e ajuste-a para manter a temperatura corporal do animal em 37 °C (medida por meio de uma sonda retal introduzida em etapas posteriores). Ao longo de todas as etapas subsequentes, ajuste a fração de volume do isoflurano para manter a frequência respiratória do animal em 100 respirações / min.
   NOTA: Todas as superfícies e materiais em contato direto com o animal devem ser desinfetados completamente antes do procedimento.
5. Aplique pomada ocular nos olhos do animal para protegê-los da desidratação e do gás isoflurano.
6. Vire o animal de costas e estenda o pescoço colocando um pequeno travesseiro feito de fita cirúrgica embaixo dele.
7. Prenda os membros do animal no lugar usando fita cirúrgica. Tome cuidado para não estender muito os membros anteriores para não causar luxação da articulação do ombro inadvertidamente.
8. Lubrifique a sonda retal usando vaselina branca e insira-a no reto para medição contínua da temperatura corporal. Prenda a sonda no lugar junto com a cauda usando fita cirúrgica.
9. Aplicar uma injeção pré-operatória de solução salina e buprenorfina (0,5 mg/kg) por via intraperitoneal para manter o animal bem hidratado e sob analgesia durante o procedimento.
10. Raspe o pelo do animal na região do pescoço usando uma tosquiadeira sem fio. Colete todo o pelo raspado usando pedaços de fita cirúrgica. Além disso, raspe a região com uma navalha para deixá-la completamente livre de pelos.
11. Escolha um filamento MCAO com base no peso e/ou idade do animal medido. Retire-o do recipiente e coloque-o em uma placa de Petri em local visível. Coloque uma gota de solução salina na parte de silicone do filamento para mantê-lo limpo e livre de poeira.
    NOTA: A espessura do revestimento de silicone do filamento deve ser escolhida de acordo com as recomendações oficiais do fabricante no caso de um mouse de 12 a 16 semanas. Além disso, o comprimento do revestimento de silicone deve ser cuidadosamente planejado com antecedência, dependendo do tamanho da área de irrigação a ser ocluída (consulte Discussão).
12. Coloque uma cortina cirúrgica limpa sobre a mesa de operação.
13. Aplique uma gota de Betadine na pele raspada do animal. Use um cotonete para esfregar o desinfetante na pele de forma circular de dentro para fora. Depois, faça o mesmo com um cotonete embebido em etanol. Repita esta etapa 3 vezes com um novo par de cotonetes estéreis para cada repetição.
14. Aplique um pouco de gel de lidocaína na região desinfetada do futuro local da incisão para analgesia local da ferida.

2. Cirurgia de indução de isquemia

1. Faça uma incisão inicial na pele desinfetada usando um bisturi. Mantenha o número de golpes de incisão na pele no mínimo para facilitar a cicatrização da ferida cirúrgica.
   NOTA: Todos os instrumentos devem ter sido previamente esterilizados. O leitor deve consultar suas diretrizes institucionais para o uso de luvas estéreis ou cirúrgicas.
2. Usando pinças tipo 7 e 5, rasgue a fáscia superficial e descole as glândulas salivares do tecido subjacente.
   NOTA: Sempre avance com uma pinça fechada e estenda-a enquanto se afasta para afastar o tecido. Dessa forma, os espaços anatômicos podem ser percorridos com o mínimo de trauma tecidual.
3. Coloque o afastador de fio em sua posição inicial, garantindo que as glândulas salivares não interfiram nas etapas subsequentes.
4. Remova a fáscia profunda do pescoço usando uma pinça Tipo 7 e descole os músculos esternocleidomastóideos da região carotídea para reposicionar o afastador.
5. Reposicione o afastador para alcançar os músculos esternocleidomastóideos para permitir o acesso à região carotídea.
6. Ressece o músculo omo-hióideo para permitir uma visão clara e uma abordagem mais fácil da região carotídea.
7. Liberte a artéria carótida e seus ramos da veia carótida e do nervo vago, que são mantidos juntos na fáscia carotídea.
   NOTA: Esta fáscia deve ser removida com cuidado para evitar ferir o nervo vago ou causar sangramento significativo.
   1. Aperte a fáscia carotídea na lateral da tríade carotídea e puxe-a suavemente lateralmente para identificar visualmente a artéria, o nervo, a veia e todos os ramos dos vasos sanguíneos circundantes.
   2. Enquanto puxa a fáscia lateralmente, usando uma pinça Tipo 5, separe a ACC do nervo e veia adjacentes até o ponto de ramificação e a veia tireoidiana superior, que cruza a ACC.
   3. Separe completamente a parte inferior do CCA do tecido subjacente e da fáscia, usando uma pinça curva Tipo 7, certificando-se de que esteja pronta para clampear em etapas futuras.
   4. Procedendo cranialmente na região acima do ponto de ramificação do CCA, rasgue a fáscia carotídea usando duas pinças.
   5. Da mesma forma, puxe a extremidade solta da fáscia carotídea medial e lateralmente para separar com precisão a ECA e a artéria carótida interna (ACI) da fáscia e do tecido circundante, respectivamente.
   6. Libere a ECA e a ACI do tecido subjacente usando uma pinça curva Tipo 7.
8. Com o CCA cuidadosamente preparado com seus dois respectivos ramos, levante o ECA usando uma pinça curva tipo 7 e prenda-o com uma pinça de fechamento automático tipo N0.
9. Abaixe a pinça de fechamento automático tipo N0 com cuidado na mesa de operação.
   NOTA: Para reposicionar o clampponto de ECA, às vezes é necessário soltar levemente a alça e empurrar o ponto de ramificação ECA caudalmente. Neste ponto, é importante garantir que mais de 1 mm de ECA permaneça entre o clampeamento ECA e o ponto de ramificação.
10. Com o ECA preso e preso firmemente com uma pinça tipo N0, introduza dois fios de seda trançados atrás do ECA.
    NOTA: A rosca craniana fará o nó de ligadura e deve ser colocada cranialmente a partir do local de fixação.
11. Amarre o fio craniano completamente, pois é permanente, e prenda o excesso de fio com uma tesoura.
12. Amarre o fio caudal em um nó solto.
    NOTA: Deve ser colocado próximo ao ponto de ramificação ECA e mantido solto para a passagem do filamento MCAO.
13. Usando microclipes vasculares, clampeie o CCA e o ICA para evitar sangramento após a arteriotomia.
    NOTA: É crucial garantir que o microclipe aplicado ao CCA tenha uma pegada forte o suficiente, pois o CCA é uma artéria pulsante de alto rendimento, e não fazê-lo pode resultar em sangramento abundante e morte do animal nas etapas posteriores.
14. Usando uma tesoura de micro-mola, faça uma pequena arteriotomia logo abaixo do local de fixação do ECA.
    NOTA: A arteriotomia precisa ser grande o suficiente para que a parte de silicone do filamento entre, mas não maior que a metade da circunferência do ECA para não comprometer a tensão mantida pela pinça tipo N0.
15. Com um ângulo correspondente ao do ECA, insira o filamento no local da arteriotomia em uma direção proximal ao CCA, passando pelo nó de fixação frouxo no local de ramificação do ECA e aderindo ao lúmen do CCA com o filamento.
16. Aperte o nó de fixação ao redor da parte de silicone do filamento.
    NOTA: É necessário muito cuidado neste ponto, pois o filamento tende a escorregar para fora do ECA na metade da última manobra, e colocá-lo de volta nesse ponto é muito difícil.
17. Abra cuidadosamente o microclipe ICA e remova-o.
18. Com o filamento parcialmente inserido no ECA e preso, faça uma arteriotomia completa, soltando assim o coto do ECA com o filamento MCAO dentro. Neste ponto, solte a pinça de fechamento automático tipo N0 e remova-a.
19. Com um conjunto de pinças tipo 5, aperte firmemente o coto ECA e levante-o ligeiramente. Enquanto segura o filamento parcialmente inserido com outra pinça, abaixe e puxe suavemente o coto ECA para orientar a extremidade interna do filamento em direção ao ICA. Nunca aperte a parte de silicone do filamento.
20. Com uma pinça segurando o filamento, avance lentamente o filamento através do ICA em direção ao círculo de Wills.
    NOTA: O primeiro ponto de ramificação do ICA também é o único em que o operador pode perder o ponto de ramificação MCA desejado. Portanto, é necessário um ligeiro ângulo lateral de avanço para guiar o filamento até o ponto de ramificação do MCA. Com o leve ângulo lateral de avanço, o filamento se curva para longe da artéria pterigopalatina (APP) e torna a extremidade em avanço mais propensa a entrar no círculo de Willis (Figura 1).

Figura 1: Uma ilustração do avanço do filamento de oclusão da artéria cerebral média além do ponto de ramificação da artéria pterigopalatina. O avanço adequado do filamento (à esquerda) é obtido orientando o filamento MCAO de tal forma que ele se apoie na parede lateral do ICA e se curve para longe do ponto de ramificação do PPA. Não fazer isso (à direita) pode resultar na entrada do filamento no PPA e não causar acidente vascular cerebral. Neste último caso, o filamento não será capaz de avançar tanto quanto deveria e o cirurgião deve retirar o filamento até que sua extremidade se torne visível no ponto de ramificação da ACI e começar a avançar o filamento novamente. As artérias de cor verde representam artérias comunicantes posteriores (PcomA), principalmente não patentes em camundongos. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

21. Avance lentamente o filamento MCAO através do círculo de Willis até sentir um aumento repentino na resistência.
    NOTA: Neste ponto, é importante observar o comprimento restante do filamento. O filamento deve avançar sem esforço a pelo menos 7 mm do ponto de ramificação ICA em um camundongo adulto.
22. Aperte o nó de fixação para garantir que o filamento não seja deslocado durante a isquemia.
23. Remova o clipe CCA e anote a hora.
    NOTA: Isso marca o início do início da isquemia.
24. Compacte a extremidade solta do filamento MCAO no sulco entre o triângulo carotídeo e o músculo esternocleidomastóideo ipsilateral para que não se projete para fora da ferida cirúrgica.
25. Remova o afastador de fio e aproxime as bordas da ferida cirúrgica. Deixe o local cirúrgico assentar por alguns segundos para que o tecido retorne à sua posição anatômica.
26. Feche a ferida cirúrgica usando fechos de fita adesiva para facilitar a reabertura mais rápida da ferida após o período de isquemia.
    NOTA: Se um pesquisador deseja deixar o animal acordar durante o período de isquemia, recomenda-se suturar a ferida para evitar a reabertura prematura da ferida.

3. Período de isquemia

1. Valide o sucesso da cirurgia usando ressonância magnética ou algum outro método quantitativo de medição de perfusão.
   NOTA: No caso de fazer uma ressonância magnética, a imagem ponderada em perfusão (PWI) deve mostrar isquemia crítica na região ampla da MCA e a imagem ponderada em difusão (DWI) deve delinear o local do coeficiente de difusão aparente (ADC) reduzido devido ao edema celular.
2. Coloque o animal em uma gaiola limpa até que o período de isquemia termine.

4. Cirurgia de retirada de filamento

1. Aproximadamente 5 minutos antes do término do tempo de isquemia alocado, posicione o animal e prenda-o novamente na mesa de operação.
2. Remova os fechos da fita e reabra a ferida cirúrgica com o afastador de fio.
3. Liberte a ponta solta do filamento MCAO do tecido circundante e das extremidades da rosca do nó de fixação.
4. Com a pinça tipo N0, aperte e puxe a borda do coto ECA ventralmente para tensioná-lo. Abaixe cuidadosamente a pinça de pinça, semelhante ao primeiro procedimento cirúrgico.
   NOTA: O operador deve evitar apertar o nó de fixação, pois isso fará com que o nó não seja capaz de se desatar.
5. Clamp o CCA novamente com um clipe microvascular.
6. Usando uma pinça tipo 5, afrouxe o nó de fixação para permitir a retirada do filamento.
   NOTA: A melhor maneira de começar a afrouxar o nó é continuar apertando-o até que ele se separe em partes individuais e, em seguida, empurre as pontas da linha em direção ao nó.
7. Retire lentamente o filamento MCAO até que a parte de silicone comece a sair do toco ECA. Aperte ligeiramente o nó de fixação para se preparar para a retirada completa do filamento.
8. Quando estiver perto da extremidade de silicone do filamento, aperte o nó de fixação para que ele empurre o filamento MCAO para fora e feche o coto ECA em uma única manobra. Aperte o nó completamente depois que o filamento escorregar.
9. Abra e remova a pinça de aperto junto com o clipe CCA.
   NOTA: Isso marca o fim do período de isquemia e o início do processo de reperfusão.
10. Remova o afastador de fio e junte as bordas da ferida cirúrgica novamente.
11. Suturar a ferida cirúrgica a partir da periferia, fechando a ferida completamente sem nenhum tecido subjacente visível.
    NOTA: O número de suturas necessárias depende do tamanho da ferida cirúrgica.
12. Limpe e desinfete o local da cirurgia usando lenços umedecidos com álcool.

5. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Coloque o animal em uma gaiola limpa e deixe-o acordar espontaneamente da anestesia.
2. Coloque alimentos peletizados no fundo da gaiola para facilitar o acesso. Amoleça os pellets de alimentos usando água potável. Encha uma pequena placa de Petri com água potável e leve-a também para o chão da gaiola.
3. Nas próximas 48 h, injete 0,25 mL de solução salina com buprenorfina (0,5 mg/kg) a cada 24 h por via intraperitoneal.

Resultados

Exames de ressonância magnética intraoperatórios ou pós-operatórios, especificamente exames de imagem ponderada em perfusão (PWI) e/ou imagem ponderada por difusão (DWI) (Figura 2) podem oferecer prova definitiva de um procedimento bem-sucedido. A PWI intraoperatória mostra isquemia crítica na região da ACM ipsilateral, confirmando que a colocação do filamento resultou em oclusão completa. A PWI pós-operatória de um procedimento bem-sucedido e...

Discussão

O MCAO é um procedimento altamente exigente para o operador e debilitante para o animal. Por esse motivo, é de extrema importância que os pesquisadores tenham um procedimento operacional padrão que minimize a gravidade do AVC, reduza a falha do procedimento e melhore o bem-estar do animal após o procedimento. Este protocolo MCAO destaca alguns dos principais aspectos a serem considerados ao realizar este procedimento em um mouse.

A escolha do filamento M...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine cutaneous solution 10g/100ml	Alkaloid Skopje	N/A
Braided silk suture	Fine Science Tools	18020-60
Dafilon suture 5/0 DS16	B. Braun	C0936154
Dolokain 20 mg/g gel	Jadran-Galenski Laboratorij	N/A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	2 pieces
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools	11271-30
Dumont N0 self-closing forceps	Fine Science Tools	11480-11
Durapore Surgical Tape 1,25cm x 9,1m	3M	7100057169
Durapore Surgical Tape 2,5cm x 9,1m	3M	7100057168
External thermostat	Petnap	1012536
Halsey needle holders	Fine Science Tools	12500-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Iris scissors	Fine Science Tools	14060-10
Isoflurane USP	Piramal critical care	N/A
Laser Doppler Monitor	Moor	MOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat Pad	Petnap	1012525
Micro Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Mini-colibri retractor	Fine Science Tools	17000-01
Recugel eye ointment	Bausch&Lomb	N/A
S&T B-1 vessel micro clamp	Fine Science Tools	00396-01	2 pieces
S&T micro clamp applying forceps	Fine Science Tools	00071-14
Schwartz micro serrefines	Fine Science Tools	18052-01
Stemi DV4 Spot stereo microscope	Zeiss	000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced Adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm	3M	7100236545
Straight tissue forceps	Fine Science Tools	11023-10
SZX Stand Arm	Olympus	SZ2-STS
Tec III 300 series calibrated vaporizer	Vaporizer Sales and Service inc.	N/A
Universal Stand Type 2	Olympus	SZ2-STU2
VetFlo Six Channel Anesthesia Stand	Kent Scientific	VetFlo-1225	Modified for O2/N2 mixing