完全再灌流のためのLonga中大脳動脈閉塞法の最適化

要約

このプロトコルは、研究者が修正されたLonga外部頸動脈法を使用してマウスで中大脳動脈閉塞手順を実行するためのステップバイステップのガイドを提供します。この記事で紹介する変更は、中大脳動脈閉塞の精度を高め、完全な再灌流を確保することを目的としています。

要約

中大脳動脈閉塞モデルは、虚血性脳卒中を研究するための主要な動物モデルとして機能します。30年以上にわたって研究に使用されてきたにもかかわらず、その標準化は依然として不十分です。主にラットとマウスで実施されるこの処置は、マウスの小さくて壊れやすい性質のために課題を提起します。小泉総頸動脈法とは異なり、ロンガ外頸動脈は、虚血後の完全な再灌流を保証する唯一の管腔内フィラメント脳卒中モデルです。この側面は、再灌流現象を調査する研究にとって非常に重要です。この記事で示した外科的変更により、虚血期全体および再灌流開始後も、総頸動脈からの継続的な血流が確保されます。これらの修飾の目標は、虚血期間中に中大脳動脈の近位にある枝で灌流が中断されないようにすることにより、中大脳動脈を選択的に閉塞することです。さらに、再灌流の開始は突然であり、正確に制御できるため、人間の医学における血管内血栓摘出術をより正確にモデル化できます。この包括的なビデオ記事を紹介する目的は、新しい外科医のトレーニングを容易にし、科学コミュニティ内での外科手術の標準化を促進することです。

概要

脳卒中は、死因の第 2 位、死因と障害を合わせて第 3 位にランクされています¹.その原因により、脳卒中は虚血性または出血性である可能性があり、虚血性脳卒中は臨床診療で有意に一般的です。虚血性脳卒中は、脳組織に血液を供給する動脈の閉塞から発生し、虚血、細胞死、炎症を引き起こします。血栓溶解術や機械的血栓摘出術などの再灌流療法の登場以来、脳卒中の治療は大きく進歩しています。しかし、すべての再灌流療法は、一般に再灌流障害^{と呼ばれる}ものを引き起こすことにより、患者の状態を悪化させるリスクを伴います2。再灌流障害の正確なメカニズムは不明のままであり、潜在的な原因と予防策を特定するには前臨床研究にかかっています。そのためには、虚血性脳卒中後の再灌流障害の適切な動物モデルを開発することが重要になります。

中大脳動脈閉塞術 (MCAO) は、虚血性脳卒中の研究に最も一般的に使用される動物モデルです。これは主にげっ歯類で行われ、これまでに科学文献に記載されている多くの異なる変異体があります^3,4。総頸動脈(CCA)および外頸動脈(ECA)バリアントとして知られる2つの主要なタイプ、小泉とロンガは、フィラメント挿入のための動脈切開部位によって技術的に異なる^5,6。私たちの最近の記事では、血管灌流のin vivoモニタリングにより、ロンガ法のみが真に脳虚血/再灌流モデルと見なすことができることを示しました⁷。この手順では、フィラメントをECAに挿入し、ICAを介して前進させ、中大脳動脈(MCA)の分岐点に固定して脳組織の虚血を誘発します。所定の虚血期間の後、フィラメントの抜去により再灌流が可能になり、一過性の脳虚血をシミュレートします。脳卒中発症後、研究で使用される主要なアウトカム変数は、ほとんどの場合、梗塞病変の体積であり、これはex vivo組織学またはin vivo脳スキャンのいずれかを使用して測定できます。MCAOモデルの課題は、異種間、オペレーター間、および被験者間の分散に起因する再現性の低さを中心に展開しており、後者は前臨床脳卒中研究に大きな制限をもたらします⁴。

さらに、げっ歯類のMCAOに続く梗塞領域は、げっ歯類の脳のサイズに比べて巨大です。さらに、脳の海馬後部領域は、^MCA8ではなく、主に後大脳動脈(PCA)からの血流に依存しているにもかかわらず、梗塞容積に動員されることがよくあります。文献に記載されている小泉法とロンガ法の両方と同様に、マウスのウィリスサークルの不完全な開存性のために、CCAは虚血期間中も結紮されたままであり、意図したよりもはるかに広い領域で虚血誘発を引き起こします^5,6,9。虚血期間後にCCAが再開または修復される方法であっても、通常の30〜60分の虚血は、非MCA領域¹⁰で不可逆的な組織損傷をもたらす。さらに、予想に反して、以前の研究では、フィラメントのシリコン被膜の長さが病変サイズ¹¹に影響を与えないことが示されました。しかし、フィラメントのシリコンコーティングの長さの選択は、閉塞期間中にライゲーションされたCCAを搭載したモデルでのみ対応していました。

この方法の目標は、マウスのLonga MCAO法を変更して、虚血期間中にCCAからの血流が途切れないようにすることで、MCAOの選択性を高め、処置後の梗塞領域の完全な再灌流を確保することでした。これらの変更は、死亡率を低下させ、被験者間の分散を減らすことにより、マウスの虚血再灌流障害を研究する縦断的研究に大いに役立つでしょう。

プロトコル

すべての動物の取り扱いと手続きは、ザグレブ大学医学部の倫理ライセンス委員会とクロアチア共和国農業省の科学目的で使用される動物の保護のための倫理委員会によって承認されました。実験手順は、クロアチア動物保護法(NN 102/17、32/19)、動物保護法の改正(NN 37/13)、および科学的目的で使用される動物の保護に関するガイドライン(NN 55/13)に従って実施されました。これは、実験動物のケアと使用に関する欧州ガイド(指令2010/63/EU)に沿ったものです。

1.動物と手術部位の準備

1. 動物をノックアウトボックスに入れ、酸素/窒素混合物(1:2の比率)に5%量のイソフルランを使用して麻酔を誘発します。
2. 動物の意識状態と呼吸周波数を目視で確認した後、実験室のはかりに持ってきて体重を量ります。
3. 下肢の指間皮膚をつまんで反射神経をチェックし、適切な麻酔の深さを確保します。
4. 動物を加熱された手術台に置き、鼻を麻酔マスクに入れます。手術台の初期温度を36°Cに設定し、動物の体温が37°Cに保たれるように調整します(後の手順で導入する直腸プローブを介して測定します)。その後のすべてのステップで、イソフルランの体積分率を調整して、動物の呼吸数を100呼吸/分に保ちます。.
   注:動物と直接接触するすべての表面と材料は、手順の前に徹底的に消毒する必要があります。
5. 動物の目に目の軟膏を塗って、脱水症やイソフルランガスから動物を保護します。
6. 動物を仰向けにし、その下にサージカルテープで作られた小さな枕を置いて首を伸ばします。
7. サージカルテープを使用して動物の手足を所定の位置に固定します。うっかり肩関節脱臼を起こさないように、前肢を伸ばしすぎないように注意してください。
8. ワセスホワイトゼリーを使用して直腸プローブを潤滑し、直腸に挿入して連続体温測定を行います。サージカルテープを使用して、プローブをテールと一緒に所定の位置に固定します。
9. 術前に生理食塩水とブプレノルフィン(0.5 mg / kg)を腹腔内に注射して、動物を十分に水分補給し、処置中に鎮痛下に保ちます。.
10. コードレスの動物用クリッパーを使用して、首の部分の動物の毛皮を剃ります。サージカルテープを使用して、すべての剃った毛皮を収集します。さらに、カミソリでその部分を剃り、毛皮が完全になくなるようにします。
11. 測定した動物の体重や年齢に基づいてMCAOフィラメントを選択します。容器から取り出し、見える場所にあるペトリ皿に入れます。フィラメントのシリコン部分に生理食塩水を一滴垂らして、フィラメントを清潔でほこりのない状態に保ちます。
    注:フィラメントのシリコーンコーティングの厚さは、12〜16週齢のマウスの場合、メーカーの公式推奨に従って選択する必要があります。さらに、シリコーンコーティングの長さは、閉塞する灌漑領域のサイズに応じて、事前に慎重に計画する必要があります( ディスカッションを参照)。
12. 手術台の上に清潔な外科用ドレープを置きます。
13. 動物の剃った皮膚にベタジンを一滴垂らします。綿棒を使用して、消毒剤を内側から外側に円形に皮膚にこすりつけます。その後、エタノールを染み込ませた綿棒で同じことを行います。この手順を3回繰り返し、新しい滅菌綿棒を使用して繰り返します。
14. 局所創傷鎮痛のために、将来の切開部位の消毒された領域にリドカインジェルを軽くたたきます。.

2. 虚血導入手術

1. 消毒した皮膚をメスで切開します。外科的創傷の治癒を容易にするために、皮膚の切開ストロークの数を最小限に抑えてください。
   注意: すべての機器は以前に滅菌されている必要があります。読者は、滅菌手袋または手術用手袋の使用に関する機関のガイドラインを参照する必要があります。
2. タイプ7および5の鉗子を使用して、表在性筋膜を引き裂き、下にある組織から唾液腺を剥離します。
   注意: 常に閉じた鉗子で前進し、組織を押しのけるために離れながら伸ばします。このようにして、解剖学的空間を最小限の組織外傷で横断することができます。
3. ワイヤーリトラクターを初期位置に配置し、唾液腺が後続のステップを妨げないようにします。
4. タイプ7鉗子を使用して首の深い筋膜を切除し、頸動脈領域から胸鎖乳突筋を取り外してリトラクターの位置を変更します。
5. リトラクターを胸鎖乳突筋の下に到達するように再配置して、頸動脈領域へのアクセスを可能にします。
6. 舌骨筋を切除して、頸動脈領域への明確な視覚的で簡単なアプローチを可能にします。
7. 頸動脈とその枝を頸動脈静脈と迷走神経から解放し、これらは頸動脈筋膜に一緒に保持されています。
   注:この筋膜は、迷走神経を傷つけたり、重大な出血を引き起こしたりしないように、慎重に取り外す必要があります。
   1. 頸動脈トライアドの外側にある頸動脈筋膜をつまんで横方向にそっと引っ張ると、動脈、神経、静脈、および周囲のすべての血管枝が視覚的に識別されます。
   2. 筋膜を横方向に引っ張りながら、タイプ5の鉗子を使用して、CCAを隣接する神経と静脈から分岐点とCCAを横切る上甲状腺静脈まで分離します。
   3. 湾曲したタイプ7鉗子を使用して、CCAの下部を下にある組織と筋膜から完全に取り外し、将来のステップでクランプする準備ができていることを確認します。
   4. CCA分岐点の上の領域を頭蓋状に進行し、2つの鉗子を使用して頸動脈筋膜を引き裂きます。
   5. 同様に、頸動脈筋膜の緩い端を内側と横方向に引っ張って、ECAと内頸動脈(ICA)をそれぞれ筋膜と周辺組織から正確に分離します。
   6. 湾曲したタイプ7鉗子を使用して、ECAとICAを基礎となる組織から解放します。
8. CCAを2つのそれぞれの枝で慎重に準備した状態で、湾曲したタイプ7鉗子を使用してECAを持ち上げ、タイプN0自己閉鎖鉗子でクランプします。
9. N0型自動閉鎖鉗子を手術台に慎重に下げます。
   注意: clを再配置するためにampECAのポイントでは、グリップを少し離してECA分岐ポイントを尾側に押す必要がある場合があります。この時点で、ECAクランプと分岐点の間に1mmを超えるECAが残っていることを確認することが重要です。
10. ECAをクランプしてタイプN0ピンセットでしっかりと保持した状態で、ECAの後ろに2本の編組絹糸を導入します。
    注:頭蓋糸は結紮の結び目になり、クランプ部位から頭蓋状に配置する必要があります。
11. 頭蓋糸は永久的なものであるため、完全に縛り、余分な糸をハサミで切り取ります。
12. 尾側の糸を緩い固定結び目に結びます。
    注意: ECA分岐点の近くに置き、MCAOフィラメントが通過するように緩めておく必要があります。
13. 血管マイクロクリップを使用して、CCAをクランプし、ICAを閉じて、動脈切開後の出血を防ぎます。
    注:CCAは脈動するハイスループット動脈であり、そうしないと後のステップで大量の出血や動物の死につながる可能性があるため、CCAに適用されるマイクロクリップが十分に強力にグリップしていることを確認することが重要です。
14. マイクロスプリングハサミを使用して、ECAクランプ部位の真下に小さな動脈切開を行います。
    注:動脈切開術は、フィラメントのシリコン部分が入るのに十分な大きさである必要がありますが、N0型鉗子が保持する張力を損なわないように、ECA円周の半分を超えてはなりません。
15. ECAの角度と一致する角度で、フィラメントをCCAの近位方向に開動脈切開部位に挿入し、ECAの分岐部位の緩い固定結び目を通過し、フィラメントでCCAの内腔に突き刺さります。
16. フィラメントのシリコン部分の周りの固定結び目を締めます。
    注:フィラメントは最後の操作の途中でECAから滑り落ちる傾向があり、その時点でフィラメントを元に戻すのは非常に難しいため、この時点では細心の注意が必要です。
17. ICAマイクロクリップを慎重に開いて取り外します。
18. フィラメントをECAに部分的に挿入して固定した状態で、完全な動脈切開を行い、MCAOフィラメントを内部に含めてECAの切り株を緩めます。この時点で、タイプN0自閉鉗子を放し、取り外します。
19. タイプ5ピンセット1セットでECAの切り株をしっかりとつまんで少し上げます。部分的に挿入されたフィラメントを別の鉗子で保持しながら、ECA切り株を下げてそっと引っ張り、フィラメントの内側の端をICAに向けます。フィラメントのシリコン部分を挟まないでください。
20. 鉗子をフィラメントにつかんだ状態で、フィラメントをICAを通ってゆっくりと意志の輪に向かって進めます。
    注:ICAの最初の分岐ポイントは、オペレーターが目的のMCA分岐ポイントを見逃すことができる唯一の分岐ポイントでもあります。したがって、フィラメントをMCA分岐点に導くためには、わずかな横方向の前進角度が必要です。横方向の進行角度がわずかに小さいと、フィラメントは翼状口蓋動脈(PPA)から離れて湾曲し、前進端がウィリスの円に入る可能性が高くなります(図1)。

図1:翼状口蓋動脈の分岐点を過ぎた中大脳動脈閉塞フィラメントの進行の図。 適切なフィラメントの前進(左側)は、MCAOフィラメントがICAの側壁に逆らい、PPA分岐点から離れるように方向を変えることによって達成されます。そうしないと(右側)、フィラメントがPPAに入り込み、脳卒中を引き起こさなくなる可能性があります。後者の場合、フィラメントは必要なところまで進むことができず、外科医はICA分岐点でフィラメントの端が見えるまでフィラメントを引き抜き、フィラメントを再び前進させ始める必要があります。緑色の動脈は後部連通動脈(PcomA)を表し、マウスではほとんどが非特許です。BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

21. MCAOフィラメントをウィリスの円をゆっくりと進め、抵抗が急激に増加するのを感じます。
    注意: この時点で、フィラメントの残りの長さを観察することが重要です。フィラメントは、成体マウスのICA分岐点から少なくとも7mm離れて楽に進む必要があります。
22. 虚血中にフィラメントがずれないように、固定結び目を締めます。
23. CCAクリップを取り外し、時間を書き留めます。
    注:これは虚血の発症の始まりを示しています。
24. MCAOフィラメントの緩い端を頸動脈三角形と同側の胸鎖乳突筋の間の溝に詰めて、手術創からはみ出さないようにします。
25. ワイヤーリトラクターを取り外し、手術創の端を互いに近づけます。組織が解剖学的位置に戻るまで、手術部位を数秒間落ち着かせます。
26. テープ創傷閉鎖を使用して外科的創傷を閉じ、虚血期間後の創傷の迅速な再開を促進します。
    注:研究者が虚血期間中に動物を目覚めさせたい場合は、創傷の時期尚早な再開を防ぐために創傷を縫合することをお勧めします。

3. 虚血期

1. MRIまたはその他の定量的灌流測定方法を使用して、手術の成功を検証します。
   注: MRI スキャンを行う場合、灌流強調イメージング (PWI) は広い MCA 領域で重大な虚血を示す必要があり、拡散強調イメージング (DWI) は、細胞浮腫による見かけの拡散係数 (ADC) の低下した部位を概説する必要があります。
2. 虚血期間が終了するまで、動物を清潔なケージに入れます。

4.フィラメント抜去手術

1. 割り当てられた虚血時間が終了する約5分前に、動物を位置決めし、再び手術台に固定します。
2. テープ創傷のクロージャーを取り外し、ワイヤーリトラクターで外科的創傷を再度開きます。
3. MCAOフィラメントの緩い端を周囲の組織と固定結び目の端から解放します。
4. タイプN0鉗子では、ECA切り株の端をつまんで腹側に引っ張り、張力をかけます。最初の外科的処置と同様に、つまむ鉗子を慎重に下げます。
   注意: オペレーターは、結び目をほどくことができなくなるため、固定結び目をつまむことを避ける必要があります。
5. CCAを再度クランプしますamp微小血管クリップで。
6. タイプ5鉗子を使用して、固定結び目を緩め、フィラメントの引き抜きを可能にします。
   注:結び目を緩め始める最良の方法は、結び目が個々のパーツに分離するまでつまみ続けてから、糸の端を結び目に向かって押すことです。
7. シリコン部分がECAの切り株から突き出始めるまで、MCAOフィラメントをゆっくりと引き抜きます。固定結び目を少し締めて、フィラメントを完全に引き抜く準備をします。
8. フィラメントのシリコン端に近づいたら、固定結び目を締めて、MCAOフィラメントを押し出し、ECA切り株を1回で閉じるようにします。フィラメントが滑り落ちたら、結び目を完全に締めます。
9. つまむ鉗子をCCAクリップと一緒に開いて取り外します。
   注:これは虚血期間の終了と再灌流プロセスの開始を示します。
10. ワイヤーリトラクターを取り外し、手術創の端を再び一緒にします。
11. 外科的創傷を末梢から縫合し、下にある組織が見えないように創傷を完全に閉じます。
    注:必要な縫合糸の数は、外科的創傷のサイズによって異なります。
12. 消毒用アルコールワイプを使用して手術部位を洗浄し、消毒します。

5. 術後ケア

1. 動物を清潔なケージに入れ、麻酔から自然に目覚めさせます。
2. ペレット状の食品をケージの底に置いて、手が届きやすくします。飲料水を使用して食品ペレットを柔らかくします。小さなシャーレに飲料水を入れ、ケージの床にも持って行きます。
3. 次の48時間で、腹腔内に24時間ごとに0.25 mLの生理食塩水にブプレノルフィン(0.5 mg / kg)を注射します。.

結果

術中または術後のMRIスキャン、特に灌流強調イメージング(PWI)および/または拡散強調イメージング(DWI)スキャン(図2)は、成功した手順の決定的な証拠を提供できます。術中 PWI は、同側 MCA 領域に重大な虚血を示し、フィラメントの配置が完全な閉塞をもたらしたことが確認されています。成功した手順の術後PWIは、病変の中心に過剰灌流を示し...

ディスカッション

MCAOは、オペレーターにとって非常に要求の厳しい手順であり、動物にとっては衰弱させる手順です。このため、研究者は、脳卒中の重症度を最小限に抑え、処置の失敗を減らし、処置後の動物の健康状態を改善する標準的な操作手順を持つことが最も重要です。このMCAOプロトコルは、マウスでこの手順を実行する際に考慮すべき重要な側面のいくつかを強調してい?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine cutaneous solution 10g/100ml	Alkaloid Skopje	N/A
Braided silk suture	Fine Science Tools	18020-60
Dafilon suture 5/0 DS16	B. Braun	C0936154
Dolokain 20 mg/g gel	Jadran-Galenski Laboratorij	N/A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	2 pieces
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools	11271-30
Dumont N0 self-closing forceps	Fine Science Tools	11480-11
Durapore Surgical Tape 1,25cm x 9,1m	3M	7100057169
Durapore Surgical Tape 2,5cm x 9,1m	3M	7100057168
External thermostat	Petnap	1012536
Halsey needle holders	Fine Science Tools	12500-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Iris scissors	Fine Science Tools	14060-10
Isoflurane USP	Piramal critical care	N/A
Laser Doppler Monitor	Moor	MOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat Pad	Petnap	1012525
Micro Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Mini-colibri retractor	Fine Science Tools	17000-01
Recugel eye ointment	Bausch&Lomb	N/A
S&T B-1 vessel micro clamp	Fine Science Tools	00396-01	2 pieces
S&T micro clamp applying forceps	Fine Science Tools	00071-14
Schwartz micro serrefines	Fine Science Tools	18052-01
Stemi DV4 Spot stereo microscope	Zeiss	000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced Adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm	3M	7100236545
Straight tissue forceps	Fine Science Tools	11023-10
SZX Stand Arm	Olympus	SZ2-STS
Tec III 300 series calibrated vaporizer	Vaporizer Sales and Service inc.	N/A
Universal Stand Type 2	Olympus	SZ2-STU2
VetFlo Six Channel Anesthesia Stand	Kent Scientific	VetFlo-1225	Modified for O2/N2 mixing