Optimización del método de oclusión de la arteria cerebral media de Longa para la reperfusión completa

Resumen

Este protocolo presenta una guía paso a paso para que los investigadores realicen el procedimiento de oclusión de la arteria cerebral media en ratones utilizando el método modificado de la arteria carótida externa de Longa. Las modificaciones presentadas en este artículo tienen como objetivo aumentar la precisión de la oclusión de la arteria cerebral media y asegurar una reperfusión completa.

Resumen

El modelo de oclusión de la arteria cerebral media sirve como modelo animal primario para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico. A pesar de haberse utilizado en la investigación durante más de tres décadas, su estandarización sigue siendo inadecuada. El procedimiento, que se lleva a cabo principalmente en ratas y ratones, plantea desafíos debido a la naturaleza más pequeña y frágil de los ratones. A diferencia del método de la arteria carótida común de Koizumi, la arteria carótida externa de Longa es el único modelo de carrera de filamento intraluminal que garantiza una reperfusión completa después de la isquemia. Este aspecto tiene una importancia crítica para los estudios que investigan los fenómenos de reperfusión. Las modificaciones quirúrgicas demostradas en este artículo aseguran un flujo sanguíneo continuo desde la arteria carótida común durante toda la fase isquémica y después del inicio de la reperfusión. El objetivo de estas modificaciones es ocluir selectivamente la arteria cerebral media manteniendo la perfusión ininterrumpida en las ramas proximales a la arteria cerebral media durante el período de isquemia. Además, el inicio de la reperfusión es brusco y puede controlarse con precisión, lo que permite modelar con mayor precisión la trombectomía endovascular en medicina humana. Nuestro objetivo al presentar este completo videoartículo es facilitar la formación de nuevos cirujanos y promover la estandarización de los procedimientos quirúrgicos dentro de la comunidad científica.

Introducción

El accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte y la tercera causa de muerte y discapacidad combinadas¹. Por su causa, el ictus puede ser isquémico o hemorrágico, siendo el ictus isquémico significativamente más prevalente en la práctica clínica. El accidente cerebrovascular isquémico surge de una obstrucción en una arteria que suministra sangre al tejido cerebral, lo que provoca isquemia, muerte celular e inflamación. Desde el advenimiento de las terapias de reperfusión, como la trombólisis y la trombectomía mecánica, se han realizado grandes avances en el tratamiento del accidente cerebrovascular. Sin embargo, todas las terapias de reperfusión conllevan el riesgo de exacerbar la condición del paciente al causar lo que comúnmente se conoce como lesión por reperfusión². El mecanismo exacto de la lesión por reperfusión sigue sin estar claro, y depende de los estudios preclínicos identificar las posibles causas y las medidas preventivas. Para ello, es crucial desarrollar un modelo animal pertinente para la lesión por reperfusión que sigue a un accidente cerebrovascular isquémico.

La oclusión de la arteria cerebral media (MCAO, por sus siglas en inglés) es el modelo animal más utilizado para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico. Se lleva a cabo predominantemente en roedores y tiene muchas variantes diferentes descritas en la literatura científica hasta el momento ^3,4. Los dos tipos principales, Koizumi y Longa, conocidos como variantes de la arteria carótida común (ACC) y de la arteria carótida externa (ECA), difieren técnicamente por el sitio de la arteriotomía para la inserción del filamento ^5,6. En nuestro reciente artículo, mediante la monitorización in vivo de la perfusión vascular, demostramos que solo el método de Longa puede considerarse realmente un modelo de isquemia/reperfusión cerebral⁷. El procedimiento consiste en insertar el filamento en el ECA, hacerlo avanzar a través del ICA y asegurarlo en el punto de ramificación de la arteria cerebral media (MCA) para inducir la isquemia del tejido cerebral. Después de un período predeterminado de isquemia, la retirada del filamento permite la reperfusión, simulando una isquemia cerebral transitoria. Después del inicio del accidente cerebrovascular, la variable de resultado principal utilizada en la investigación suele ser el volumen de la lesión infartada, que puede medirse mediante histología ex vivo o gammagrafías cerebrales in vivo. Los desafíos en los modelos de MCAO giran en torno a la baja reproducibilidad atribuida a las varianzas intervariantes, interoperatorias e intersujetos, y estas últimas plantean una limitación significativa en la investigación preclínica del ictus⁴.

Además, las regiones infartadas que siguen a la MCAO en roedores son enormes en relación con el tamaño del cerebro del roedor. Además, las regiones posteriores del hipocampo del cerebro a menudo se reclutan en el volumen del infarto, a pesar de que esas regiones dependen principalmente del flujo sanguíneo de la arteria cerebral posterior (PCA) y no de la MCA⁸. Al igual que en los métodos de Koizumi y Longa descritos en la literatura, el CCA se mantiene ligado durante el período de isquemia debido a la permeabilidad incompleta del círculo de Willis en ratones, lo que lleva a la inducción de la isquemia en una región mucho más amplia de lo previsto ^5,6,9. Incluso en los métodos en los que el ACC se reabre o se repara después del período de isquemia, los 30-60 min habituales de isquemia dan lugar a una lesión tisular irreversible en las regiones no MCA¹⁰. Además, contrariamente a lo esperado, investigaciones anteriores mostraron que la longitud del recubrimiento de silicona de un filamento no tiene ningún impacto en el tamaño de la lesión¹¹. Sin embargo, la elección de la longitud del recubrimiento de silicona del filamento se abordó únicamente en modelos con CCA ligado durante el período de oclusión.

El objetivo de este método fue modificar el método de Longa MCAO en ratones para permitir el flujo sanguíneo ininterrumpido desde el CCA durante el período de isquemia, aumentando así la selectividad del MCAO, así como asegurando la reperfusión completa de la región infartada después del procedimiento. Estas modificaciones beneficiarían en gran medida a los estudios longitudinales que investigan la lesión por isquemia-reperfusión en ratones, ya que disminuirían la tasa de mortalidad y la varianza entre sujetos.

Protocolo

Todo el manejo y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zagreb y el Comité de Ética para la protección de los animales utilizados con fines científicos del Ministerio de Agricultura de la República de Croacia. Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Protección Animal de Croacia (NN 102/17, 32/19), las Enmiendas a la Ley de Protección Animal (NN 37/13) y las Directrices sobre la Protección de los Animales Utilizados con Fines Científicos (NN 55/13) que están en línea con la Guía Europea para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Directiva 2010/63/UE).

1. Preparación del animal y del sitio quirúrgico

1. Coloque al animal en una caja perforadora e induzca la anestesia utilizando un volumen de isoflurano al 5% en una mezcla de oxígeno y nitrógeno (proporción 1:2).
2. Después de inspeccionar visualmente el estado de conciencia y la frecuencia respiratoria del animal, llévelo a una báscula de laboratorio y péselo.
3. Verifique el reflejo pellizcando la piel interdigital de una extremidad inferior para asegurar la profundidad adecuada de la anestesia.
4. Coloque al animal en la mesa de operaciones calentada y lleve su nariz dentro de la máscara de anestesia. Ajuste la temperatura inicial de la mesa de operaciones a 36 °C y ajústela para mantener la temperatura corporal del animal a 37 °C (medida a través de una sonda rectal introducida en pasos posteriores). A lo largo de todos los pasos posteriores, ajuste la fracción de volumen de isoflurano para mantener la frecuencia respiratoria del animal en 100 respiraciones/min.
   NOTA: Todas las superficies y materiales en contacto directo con el animal deben desinfectarse a fondo antes del procedimiento.
5. Aplique ungüento ocular en los ojos del animal para protegerlos de la deshidratación y el gas isoflurano.
6. Coloque al animal boca arriba y extienda su cuello colocando una pequeña almohada hecha de cinta quirúrgica debajo.
7. Asegure las extremidades del animal en su lugar con cinta quirúrgica. Tenga cuidado de no extender demasiado las extremidades anteriores para no causar una dislocación inadvertida de la articulación del hombro.
8. Lubrique la sonda rectal con jalea blanca de petróleo e insértela en el recto para una medición continua de la temperatura corporal. Asegure la sonda en su lugar junto con la cola con cinta quirúrgica.
9. Aplicar una inyección preoperatoria de suero fisiológico y buprenorfina (0,5 mg/kg) por vía intraperitoneal para mantener al animal bien hidratado y bajo analgesia durante el procedimiento.
10. Afeita el pelaje del animal en la región del cuello con un cortaanimales inalámbrico. Recoja todo el pelaje afeitado con pedazos de cinta quirúrgica. Además, afeita la región con una navaja de afeitar para que quede completamente libre de pelo.
11. Elija un filamento MCAO en función del peso y/o la edad del animal medido. Sácalo de su recipiente y colócalo en una placa de Petri en un lugar visible. Pon una gota de solución salina en la parte de silicona del filamento para mantenerlo limpio y libre de polvo.
    NOTA: El grosor del recubrimiento de silicona del filamento debe elegirse de acuerdo con las recomendaciones oficiales del fabricante en el caso de un ratón de 12 a 16 semanas. Además, la longitud del recubrimiento de silicona debe planificarse cuidadosamente con anticipación, dependiendo del tamaño del área de riego que se va a ocluir (ver Discusión).
12. Coloque un paño quirúrgico limpio sobre la mesa de operaciones.
13. Aplica una gota de Betadine sobre la piel afeitada del animal. Use un hisopo de algodón para frotar el desinfectante en la piel de manera circular desde adentro hacia afuera. Después, haz lo mismo con un bastoncillo de algodón empapado en etanol. Repita este paso 3 veces con un par de hisopos de algodón estériles para cada repetición.
14. Aplique un poco de gel de lidocaína en la región desinfectada del sitio de la futura incisión para la analgesia local de la herida.

2. Cirugía de inducción de isquemia

1. Realice una incisión inicial en la piel desinfectada con un bisturí. Mantenga el número de incisiones en la piel al mínimo para facilitar la cicatrización de la herida quirúrgica.
   NOTA: Todos los instrumentos deben haber sido previamente esterilizados. El lector debe consultar las pautas institucionales para el uso de guantes estériles o quirúrgicos.
2. Con pinzas de tipo 7 y 5, corte la fascia superficial y separe las glándulas salivales del tejido subyacente.
   NOTA: Avance siempre con pinzas cerradas y extiéndalo mientras se aleja para empujar el tejido. De esta manera, los espacios anatómicos se pueden atravesar con un traumatismo tisular mínimo.
3. Coloque el retractor de alambre en su posición inicial mientras se asegura de que las glándulas salivales no interfieran con los pasos posteriores.
4. Retire la fascia profunda del cuello con pinzas de tipo 7 y separe los músculos esternocleidomastoideos de la región carotídea para reposicionar el retractor.
5. Vuelva a colocar el retractor para llegar por debajo de los músculos esternocleidomastoideos para permitir el acceso a la región carotídea.
6. Resecar el músculo omohioideo para permitir una visión clara y un acercamiento más fácil a la región carotídea.
7. Libere la arteria carótida y sus ramas de la vena carótida y el nervio vago, que se mantienen unidos en la fascia carótida.
   NOTA: Esta fascia debe retirarse con cuidado para evitar lesionar el nervio vago o causar un sangrado significativo.
   1. Pellizque la fascia carótida en el lado lateral de la tríada carotídea y tire suavemente de ella lateralmente para identificar visualmente la arteria, el nervio, la vena y todas las ramas de los vasos sanguíneos circundantes.
   2. Mientras tira de la fascia lateralmente, con pinzas de tipo 5, separe el CCA del nervio y la vena adyacentes hasta el punto de ramificación y la vena tiroidea superior, que cruza sobre el CCA.
   3. Separe completamente la parte inferior del CCA del tejido subyacente y la fascia, utilizando pinzas curvas de tipo 7, asegurándose de que esté lista para pinzar en pasos futuros.
   4. Procediendo cranealmente en la región por encima del punto de ramificación del CCA, abra la fascia carótida con dos pinzas.
   5. Del mismo modo, tire del extremo suelto de la fascia carótida medial y lateralmente para separar con precisión la ECA y la arteria carótida interna (ACI) de la fascia y el tejido circundante, respectivamente.
   6. Libere el ECA y el ICA del tejido subyacente con pinzas curvas de tipo 7.
8. Con el CCA cuidadosamente preparado con sus dos ramas respectivas, eleve el ECA con pinzas curvas de tipo 7 y sujételo con pinzas de cierre automático de tipo N0.
9. Baje con cuidado las pinzas de cierre automático tipo N0 sobre la mesa de operaciones.
   NOTA: Para reposicionar el punto de sujeción del ECA, a veces es necesario soltar ligeramente el agarre y empujar el punto de ramificación del ECA caudalmente. En este punto, es importante asegurarse de que quede más de 1 mm de ECA entre la sujeción del ECA y el punto de ramificación.
10. Con el ECA sujetado y sujetado de forma segura con pinzas tipo N0, introduzca dos hilos de seda trenzados detrás del ECA.
    NOTA: El hilo craneal formará el nudo de ligadura y debe colocarse cranealmente desde el sitio de sujeción.
11. Ata el hilo craneal por completo, ya que es permanente, y corta el exceso de hilo con unas tijeras.
12. Ata el hilo caudal en un nudo de seguridad suelto.
    NOTA: Debe colocarse cerca del punto de ramificación de la ECA y mantenerse suelto para que pase el filamento MCAO.
13. Con el uso de microclips vasculares, cierre con pinza el CCA y el ICA para evitar el sangrado después de la arteriotomía.
    NOTA: Es crucial asegurarse de que el microclip aplicado al CCA tenga un agarre lo suficientemente fuerte, ya que el CCA es una arteria pulsante de alto rendimiento, y si no lo hace, puede provocar una hemorragia profusa y la muerte del animal en los pasos posteriores.
14. Con unas tijeras de microresorte, haga una pequeña arteriotomía justo debajo del sitio de pinzamiento de la ECA.
    NOTA: La arteriotomía debe ser lo suficientemente grande para que la parte de silicona del filamento entre, pero no más de la mitad de la circunferencia del ECA para no comprometer la tensión mantenida por las pinzas de tipo N0.
15. Con un ángulo que coincida con el del ECA, inserte el filamento en el sitio de la arteriotomía en dirección proximal al CCA, pasando a través del nudo de seguridad suelto en el sitio de ramificación del ECA y pegándose en la luz del CCA con el filamento.
16. Apriete el nudo de seguridad alrededor de la parte de silicona del filamento.
    NOTA: Hay que tener mucho cuidado en este punto, ya que el filamento tiende a salirse del ECA a mitad de la última maniobra, y volver a colocarlo en ese punto es muy difícil.
17. Abra con cuidado el microclip ICA y retírelo.
18. Con el filamento parcialmente insertado en el ECA y asegurado, realice una arteriotomía completa, aflojando así el muñón del ECA con el filamento MCAO en su interior. En este punto, suelte las pinzas de cierre automático tipo N0 y retírelas.
19. Con un juego de pinzas tipo 5, pellizque firmemente el muñón ECA y levántelo ligeramente. Mientras sujeta el filamento parcialmente insertado con otra pinza, baje y tire suavemente del muñón ECA para orientar el extremo interior del filamento hacia el ICA. Nunca pellizques la parte de silicona del filamento.
20. Con las pinzas sujetando el filamento, avance lentamente el filamento a través del ICA hacia el círculo de las voluntades.
    NOTA: El primer punto de ramificación del ICA es también el único en el que el operador puede pasar por alto el punto de ramificación MCA deseado. Por lo tanto, es necesario un ligero ángulo lateral de avance para guiar el filamento hasta el punto de ramificación del MCA. Con el ligero ángulo lateral de avance, el filamento se curva alejándose de la arteria pterigopalatina (PPA) y hace que el extremo que avanza sea más probable que entre en el círculo de Willis (Figura 1).

Figura 1: Ilustración del avance del filamento de oclusión de la arteria cerebral media más allá del punto de ramificación de la arteria pterigopalatina. El avance adecuado del filamento (a la izquierda) se logra orientando el filamento MCAO de tal manera que retroceda contra la pared lateral del ICA y se curve alejándose del punto de ramificación del PPA. Si no lo hace (a la derecha), el filamento puede entrar en el PPA y no provocar un derrame cerebral. En este último caso, el filamento no podrá avanzar tanto como debería y el cirujano deberá retirar el filamento hasta que su extremo se haga visible en el punto de ramificación del ICA y comience a avanzar el filamento de nuevo. Las arterias de color verde representan las arterias comunicantes posteriores (PcomA), en su mayoría no patentes en ratones. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

21. Avance lentamente el filamento MCAO a través del círculo de Willis hasta que se sienta un aumento repentino de la resistencia.
    NOTA: En este punto, es importante observar la longitud restante del filamento. El filamento debe avanzar sin esfuerzo al menos 7 mm desde el punto de ramificación ICA en un ratón adulto.
22. Apriete el nudo de seguridad para asegurarse de que el filamento no se desplace durante la isquemia.
23. Retire el clip CCA y tome nota de la hora.
    NOTA: Esto marca el inicio de la aparición de la isquemia.
24. Coloque el extremo suelto del filamento MCAO en el surco entre el triángulo carotídeo y el músculo esternocleidomastoideo ipsilateral para que no sobresalga de la herida quirúrgica.
25. Retire el retractor de alambre y acerque los bordes de la herida quirúrgica entre sí. Deje que el sitio quirúrgico se asiente durante unos segundos para que el tejido vuelva a su posición anatómica.
26. Cierre la herida quirúrgica con cierres de herida con cinta adhesiva para facilitar una reapertura más rápida de la herida después del período de isquemia.
    NOTA: Si un investigador desea dejar que el animal despierte durante el período de isquemia, se recomienda suturar la herida para evitar la reapertura prematura de la herida.

3. Período de isquemia

1. Validar el éxito de la cirugía mediante resonancia magnética o algún otro método cuantitativo de medición de la perfusión.
   NOTA: En caso de realizar una resonancia magnética, las imágenes ponderadas por perfusión (PWI) deben mostrar isquemia crítica en la región amplia de MCA y las imágenes ponderadas por difusión (DWI) deben describir el sitio del coeficiente de difusión aparente (ADC) reducido debido al edema celular.
2. Colocar al animal en una jaula limpia hasta que termine el período de isquemia.

4. Cirugía de retirada de filamentos

1. Aproximadamente 5 minutos antes de que finalice el tiempo de isquemia asignado, coloque al animal y asegúrelo nuevamente en la mesa de operaciones.
2. Retire los cierres de la herida con cinta y vuelva a abrir la herida quirúrgica con el retractor de alambre.
3. Libere el extremo suelto del filamento MCAO del tejido circundante y de los extremos del hilo del nudo de seguridad.
4. Con las pinzas de tipo N0, pellizque y tire ventralmente del borde del muñón ECA para ponerle tensión. Baje con cuidado las pinzas de apriete hacia abajo, de manera similar al primer procedimiento quirúrgico.
   NOTA: El operador debe evitar pellizcar el nudo de seguridad, ya que eso hará que el nudo no pueda desatarse.
5. Vuelva a sujetar el CCA con una pinza microvascular.
6. Con pinzas de tipo 5, afloje el nudo de seguridad para permitir la extracción del filamento.
   NOTA: La mejor manera de comenzar a aflojar el nudo es seguir pellizcándolo hasta que se separe en partes individuales y luego empujar los extremos del hilo hacia el nudo.
7. Retire lentamente el filamento MCAO hasta que la parte de silicona comience a sobresalir del muñón ECA. Apriete ligeramente el nudo de seguridad para prepararse para la retirada completa del filamento.
8. Cuando esté cerca del extremo de silicona del filamento, apriete el nudo de seguridad para que empuje el filamento MCAO y cierre el muñón ECA en una sola maniobra. Aprieta el nudo completamente después de que el filamento se deslice.
9. Abra y retire las pinzas de apriete junto con el clip CCA.
   NOTA: Esto marca el final del período de isquemia y el inicio del proceso de reperfusión.
10. Retire el retractor de alambre y vuelva a juntar los bordes de la herida quirúrgica.
11. Suturar la herida quirúrgica comenzando desde la periferia, cerrando la herida completamente sin que se vea ningún tejido subyacente.
    NOTA: El número de suturas necesarias depende del tamaño de la herida quirúrgica.
12. Limpie y desinfecte el sitio quirúrgico con toallitas con alcohol isopropílico.

5. Cuidados postquirúrgicos

1. Coloque al animal en una jaula limpia y permita que se despierte espontáneamente de la anestesia.
2. Coloque la comida granulada en el fondo de la jaula para facilitar su alcance. Ablande los gránulos de comida con agua potable. Llena una pequeña placa de Petri con agua potable y llévala también al suelo de la jaula.
3. En las siguientes 48 h, inyectar 0,25 mL de solución salina con buprenorfina (0,5 mg/kg) cada 24 h por vía intraperitoneal.

Resultados

Las resonancias magnéticas intraoperatorias o postoperatorias, específicamente las imágenes ponderadas por perfusión (PWI) y/o las imágenes ponderadas por difusión (DWI) (Figura 2) pueden ofrecer una prueba definitiva de un procedimiento exitoso. La PWI intraoperatoria muestra isquemia crítica en la región MCA ipsilateral, lo que confirma que la colocación del filamento resultó en una oclusión completa. La PWI postoperatoria de un procedimiento ex...

Discusión

El MCAO es un procedimiento muy exigente para el operador y debilitante para el animal. Por esta razón, es de suma importancia que los investigadores cuenten con un procedimiento operativo estándar que minimice la gravedad del accidente cerebrovascular, reduzca el fracaso del procedimiento y mejore el bienestar del animal después del procedimiento. Este protocolo MCAO destaca algunos de los aspectos clave a tener en cuenta al realizar este procedimiento en un mouse.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine cutaneous solution 10g/100ml	Alkaloid Skopje	N/A
Braided silk suture	Fine Science Tools	18020-60
Dafilon suture 5/0 DS16	B. Braun	C0936154
Dolokain 20 mg/g gel	Jadran-Galenski Laboratorij	N/A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	2 pieces
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools	11271-30
Dumont N0 self-closing forceps	Fine Science Tools	11480-11
Durapore Surgical Tape 1,25cm x 9,1m	3M	7100057169
Durapore Surgical Tape 2,5cm x 9,1m	3M	7100057168
External thermostat	Petnap	1012536
Halsey needle holders	Fine Science Tools	12500-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Iris scissors	Fine Science Tools	14060-10
Isoflurane USP	Piramal critical care	N/A
Laser Doppler Monitor	Moor	MOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat Pad	Petnap	1012525
Micro Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Mini-colibri retractor	Fine Science Tools	17000-01
Recugel eye ointment	Bausch&Lomb	N/A
S&T B-1 vessel micro clamp	Fine Science Tools	00396-01	2 pieces
S&T micro clamp applying forceps	Fine Science Tools	00071-14
Schwartz micro serrefines	Fine Science Tools	18052-01
Stemi DV4 Spot stereo microscope	Zeiss	000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced Adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm	3M	7100236545
Straight tissue forceps	Fine Science Tools	11023-10
SZX Stand Arm	Olympus	SZ2-STS
Tec III 300 series calibrated vaporizer	Vaporizer Sales and Service inc.	N/A
Universal Stand Type 2	Olympus	SZ2-STU2
VetFlo Six Channel Anesthesia Stand	Kent Scientific	VetFlo-1225	Modified for O2/N2 mixing