Оптимизация метода окклюзии средней мозговой артерии Лонга для полной реперфузии

Резюме

Этот протокол представляет собой пошаговое руководство для исследователей по выполнению процедуры окклюзии средней мозговой артерии у мышей с использованием модифицированного метода наружной сонной артерии Лонга. Модификации, представленные в данной статье, направлены на повышение точности окклюзии средней мозговой артерии и обеспечение полной реперфузии.

Аннотация

Модель окклюзии средней мозговой артерии служит основной животной моделью для изучения ишемического инсульта. Несмотря на то, что он используется в исследованиях уже более трех десятилетий, его стандартизация остается недостаточной. Процедура, проводимая преимущественно на крысах и мышах, сопряжена с трудностями из-за более мелкого и хрупкого характера мышей. В отличие от метода общей сонной артерии Коидзуми, наружная сонная артерия Лонга является единственной моделью удара внутрипросветной нити, обеспечивающей полную реперфузию после ишемии. Этот аспект имеет решающее значение для исследований, изучающих феномены реперфузии. Представленные в статье хирургические модификации обеспечивают непрерывный кровоток из общей сонной артерии на протяжении всей ишемической фазы и после начала реперфузии. Целью этих модификаций является селективная окклюзия средней мозговой артерии путем поддержания непрерывности перфузии в ветвях, проксимальных к средней мозговой артерии в период ишемии. Кроме того, начало реперфузии является внезапным и может быть точно контролируемо, что позволяет более точно моделировать эндоваскулярную тромбэктомию в медицине человека. Наша цель в представлении этой всеобъемлющей видеостатьи состоит в том, чтобы облегчить обучение новых хирургов и способствовать стандартизации хирургических процедур в научном сообществе.

Введение

Инсульт занимает второе место среди основных причин смерти и третье место среди причин смерти и инвалидности вместе взятых¹. По своей причине инсульт может быть ишемическим или геморрагическим, при этом ишемический инсульт значительно чаще встречается в клинической практике. Ишемический инсульт возникает из-за закупорки артерии, снабжающей кровью ткани мозга, что приводит к ишемии, гибели клеток и воспалению. С появлением реперфузионных терапий, таких как тромболизис и механическая тромбэктомия, был достигнут большой прогресс в лечении инсульта. Тем не менее, любая реперфузионная терапия сопряжена с риском усугубления состояния пациента, вызывая то, что обычно называют реперфузионным повреждением². Точный механизм реперфузионного повреждения остается неясным, и выявление потенциальных причин и профилактических мер зависит от доклинических исследований. Для этого решающее значение имеет разработка подходящей животной модели реперфузионного повреждения, которое следует за ишемическим инсультом.

Окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) является наиболее часто используемой животной моделью для изучения ишемического инсульта. Он проводится преимущественно на грызунах и имеет множество различных вариантов, описанных в научной литературе на сегодняшний день ^3,4. Два основных типа, Коидзуми и Лонга, известные как варианты общей сонной артерии (КЦА) и варианты наружной сонной артерии (ХКА), технически различаются по месту артериотомии для введения нити ^5,6. В нашей недавней статье, проведя мониторинг сосудистой перфузии in vivo, мы показали, что только метод Лонга может считаться моделью ишемии/реперфузии мозга⁷. Процедура включает в себя введение филамента в ECA, его продвижение через ICA, и закрепление его в точке разветвления средней мозговой артерии (MCA), чтобы вызвать ишемию ткани мозга. После заданного периода ишемии удаление нити позволяет провести реперфузию, имитируя транзиторную ишемию головного мозга. После начала инсульта основной переменной исхода, используемой в исследованиях, чаще всего является объем инфарктного поражения, который может быть измерен либо с помощью гистологии ex vivo, либо сканирования мозга in vivo. Проблемы в моделях MCAO связаны с низкой воспроизводимостью, связанной с межвариантными, межоператорными и межсубъектными вариациями, причем последняя представляет собой существенное ограничение в доклинических исследованиях инсульта⁴.

Более того, инфарктные участки после MCAO у грызунов массивны по сравнению с размером мозга грызуна. Кроме того, задние отделы мозга гиппокампа часто включаются в объем инфаркта, несмотря на то, что эти области в первую очередь зависят от кровотока из задней мозговой артерии (PCA), а не MCA⁸. Как и в описанных в литературе методах Коидзуми и Лонга, ОСА остается лигированной в течение периода ишемии из-за неполной проходимости Виллисового круга у мышей, что приводит к индукции ишемии в гораздо более широкой области, чем предполагалось ^5,6,9. Даже при методах, при которых ОСА вновь открывается или восстанавливается после периода ишемии, обычные 30-60 минут ишемии приводят к необратимому повреждению тканей в областях, не относящихся к МКА¹⁰. Кроме того, вопреки ожиданиям, предыдущие исследования показали, что длина силиконового покрытия нити не влияет на размер поражения¹¹. Тем не менее, выбор длины силиконового покрытия нити рассматривался исключительно в моделях с лигированным CCA в период окклюзии.

Целью данного метода была модификация метода Longa MCAO у мышей для обеспечения непрерывного кровотока из ОСА в период ишемии, тем самым повышая селективность МКАО, а также обеспечивая полную реперфузию инфарктированной области после процедуры. Эти модификации могли бы значительно улучшить лонгитюдные исследования, изучающие ишемско-реперфузионное повреждение у мышей, за счет снижения уровня смертности и уменьшения межсубъектной вариативности.

протокол

Все процедуры обращения с животными были одобрены Комитетом по лицензированию этики Медицинского факультета Университета Загреба и Комитетом по этике для защиты животных, используемых в научных целях Министерства сельского хозяйства Республики Хорватия. Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Законом Хорватии о защите животных (NN 102/17, 32/19), Поправками к Закону о защите животных (NN 37/13) и Руководством по защите животных, используемых в научных целях (NN 55/13), которые соответствуют Европейскому руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию (Директива 2010/63/EU).

1. Подготовка животного и поле операции

1. Поместите животное в нокаут-бокс и введите анестезию, используя 5% объема изофлурана в смеси кислорода и азота (соотношение 1:2).
2. После визуального осмотра состояния сознания животного и частоты дыхания поднесите его к лабораторным весам и взвесьте.
3. Проверьте рефлекс, защипнув межпальцевую кожу нижней конечности, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.
4. Расположите животное на нагретом операционном столе и поднесите его нос к маске для анестезии. Установите начальную температуру операционного стола на 36 °C и отрегулируйте ее так, чтобы поддерживать температуру тела животного на уровне 37 °C (измеряется с помощью ректального зонда, вводимого на последующих этапах). На всех последующих этапах регулируйте объемную долю изофлурана, чтобы поддерживать частоту дыхания животного на уровне 100 вдохов/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все поверхности и материалы, находящиеся в непосредственном контакте с животным, должны быть тщательно продезинфицированы перед процедурой.
5. Нанесите глазную мазь на глаза животного, чтобы защитить их от обезвоживания и газообразного изофлурана.
6. Переверните животное на спину и вытяните ему шею, подложив под нее небольшую подушку из хирургической ленты.
7. Закрепите конечности животного на месте с помощью хирургической ленты. Следите за тем, чтобы не разгибать передние конечности слишком сильно, чтобы случайно не вызвать вывих плечевого сустава.
8. Смажьте ректальный зонд белым вазелином и введите его в прямую кишку для непрерывного измерения температуры тела. Закрепите зонд на месте вместе с хвостом с помощью хирургической ленты.
9. Применяйте предоперационную инъекцию физиологического раствора и бупренорфина (0,5 мг/кг) внутрибрюшинно, чтобы животное хорошо гидратировалось и находилось под обезболиванием во время процедуры.
10. Сбрейте шерсть животного в области шеи с помощью аккумуляторной машинки для стрижки животных. Соберите всю выбритую шерсть с помощью кусочков хирургического скотча. Кроме того, побрейте этот участок бритвой, чтобы полностью освободить его от шерсти.
11. Выбирайте нить MCAO в зависимости от веса и/или возраста измеряемого животного. Достаньте его из контейнера и положите в чашку Петри на видном месте. Нанесите каплю физиологического раствора на силиконовую часть нити, чтобы она оставалась чистой и не содержала пыли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщину силиконового покрытия нити следует выбирать в соответствии с официальными рекомендациями производителя в случае мыши возрастом 12-16 недель. Кроме того, длина силиконового покрытия должна быть тщательно спланирована заранее, в зависимости от размера зоны полива, которая должна быть перекрыта (см. Обсуждение).
12. Накройте операционный стол чистой хирургической простыней.
13. Нанесите каплю Бетадина на выбритую кожу животного. С помощью ватного тампона втирайте дезинфицирующее средство в кожу круговым образом изнутри наружу. После этого проделайте то же самое с помощью ватного тампона, смоченного в этаноле. Повторите этот шаг 3 раза со свежей парой стерильных ватных палочек для каждого повторения.
14. Нанесите каплю лидокаинового геля на продезинфицированный участок будущего места разреза для местного обезболивания раны.

2. Хирургия индукции ишемии

1. Сделайте первоначальный надрез на продезинфицированной коже с помощью скальпеля. Сведите к минимуму количество разрезов кожи, чтобы ускорить заживление хирургической раны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты должны быть предварительно стерилизованы. Читатель должен обратиться к своим институциональным рекомендациям по использованию стерильных или хирургических перчаток.
2. С помощью щипцов 7 и 5 типа оторвите поверхностную фасцию и отделите слюнные железы от подлежащих тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда продвигайтесь вперед с закрытыми щипцами и вытягивайте их, отодвинув их в сторону, чтобы отодвинуть ткань. Таким образом, анатомические пространства могут быть пройдены с минимальной травматизацией тканей.
3. Поместите втягивающее устройство для проволоки в исходное положение, следя за тем, чтобы слюнные железы не мешали последующим шагам.
4. Удалите глубокую фасцию шеи с помощью щипцов типа 7 и отсоедините грудино-ключично-сосцевидные мышцы от сонной артерии, чтобы переместить ретрактор.
5. Переместите ретрактор так, чтобы он достигал грудино-ключично-сосцевидных мышц, чтобы обеспечить доступ к сонной артерии.
6. Резецируйте подъязычную мышцу, чтобы обеспечить четкий визуальный и более легкий доступ к сонной артерии.
7. Освободите сонную артерию и ее ветви от сонной вены и блуждающего нерва, которые удерживаются вместе в сонной фасции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эту фасцию необходимо удалять осторожно, чтобы не повредить блуждающий нерв и не вызвать значительного кровотечения.
   1. Зажмите сонную фасцию на латеральной стороне триады сонной артерии и осторожно потяните ее в сторону, чтобы визуально идентифицировать артерию, нерв, вену и все окружающие ветви кровеносных сосудов.
   2. Оттягивая фасцию латерально, с помощью щипцов 5-го типа, отделите ОСА от соседнего нерва и вены до точки ветвления и верхней щитовидной вены, которая пересекает ОСА.
   3. Полностью отделите нижнюю часть CCA от подлежащих тканей и фасции с помощью изогнутых щипцов типа 7, убедившись, что она готова к зажиму на последующих этапах.
   4. Действуя краниально в области над точкой ветвления ОСА, разорвите сонную фасцию с помощью двух щипцов.
   5. Аналогичным образом потяните свободный конец сонной фасции медиально и латерально, чтобы точно отделить ЭХА и внутреннюю сонную артерию (ВСА) от фасции и окружающих тканей соответственно.
   6. Освободите ECA и ICA от подлежащих тканей с помощью изогнутых щипцов 7-го типа.
8. С помощью тщательно подготовленного CCA с двумя соответствующими ветвями поднимите ECA с помощью изогнутых щипцов типа 7 и зажмите его самозакрывающимися щипцами типа N0.
9. Осторожно опустите самозакрывающиеся щипцы типа N0 на операционный стол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить положение точки зажима ECA, иногда необходимо слегка ослабить хват и надавить на точку разветвления ECA каудально. На этом этапе важно убедиться, что между зажимом ECA и точкой разветвления остается более 1 мм ECA.
10. Зажав ECA и надежно удерживая его с помощью пинцета типа N0, введите две плетеные шелковые нити за ECA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Краниальная нить образует лигационный узел и должна быть размещена краниально от места зажима.
11. Полностью завяжите черепную нить, так как она постоянна, и отрежьте лишнюю нить ножницами.
12. Завяжите каудальную нить в свободный фиксирующий узел.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Он должен быть расположен близко к точке разветвления ECA и оставаться свободным, чтобы нить MCAO могла пройти.
13. С помощью сосудистых микрозажимов зажмите CCA и ICA, чтобы предотвратить кровотечение после артериотомии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно убедиться, что микрозажим, нанесенный на ОСА, имеет достаточно прочный захват, поскольку ОСА является пульсирующей артерией с высокой пропускной способностью, и невыполнение этого требования может привести к обильному кровотечению и смерти животного на более поздних стадиях.
14. С помощью ножниц с микропружинами сделайте небольшую артериотомию прямо под местом зажима ECA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Артериотомия должна быть достаточно большой, чтобы силиконовая часть нити могла войти внутрь, но не более половины окружности ECA, чтобы не нарушить натяжение, сохраняемое щипцами типа N0.
15. С углом, совпадающим с углом ЭХА, введите филамент в место артериотомии в проксимальном направлении к ОСА, проходя через свободный фиксирующий узел в месте разветвления ЭХА и вклеиваясь в просвет ОСА вместе с нитью.
16. Затяните фиксирующий узел вокруг силиконовой части нити накала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе требуется большая осторожность, так как нить имеет тенденцию выскальзывать из ECA на полпути к последнему маневру, и вставить ее обратно в эту точку очень сложно.
17. Осторожно откройте микрозажим ICA и извлеките его.
18. Когда филамент частично вставлен в ECA и закреплен внизу, сделайте полную артериотомию, тем самым освободив культю ECA вместе с филаментом MCAO внутри. На этом этапе отпустите самозакрывающиеся щипцы типа N0 и снимите их.
19. Одним набором пинцетов типа 5 сильно зажмите культю ЭХА и слегка приподнимите ее. Держась за частично вставленную нить другим щипцом, опустите и осторожно потяните культю ECA, чтобы ориентировать внутренний конец нити в сторону ICA. Ни в коем случае не зажимайте силиконовую часть нити.
20. С помощью щипцов, удерживающихся за нить, медленно продвигайте нить через ICA к кругу Воли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая точка ветвления ICA также является единственной, где оператор может пропустить нужную точку ветвления MCA. Таким образом, небольшой боковой угол продвижения необходим для направления нити накала к точке разветвления MCA. При небольшом боковом угле продвижения нить изгибается в сторону от крыло-нёбной артерии (ППА) и делает продвигающийся конец более вероятным для входа в виллидисовский круг (рис. 1).

Рисунок 1: Иллюстрация продвижения нити окклюзии средней мозговой артерии за точку ветвления крыловидной артерии. Правильное продвижение нити накала (слева) достигается за счет ориентации нити MCAO таким образом, что она упирается в боковую стенку ICA и изгибается в сторону от точки ветвления PPA. Невыполнение этого требования (справа) может привести к попаданию нити накала внутрь PPA и не вызвать инсульт. В последнем случае нить не сможет продвинуться так далеко, как должна, и хирург должен извлекать нить до тех пор, пока ее конец не станет виден в точке разветвления ICA и не начнет продвигаться снова по нити. Артерии зеленого цвета представляют задние коммуникативные артерии (PcomA), в основном непатентованные у мышей. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

21. Медленно продвигайте нить MCAO по кругу Виллиса до тех пор, пока не почувствуете резкое увеличение сопротивления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно наблюдать за оставшейся длиной нити накала. Нить накала должна без усилий продвигаться на расстоянии не менее 7 мм от точки разветвления ICA у взрослой мыши.
22. Затяните фиксирующий узел, чтобы нить не сместилась во время ишемии.
23. Снимите зажим CCA и запишите время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это знаменует собой начало ишемии.
24. Упаковать свободный конец нити MCAO в канавку между каротидным треугольником и ипсилатеральной грудино-ключично-сосцевидной мышцей, чтобы она не выступала из операционной раны.
25. Снимите втягиватель проволоки и приблизьте края операционной раны друг к другу. Дайте месту операции успокоиться на несколько секунд, чтобы ткань вернулась в свое анатомическое положение.
26. Закройте операционную рану с помощью ленточных застежек, чтобы способствовать более быстрому повторному открытию раны после периода ишемии.
    Примечание: Если исследователь желает дать животному проснуться в период ишемии, рекомендуется наложить швы на рану, чтобы предотвратить преждевременное открытие раны.

3. Период ишемии

1. Подтвердите успешность операции с помощью МРТ или другого количественного метода измерения перфузии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае проведения МРТ перфузионно-взвешенная визуализация (PWI) должна показать критическую ишемию в широкой области MCA, а диффузионно-взвешенная визуализация (DWI) должна очертить участок пониженного кажущегося коэффициента диффузии (ADC) из-за отека клеток.
2. Поместите животное в чистую клетку до тех пор, пока не закончится период ишемии.

4. Операция по удалению нитей

1. Примерно за 5 минут до окончания отведенного времени ишемии расположите животное и снова закрепите его на операционном столе.
2. Снимите затворы с ленты и снова откройте операционную рану с помощью проволочного втягивающего устройства.
3. Освободите свободный конец нити MCAO от окружающих тканей и концы фиксирующей нити узла.
4. С помощью щипцов типа N0 сожмите и потяните край культи ECA вентрально, чтобы натянуть ее. Осторожно опустите щипцы вниз, аналогично первой хирургической процедуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оператор должен избегать защемления фиксирующего узла, так как это сделает так, что узел не сможет развязаться.
5. Снова зажмите CCA микрососудистым зажимом.
6. С помощью щипцов типа 5 ослабьте фиксирующий узел, чтобы обеспечить возможность извлечения нити.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучший способ начать ослаблять узел - это продолжать сжимать его, пока он не разделится на отдельные части, а затем протолкнуть концы нити к узлу.
7. Медленно извлекайте нить MCAO до тех пор, пока кремниевая часть не начнет торчать из культи ECA. Слегка затяните фиксирующий узел, чтобы подготовиться к полному извлечению нити.
8. Находясь близко к силиконовому концу нити, затяните фиксирующий узел так, чтобы он выталкивал нить MCAO и закрывал культю ECA одним маневром. Затяните узел полностью после того, как нить выскользнет наружу.
9. Откройте и снимите щипцы вместе с зажимом CCA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это знаменует собой окончание периода ишемии и начало процесса реперфузии.
10. Снимите втягиватель провода и снова сведите края операционной раны вместе.
11. Наложите шов на операционную рану, начиная с периферии, полностью закрывая рану без видимых подлежащих тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых швов зависит от размера операционной раны.
12. Очистите и продезинфицируйте место операции с помощью спиртовых салфеток.

5. Послеоперационный уход

1. Поместите животное в чистую клетку и дайте ему самопроизвольно проснуться от анестезии.
2. Поместите гранулированный корм на дно клетки для облегчения доступа. Размягчите пищевые гранулы с помощью питьевой воды. Наполните маленькую чашку Петри питьевой водой и также поставьте ее на пол клетки.
3. В течение следующих 48 ч вводите 0,25 мл физиологического раствора с бупренорфином (0,5 мг/кг) каждые 24 ч внутрибрюшинно.

Результаты

Интраоперационная или послеоперационная МРТ, в частности перфузионно-взвешенная визуализация (PWI) и/или диффузионно-взвешенная визуализация (DWI) (Рисунок 2), могут стать окончательным доказательством успешной процедуры. Интраоперационная ПВИ показыва...

Обсуждение

MCAO является очень требовательной процедурой для оператора и изнурительной для животного. По этой причине для исследователей крайне важно иметь стандартную операционную процедуру, которая сводит к минимуму тяжесть инсульта, снижает количество неудач в процедуре и у?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine cutaneous solution 10g/100ml	Alkaloid Skopje	N/A
Braided silk suture	Fine Science Tools	18020-60
Dafilon suture 5/0 DS16	B. Braun	C0936154
Dolokain 20 mg/g gel	Jadran-Galenski Laboratorij	N/A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	2 pieces
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools	11271-30
Dumont N0 self-closing forceps	Fine Science Tools	11480-11
Durapore Surgical Tape 1,25cm x 9,1m	3M	7100057169
Durapore Surgical Tape 2,5cm x 9,1m	3M	7100057168
External thermostat	Petnap	1012536
Halsey needle holders	Fine Science Tools	12500-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Iris scissors	Fine Science Tools	14060-10
Isoflurane USP	Piramal critical care	N/A
Laser Doppler Monitor	Moor	MOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat Pad	Petnap	1012525
Micro Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Mini-colibri retractor	Fine Science Tools	17000-01
Recugel eye ointment	Bausch&Lomb	N/A
S&T B-1 vessel micro clamp	Fine Science Tools	00396-01	2 pieces
S&T micro clamp applying forceps	Fine Science Tools	00071-14
Schwartz micro serrefines	Fine Science Tools	18052-01
Stemi DV4 Spot stereo microscope	Zeiss	000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced Adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm	3M	7100236545
Straight tissue forceps	Fine Science Tools	11023-10
SZX Stand Arm	Olympus	SZ2-STS
Tec III 300 series calibrated vaporizer	Vaporizer Sales and Service inc.	N/A
Universal Stand Type 2	Olympus	SZ2-STU2
VetFlo Six Channel Anesthesia Stand	Kent Scientific	VetFlo-1225	Modified for O2/N2 mixing