探索最长肌：揭示其与 Bos indicus 和杂交公牛肉质的相关性

摘要

我们研究了 印度公 牛和杂交公牛的骨骼肌组织，以解释肉质性状的差异。发现 Warner-Bratzler 剪切力 （WBSF） 范围为 4.7 kg 至 4.2 kg。肌球蛋白重链亚型揭示了动物之间的差异，肌原纤维碎裂指数进一步揭示了压痛 （WBSF） 变化。

摘要

本研究调查了 印度公 牛和杂交公牛的肌肉组织，以解释肉质性状的差异。描述了胴体性状、肉质参数以及肌原纤维蛋白的生化和分子研究。已经概述了评估 pH 值、肌内脂肪 （IMF）、肉色 （L*、 a*、 b*）、水分流失、嫩度和分子生物学测定的方法。描述了详细说明每种方法的校准、样品制备和数据分析的具体程序。这些技术包括用于 IMF 含量的红外光谱、客观压痛评估和 MyHC 亚型的电泳分离等技术。

颜色参数被强调为预测牛肉嫩度的潜在工具，而牛肉嫩度是影响消费者决策的关键品质性状。该研究采用了 Warner-Bratzler 剪切力 （WBSF） 方法，显示 Nellore 和 Angus-Nellore 的值分别为 4.68 和 4.23 kg（P < 0.01）。总蒸煮损失和生化分析，包括肌原纤维碎裂指数 （MFI），提供了对嫩度变化的见解。研究了肌肉纤维类型，特别是肌球蛋白重链 （MyHC） 亚型，在研究的瘤牛动物中明显缺乏 MyHC-IIb 亚型。MyHC-I 与肉嫩度之间的关系揭示了文献中的不同发现，突出了这种关联的复杂性。总体而言，该研究全面了解了影响印度 公 牛和杂交公牛（Bos taurus × Bos indicus）公牛肉质的因素，为牛肉行业提供了有价值的信息。

引言

巴西拥有全球最大的商业牛群，约有 2.2 亿头动物，是第二大肉类生产国，每年生产超过 900 万吨胴体当量¹。肉牛生产部门为国家农业系统做出了重大贡献，年总销售额超过 550 亿雷亚尔。自 2004 年以来，巴西一直是全球肉类贸易的关键参与者，出口到 180 多个国家，占世界肉类贸易的 ~50%²。

肉类嫩度是影响消费者满意度和肉类消费的首要质量属性³。通过采用生化和客观方法来测量肉类的嫩度，研究人员旨在为动物遗传学、加工技术和储存条件等因素提供有价值的见解，最终为消费者提高肉制品的质量和一致性。这些信息很有用，因为肉类嫩度在消费者购买过程中的决策中变得越来越重要。此外，肉类嫩度评估为肉类生产和加工行业的质量控制提供了有价值的信息。通过持续监测嫩度，生产商可以确保肉类产品符合所需的标准和规格。在此背景下，巴西肉牛生产商正逐步采用杂交动物的集约化饲养场系统，以提高资本周转率。该系统约占巴西每年生产的胴体吨数的 10% ^4,5。

消费者对提高肉质的需求不断增长，这促使肉牛生产商与欧洲品种杂交，主要是阿伯丁安格斯⁶ 号。该策略旨在生产 F1 Angus-Nellore 杂交种，与纯瘤牛动物相比，该杂交种以卓越的性能、理想的胴体特征和更高的肉质而闻名 ^7,8。在巴西的热带地区，在育肥农场中使用高龄未去势的动物（公牛）是常见的做法，这可能会损害颜色、大理石花纹和嫩度等肉质属性。值得注意的是，一项调查显示，在巴西饲养场完成的动物中，95% 是雄性，其中 73% 是 Nellore，其次是 22% 的杂交动物和 5% 的其他基因型 ^9,10。

了解肉嫩度的生化机制对于提高肉质至关重要。一个关键方面是死后蛋白水解，它会影响肌肉纤维的结构完整性¹¹。肌原纤维碎裂指数 （MFI） 是一种广泛使用的生化测定法，可量化肌原纤维降解的程度，从而深入了解肉类的嫩度¹²。MFI 方法涉及测量肌原纤维蛋白的片段化，这与肉的嫩度直接相关。该分析是对传统肉类质量评估的补充，并提供了对导致肉类嫩度变化的生化过程的更深入理解。

在此背景下，本研究调查了在饲养场育肥的 Bos indicus 公牛与杂交 （Bos taurus × Bos indicus） 公牛的骨骼肌，旨在解释肉质性状的差异。

研究方案

根据协议 0171/2018，动物的所有程序均符合“Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho” - UNESP Botucatu 校区动物使用伦理委员会 （CEUA） 制定的道德研究标准。

1. 实验动物

1. 在饲养场育肥 30 头 Nellore 公牛 （Bos indicus） 和 30 头 F1 Angus-Nellore 公牛 （Bos taurus × Bos indicus），年龄为 20-24 个月。将两组动物安置在尺寸为 5 m x 6 m 的集体围栏中，混凝土地板并配备贝壳式水槽，每个围栏最多可容纳 5 只动物。确保所有动物都属于同一个管理组（在同一农场出生和饲养），并提交到相同的饲养场。
   注意：在这项研究中，Nellore 公牛的平均初始体重为 370.7 公斤，而 F1 Angus-Nellore 公牛的平均初始体重为 380.8 ± 17 公斤。
2. 饲养场日粮
   1. 确保育肥饲料由 11.3% 的粗饲料（蒂夫顿干草和甘蔗渣）和 88.7% 的浓缩物（磨碎的干玉米粒、豆粕、玉米湿酒糟、干玉米筋饲料和矿物核心）组成。喂养动物 120 天，每天两次 随意 饮食（上午 10：00 和下午 04：00）。
3. 屠宰
   1. 在实验期结束时登记最终体重 （BWf）。在附近的屠宰场处理所有动物，遵守标准检查程序。在屠宰前，确保动物禁食至少 16 小时，避免饲料和水。
      注意：F1 Angus-Nellore 公牛的最终体重为 615.09 ± 57.53 公斤，而 Nellore 公牛的体重为 545.47 ± 11.45 公斤。
4. 胴体性状评估
   1. 最初称量牛肉胴体，然后将它们在 2-4 °C 下冷却 48 小时。测量值包括热胴体重量 （HCW）、肋眼面积 （REA） 和第 12/13^肋骨界面处的背膘厚度 （BFT），如建议的¹³。使用带有小网格 （18 cm x 13 cm） 的网格方法确定 REA，并使用卡尺以毫米为单位测量 BFT。
      1. 使用网状网格（与 USDA 产量等级分类系统中使用的相同）测量每个胴体的 REA，网格分为 1 平方厘米的正方形，中间有一个点。添加肋眼描摹周边内的所有方块，以及沿穿过中间点的描摹轮廓的所有方块。
      2. 在评估部位第 12^根/第 13^根 肋骨之间的任何位置测量 BFT。要确定这个位置，请测量肋眼的长度;然后，从内侧边界 “A” 开始，确定沿肋眼四分之三处和“B”处一半处的一个点。将卡尺穿过这一点，并与指定的肋骨成直角，到达皮下脂肪和肌间脂肪之间的界面。通过将卡尺从界面点与皮下脂肪线成直角来测量皮下脂肪（补充图 S1）。
5. 采样
   1. 从左半胴体（± 12.0 厘米肉的一部分）中取样，在颅方向的^第 11 和第 13^根肋骨之间。在实验室中，将肉样切成 2.54 厘米的牛排。
6. 老化
   1. 在生物需氧量 （BOD） 培养箱中，在 0-2 °C 的温度下湿式老化 14 天后评估肉品质性状。使用 2.54 cm 厚的牛排分析肉色、pH 值、肌内脂肪、清除损失、持水能力、客观嫩度和烹饪损失。将牛排单独包装在塑料袋中以实现高真空和低透氧性，达到陈酿时间后，将其在 -20 °C 下冷冻直至分析时。将牛肉样品在 4 °C 下解冻 24 小时，并在 4 °C（开花时间）下将其暴露在氧气中 30 分钟。

2. 肉类的 pH 值

1. 使用配备刺入式探头的数字 pH 计测量肉类的 pH 值。在 25 °C 的室温下用 pH 4.0 和 7.0 缓冲液校准。 测量 LT 肌肉样品三个位置的肉类 pH 值。手动记录数据读数，然后导出数据表;计算肉类 pH 值的三个读数的平均值。

3. 肌内脂肪

注：使用近红外 （NIR） 光谱¹⁴ 和重量法¹⁵ 测定肌内脂肪 （IMF） 含量。

1. 使用手术刀去除 LT 肌肉的皮下脂肪。然后，使用搅拌机将牛排研磨并均质 5 分钟，加入约 180 g 样品。将样品放入杯中，置于样品室内，通过旋转样品杯对测试样品的各个区域进行子扫描;合并区域以获得最终结果。
2. 每个样品取三个读数。均质化后，将样品放入板中以供后续读数。将装置设置为 NIR 透射，移动光栅光栅光栅扫描从 850 nm 到 1050 nm 的区域。
3. 导出数据表，然后计算 IMF 的平均值 3。使用以下公式将结果表示为百分比：[（IMF 平均÷样品重量） × 100]。
4. 将 LT 肌肉样品 （3.0 g） 与氯仿/甲醇/氯仿 （2：1） 溶液匀浆 2 分钟，然后离心（700 × g;10 分钟;20 °C）以分离亲水（上层）、固体（中）和疏水性（下层）相。
5. 使用漏斗上的滤纸轻轻吸取离心后获得的疏水相。将滤液（底相;氯仿中的脂质）转移到标记为脂质相的培养瓶中，静置几分钟后，将至少 5 mm 的滤液转移到预先称重的烧瓶中。然后，记录氯仿层的体积（至少 150 mL）并吸出酒精层。
   1. 用 100 mL 氯仿和 200 mL 甲醇的混合物将 100 g 等分试样的新鲜或冷冻组织样品均质化 2 分钟。向混合物中加入 100 mL 氯仿，混合 30 秒，加入 100 mL 蒸馏水，再混合 30 秒。
   2. 通过漏斗上的滤纸轻轻吸力过滤匀浆。当残留物变干时，用烧杯底部施加压力，以确保溶剂的最大回收率。
   3. 将滤液转移到 500 mL 量筒中，静置几分钟，以便分离和澄清。记录氯仿层的体积（至少 150 mL）并吸出酒精层。
   4. 确保完全去除顶层;氯仿层包含纯化的脂质。对于定量脂质提取，通过将残留物和滤纸与 100 mL 氯仿混合来回收捕获在组织残留物中的脂质。
   5. 通过漏斗过滤混合物，用总共 50 mL 的氯仿冲洗搅拌罐和残留物。在去除酒精层之前，将此滤液与原始滤液混合。
      注：过滤通常很快;用烧杯底部对干燥残留物施加压力，以确保溶剂的最大回收率。
6. 在烘箱中干燥样品，在干燥器中冷却至少 24 小时，将它们放入 110 °C 的烘箱中直至溶剂完全蒸发，在干燥器中进一步冷却过夜，最后重新称重。
7. 通过计算烧杯的初始重量和最终重量之间的差异来确定 IMF 含量。

4. 肉色

1. 使用黑色和白色标准板校准设备。将白色校准板放在板的中间附近。进行校准时，请使用板中间附近的区域。指示灯闪烁 3 次后，校准完成。
2. 在 4 °C 下 30 分钟后（开花时间）进行测量。从 LT 肌肉样品的三个不同位置获取颜色读数，小心避免结缔组织和脂肪。
3. 在室温 （20 °C） 下，根据这些测量值计算平均值，如建议的¹⁶.

5. 水损失

1. 评估所有样品的清除损失 （PL）。通过测量冷冻前初始重量与冷冻/解冻后最终重量之间的差异来确定牛里脊切片的 PL。
   注意：不要评估从未冷冻的对照牛里脊肉的 PL。
2. 通过肉类样品在 10 kg 的压力下 5 分钟前后的重量差（约 1.0 g）来测量持水能力 （WHC）¹⁷。

6. 客观的肉嫩度

注：Warner-Bratzler 剪切力 （WBSF） 的测量按描述^18,19 进行。

1. 将样品放在连接到玻璃耐火材料的网格上，并在工业电烤箱中烘烤直至达到 71 °C 的最终温度。 烹饪后，将样品冷却、称重并在 4 °C 下冷藏 24 小时。
2. 使用公式 确定烹饪损失 （CL）。
   1. 通过在蒸煮样品之前和之后称量耐火材料来确定滴水损失。为此，将样品放在玻璃耐火材料上的网格上，以便在烹饪过程中排出肉汁和脂肪。
   2. 通过在蒸煮前后仅称量样品来确定蒸发损失。
   3. 记录生重和熟重，并计算 DL 的百分比，即烹饪后滴注的重量除以解冻的肉样品的重量。
   4. 使用公式 [100 - （烹饪后重量）÷ 100] 计算蒸发损失百分比 （EVP） × 100]。
3. 为了测定 WBSF，使用质构仪对直径为 1.27 cm 的八个芯进行切片，配备 3.07 mm Warner-Bratzler 剪切力刀片和 V 形（60° 角）切削刃。
   1. 将结果报告为每个样品的 6 个值的平均值，以千克 （kg） 为单位，在排除低极值和高值¹⁹ 之后。

7. 生化检测

注意：死后蛋白水解是通过估计肌原纤维碎裂指数 （MFI） 来评估的，遵循 Culler 等人 ²⁰ 概述的原始程序，并由 Borges 等人 ²¹ 适用于印度牛。

1. 在含有 100 mM 氯化钾、20 mM 磷酸钾（pH 值为 7）、1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）、1 mM 氯化镁和 1 mM 叠氮化钠的缓冲溶液中，在 2 °C 下匀浆约 3 g LT 样品（脂肪剥离的肌肉组织和结缔组织）的片段，然后离心（1,000 × g 在 4 °C 下 15 分钟）。
   1. 使用搅拌棒将沉淀物重悬于 10 体积 （v/w） 的分离培养基中，然后再次以 1,000 × g 沉淀 15 分钟，倒出上清液。
   2. 将沉淀物重悬于 2.5 体积 （v/w） 的分离培养基中，并通过聚乙烯过滤器（18 目）分离结缔组织和碎片。使用额外的 2.5 体积 （v/w） 让肌原纤维通过过滤器。
   3. 使用 Gornall 等人 ²² 的双缩脲方法测定肌原纤维悬浮液的蛋白质浓度。用分离培养基将等分试样的肌原纤维悬浮液稀释至 0.5 ± 0.05 mg/mL 的蛋白质浓度。
   4. 立即测量该悬浮液在 540 nm 处的吸光度。使用 540 nm 的分光光度法测定 MFI。将吸光度乘以 200 以获得每个样品的 MFI（并将其报告为不带测量单位的指数）。

8. 分子生物学检测

注：为了分析牛骨骼肌中最丰富的蛋白质肌球蛋白重链 （MyHC），按照文献^23,24 中描述的方案处理来自两组的 LT 样品。

1. 使用梯度 SDS-PAGE 凝胶 （7-10%） 和 4% 浓缩凝胶实现电泳分离。将每个样品 25 μL 涂到凝胶上，并在 70 V、28 mA 和 4 °C 下运行 1 小时，然后在 180 V、12 mA 和 4 °C 下运行 29 小时。
2. 在运行中使用两种不同的缓冲液：上层凝胶缓冲液，包含甘氨酸、三（羟甲基）氨基甲烷碱、十二烷基硫酸钠 （SDS） 和蒸馏水，而下层凝胶缓冲液与上层缓冲液相同，添加了巯基乙醇。
3. 用考马斯蓝对凝胶进行染色，并使用适当的软件捕获图像。
4. 根据其分子量 （分别为 223.900、224.243 和 223.875 kDa） 鉴定 MyHC 亚型 （MyHC-I、MyHC-IIa、MyHC-IIx/d）。使用适当的软件，通过对对应于每种亚型的条带进行光密度测定进行半定量分析。
5. 使用 大鼠比目鱼肌 和 趾长伸肌 （EDL） 作为阳性对照对 MyHC 亚型进行分类，在每个凝胶中保留一个孔，用于加载 40 μL 处理样品。
6. 对于所有数据，使用以下模型通过 F 检验执行方差分析 （ANOVA）：
   Y_ij = μ + t_i + Ɛ_ij
   其中 Yij 是引用重复 j 中的处理 i 的实验单元的观测值;μ 是均值的一般效应;t 是治疗效果 （遗传组），ε 是实验误差。
7. 使用学生 t 检验比较均值，并采用 P 值 0.05 <临界概率。

结果

表 1 显示了本研究中研究的两个遗传群体的胴体特征。值得注意的是，在 HCW 、 REA 和 BFT 中发现了差异 （P < 0.01），杂交动物表现出更大的值，表明优势效应。

变量¹	内洛尔	F1 安格斯 x 内洛尔	SEM 扫描	P 值
终限带宽，kg	5...

讨论

在胴体评估过程中，准确测量 48 小时冷却期后的生长和质量性状以获得一致和可比的数据至关重要。这两个生物模型表现出不同的胴体性状，特别是 HCW 、 REA 和 BFT，这与其他研究中报告的结果一致。Nellore 公牛的平均 HCW 与巴西市场偏好一致，巴西市场优先考虑提高每动物单位的肉类产量，同时减少脂肪含量²⁵。相反，杂交牛 （Bos taurus × Bos indicus） 具有更高的胴?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Merk, Darmstadt, Germany	CAS 67-64-1 | 100014	solutions used for the electrophoretic separations
Anti-MYH-1 Antibody	Merk, Darmstadt, Germany	MABT846	Rat soleus
Anti-Myosin antibody	Abcam, Massachusetts, United States	ab37484	Myosin heavy chain
Anti-Myosin-2 (MYH2) Antibody	Merk, Darmstadt, Germany	MABT840	Extensor digitorum longus (EDL)
Biological oxygen demand (BOD) incubator	TECNAL, São Paulo, Brazil	TE-371/240L	Meat aging
Chloroform; absolute analytical reagent	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	67-66-3	Intramuscular fat
CIELab system	Konica Minolta Sensing, Tokyo, Japan	CR-400 colorimeter	Meat color
Coomassie Blue	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	C.I. 42655)	Myosin heavy chain
Electric oven	Venâncio Aires, Rio Grande do Sul, Brazil		Meat tenderness
Ethanol	Merk, Darmstadt, Germany	64-17-5	solutions used for the electrophoretic separations
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	60-00-4	Post-mortem proteolysis
Glass flasks	Sigma-Aldrich, Missouri, United States		solutions used for the electrophoretic separations
Glycine	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	G6761	Myosin heavy chain
Infrared spectroscopy - FoodScan	Foss NIRSystems, Madson, United States	FoodScan™ 2	Intramuscular fat
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	7786-30-3	Post-mortem proteolysis
Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	M6250	Myosin heavy chain
Methanol, absolute analytical reagent	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	67-56-1	Intramuscular fat
pH meter	LineLab, São Paulo, Brazil	AKLA 71980	Meat pH
PlusOne 2-D Quant Kit	GE Healthcare Product	Code 80-6483-56	Post-mortem proteolysis
Polypropylene	Sigma-Aldrich, Missouri, United States		solutions used for the electrophoretic separations
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	7447-40-7	Post-mortem proteolysis
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	P0662	Post-mortem proteolysis
R software	Vienna, Austria	version 3.6.2	Data analysis
Sodium azide	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	26628-22-8	Post-mortem proteolysis
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	822050	Myosin heavy chain
Spectrophotometer	Perkin Elmer, Shelton, United States	Perkin Elmer Lambda 25 UV/Vis	Post-mortem proteolysis
Statistical Analysis System	SAS, Cary, North Carolina, United States	version 9.1,	Data analysis
Texture Analyzer	AMETEK Brookfield, Massachusetts, United States	CTX	Meat tenderness
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	77-86-1	Myosin heavy chain
Ultrafreezer	Indrel Scientific, Londrina, Paraná, Brazil.	INDREL IULT 335 D - LCD	Sample storage
Ultrapure water	Elga PURELAB Ultra Ionic system		solutions used for the electrophoretic separations
Ultra-Turrax high shear mixer	Marconi – MA102/E, Piracicaba, São Paulo, Brazil		Post-mortem proteolysis