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Resumo

Investigamos o tecido muscular esquelético em Bos indicus e touros mestiços para explicar as diferenças nas características de qualidade da carne. A força de cisalhamento Warner-Bratzler (WBSF) variou de 4,7 kg a 4,2 kg. As isoformas de cadeia pesada da miosina revelaram diferenças entre os animais, e o índice de fragmentação da miofibrila forneceu mais informações sobre as variações da maciez (WBSF).

Resumo

Este estudo investigou o tecido muscular em touros Bos indicus e mestiços para explicar as diferenças nas características de qualidade da carne. Características de carcaça, parâmetros de qualidade da carne e investigações bioquímicas e moleculares de proteínas miofibrilares são descritas. Métodos para avaliar pH, gordura intramuscular (IMF), cor da carne (L*, a*, b*), perdas de água, maciez e ensaios de biologia molecular foram delineados. São descritos procedimentos específicos detalhando a calibração, a preparação da amostra e a análise de dados para cada método. Isso inclui técnicas como espectroscopia de infravermelho para conteúdo de IMF, avaliação objetiva de maciez e separação eletroforética de isoformas de MyHC.

Os parâmetros de cor foram destacados como ferramentas potenciais para prever a maciez da carne bovina, uma característica de qualidade crucial que influencia as decisões do consumidor. O estudo empregou o método da força de cisalhamento de Warner-Bratzler (WBSF), revelando valores de 4,68 e 4,23 kg para Nelore e Angus-Nelore (P < 0,01), respectivamente. As perdas totais por cozimento e as análises bioquímicas, incluindo o índice de fragmentação miofibrilar (MFI), forneceram informações sobre as variações de maciez. Tipos de fibras musculares, particularmente isoformas de cadeia pesada de miosina (MyHC), foram investigados, com notável ausência da isoforma MyHC-IIb nos animais zebuínos estudados. A relação entre MyHC-I e maciez da carne revelou achados divergentes na literatura, destacando a complexidade dessa associação. No geral, o estudo fornece informações abrangentes sobre os fatores que influenciam a qualidade da carne em touros Bos indicus e mestiços (Bos taurus × Bos indicus), oferecendo informações valiosas para a indústria de carne bovina.

Introdução

O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo, com aproximadamente 220 milhões de animais e sendo o segundo maior produtor de carne, produzindo mais de 9 milhões de toneladas métricas de carcaça equivalente anualmente1. O setor de produção de bovinos de corte contribui significativamente para o sistema agrícola nacional, com faturamento anual total superior a R$ 55 bilhões. Desde 2004, o Brasil tem sido um ator chave no comércio global de carne, exportando para mais de 180 países, o que representa ~ 50% do comércio mundial de carne2.

A maciez da carne destaca-se como o atributo primordial da qualidade que influencia a satisfação do consumidor e o consumo de carne3. Ao empregar métodos bioquímicos e objetivos para medir a maciez da carne, os pesquisadores pretendem fornecer informações valiosas sobre fatores como genética animal, técnicas de processamento e condições de armazenamento, melhorando a qualidade e a consistência dos produtos cárneos para os consumidores. Essas informações são úteis porque a maciez da carne ganhou cada vez mais importância na tomada de decisão do consumidor durante as compras. Além disso, a avaliação da maciez da carne fornece informações valiosas para o controle de qualidade nas indústrias de produção e processamento de carne. Ao monitorar consistentemente a maciez, os produtores podem garantir que os produtos à base de carne atendam aos padrões e especificações desejados. Nesse contexto, os produtores brasileiros de gado de corte estão adotando progressivamente sistemas intensivos de confinamento com animais mestiços para aumentar o giro de capital. Esse sistema é responsável por cerca de 10% das toneladas de carcaça produzidas anualmente no Brasil 4,5.

A crescente demanda por melhor qualidade da carne pelos consumidores levou os produtores de gado de corte a cruzar com raças europeias, principalmente Aberdeen Angus6. Essa estratégia visa produzir híbridos F1 Angus-Nelore, conhecidos por desempenho superior, características de carcaça desejáveis e melhor qualidade da carne em comparação com animais zebuínos puros 7,8. Nas regiões tropicais do Brasil, é prática comum a utilização de animais não castrados (touros) de maturidade avançada em fazendas de terminação, potencialmente comprometendo atributos de qualidade da carne, como cor, marmoreio e maciez. Destaca-se que 95% dos animais terminados em confinamento brasileiros são machos, sendo 73% Nelore, seguidos por 22% de animais mestiços e 5% de outros genótipos 9,10.

Compreender os mecanismos bioquímicos subjacentes à maciez da carne é crucial para melhorar a qualidade da carne. Um aspecto fundamental é a proteólise post-mortem, que afeta a integridade estrutural das fibras musculares11. O índice de fragmentação miofibrilar (MFI) é um ensaio bioquímico amplamente utilizado que quantifica a extensão da degradação miofibrilar, fornecendo informações sobre a maciez da carne12. O método MFI envolve a medição da fragmentação das proteínas miofibrilares, que se correlaciona diretamente com a maciez da carne. Este ensaio complementa as avaliações tradicionais da qualidade da carne e oferece uma compreensão mais profunda dos processos bioquímicos que contribuem para as variações na maciez da carne.

Nesse contexto, o presente estudo investigou o músculo esquelético de touros Bos indicus versus touros mestiços (Bos taurus × Bos indicus) terminados em confinamento, com o objetivo de explicar diferenças nas características de qualidade da carne.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais obedeceram às normas éticas de pesquisa estabelecidas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP Campus de Botucatu, sob o protocolo 0171/2018.

1. Animais experimentais

  1. Terminar 30 touros Nelore (Bos indicus) e 30 touros F1 Angus-Nelore (Bos taurus × Bos indicus), com idade entre 20 e 24 meses, em confinamento. Alojar os dois grupos de animais em baias coletivas de 5 m x 6 m com piso de concreto e equipadas com bebedouros tipo concha, acomodando até cinco animais por baia. Certifique-se de que todos os animais pertençam ao mesmo grupo de manejo (nascidos e criados na mesma fazenda) e sejam submetidos ao mesmo período de confinamento.
    NOTA: Neste estudo, os touros Nelore apresentaram peso corporal inicial médio de 370,7 kg, enquanto os touros Angus-Nelore F1 apresentaram peso corporal inicial médio de 380,8 ± 17 kg.
  2. Dieta de confinamento
    1. Certifique-se de que a dieta de terminação seja composta por 11,3% de volumoso (feno de Tifton e bagaço de cana-de-açúcar) e 88,7% de concentrados (grãos de milho secos moídos, farelo de soja, grãos úmidos de destilaria de milho, ração com glúten de milho seco e núcleo mineral). Alimentar os animais por 120 dias e fornecer as dietas ad libitum duas vezes ao dia (às 10h00 e 16h00).
  3. Chacinar
    1. Registar o peso corporal final (BWf) no final do período experimental. Processar todos os animais em um matadouro próximo, seguindo os procedimentos de inspeção padrão. Antes do abate, certifique-se de que os animais sejam submetidos a um jejum mínimo de 16 horas, abstendo-se de ração e água.
      NOTA: Os touros F1 Angus-Nelore apresentaram um peso corporal final de 615,09 ± 57,53 kg, enquanto os touros Nelore tiveram um peso de 545,47 ± 11,45 kg.
  4. Avaliação de características de carcaça
    1. Pesar inicialmente as carcaças de bovino e, em seguida, submetê-las a um período de arrefecimento a 2-4 °C durante 48 h. As medidas incluem peso de carcaça quente (HCW), área de olho de lombo (REA) e espessura de toucinho (BFT) na interface12º/13º costela, conforme recomendado13. Determine o REA usando o método de grade com uma grade pequena (18 cm x 13 cm) e meça o BFT em milímetros usando um paquímetro.
      1. Meça o REA em cada carcaça usando uma grade reticulada (a mesma usada no sistema de classificação Yield Grade do USDA), dividida em quadrados de 1 cm² com um ponto no meio. Adicione todos os quadrados dentro do perímetro de traçado de lombo e aqueles ao longo do contorno do traçado que passa pelo ponto do meio.
      2. Meça o BFT em uma posição específica no local de avaliação em qualquer lugar entre as12ª/13ª costelas. Para determinar esta posição, meça o comprimento do olho de lombo; então, começando na borda medial "A", determine um ponto três quartos do caminho ao longo do olho de lombo e a meio caminho de "B". Passe um paquímetro por este ponto e em ângulo reto com a costela especificada até a interface entre a gordura subcutânea e a gordura intermuscular. Meça a gordura subcutânea colocando o paquímetro em ângulo reto com a linha da gordura subcutânea, a partir do ponto de interface (Figura Suplementar S1).
  5. Amostragem
    1. Amostra de Longissimus thoracis (LT) da meia-carcaça esquerda (porção de ± 12,0 cm de carne), entre a11ª e a13ª costelas no sentido cranial. No laboratório, corte as amostras de carne em bifes de 2,54 cm.
  6. Envelhecimento
    1. Avalie as características de qualidade da carne após um período de maturação úmida de 14 dias a uma temperatura de 0-2 °C em uma incubadora de demanda biológica de oxigênio (DBO). Use bifes de 2,54 cm de espessura para a análise da cor da carne, pH, gordura intramuscular, perda de purga, capacidade de retenção de água, maciez objetiva e perdas por cozimento. Embale os bifes separadamente em sacos plásticos para alto vácuo e baixa permeabilidade ao oxigênio e, após atingir o tempo de envelhecimento, mantenha-os congelados a -20 °C até o momento da análise. Descongele as amostras de carne a 4 °C durante 24 h e exponha-as ao oxigénio durante 30 min a 4 °C (época de floração).

2. pH da carne

  1. Meça o pH da carne usando um medidor de pH digital equipado com uma sonda de penetração. Calibre-o com tampões de pH 4.0 e 7.0 a uma temperatura ambiente de 25 °C. Meça o pH da carne em três locais da amostra de músculo LT. Registre manualmente as leituras de dados e posteriormente exporte a folha de dados; calcular a média das três leituras para o pH da carne.

3. Gordura intramuscular

NOTA: O teor de gordura intramuscular (IMF) foi determinado por espectroscopia de infravermelho próximo (NIR)14 e pelo método gravimétrico15.

  1. Remova a gordura subcutânea do músculo LT usando um bisturi. Em seguida, moa e homogeneize o bife por 5 min usando uma batedeira, incorporando aproximadamente 180 g da amostra. Coloque a amostra em um copo, posicione-a dentro da câmara de amostra e execute a subvarredura de várias zonas da amostra de teste girando o copo de amostra; mescle as zonas para o resultado final.
  2. Faça três leituras para cada amostra. Após a homogeneização, colocar as amostras na placa para posterior leitura. Defina o aparelho para transmissão NIR, com um monocromador de grade móvel varrendo a região de 850 nm a 1050 nm.
  3. Exporte a folha de dados e calcule a média de três leituras para o FMI. Expresse os resultados em porcentagem, usando a fórmula: [(IMF média ÷ peso amostral) × 100].
  4. Combine homogeneizar as amostras de músculo LT (3,0 g) com uma solução de clorofórmio / metanol metanol / clorofórmio (2: 1) por 2 min e submeta-as à centrifugação (700 × g; 10 min; 20 ° C) para segregar as fases hidrofílica (superior), sólida (média) e hidrofóbica (inferior).
  5. Filtrar a fase hidrofóbica obtida após centrifugação utilizando um papel de filtro sobre uma funil com ligeira sucção. Transferir o filtrado (fase inferior; lípidos em clorofórmio) para um balão rotulado como fase lipídica e transferir pelo menos 5 mm de filtrado para um balão de copo pré-pesado, depois de o deixar repousar durante alguns minutos. Em seguida, registre o volume da camada de clorofórmio (pelo menos 150 mL) e aspire a camada alcoólica.
    1. Homogeneizar alíquotas de 100 g da amostra de tecido fresco ou congelado durante 2 min com uma mistura de 100 ml de clorofórmio e 200 ml de metanol. Adicione 100 mL de clorofórmio à mistura, misture por 30 s, adicione 100 mL de água destilada e bata por mais 30 s.
    2. Filtrar o homogeneizado com papel de filtro num funil com ligeira sucção. Aplique pressão com o fundo de um béquer quando o resíduo ficar seco para garantir a recuperação máxima do solvente.
    3. Transferir o filtrado para uma garrafa graduada de 500 ml e deixar repousar durante alguns minutos para permitir a separação e clarificação. Registar o volume da camada de clorofórmio (pelo menos 150 ml) e aspirar a camada alcoólica.
    4. Certifique-se de remover completamente a camada superior; A camada de clorofórmio contém o lipídio purificado. Para extração lipídica quantitativa, recupere o lipídio preso no resíduo do tecido misturando o resíduo e o papel de filtro com 100 mL de clorofórmio.
    5. Filtrar a mistura através do funil e lavar o copo misturador e os resíduos com um total de 50 ml de clorofórmio. Misturar este filtrado com o filtrado original antes de retirar a camada alcoólica.
      NOTA: A filtração é normalmente rápida; Aplique pressão com o fundo de um béquer sobre o resíduo seco para garantir a recuperação máxima do solvente.
  6. Secar as amostras numa estufa, arrefecê-las num exsicador durante, pelo menos, 24 h, colocá-las numa estufa a 110 °C até à evaporação completa do solvente, arrefecê-las num exsicador durante a noite e, por fim, pesá-las novamente.
  7. Determinar o teor de IMF calculando a diferença entre os pesos inicial e final do copo.

4. Cor da carne

  1. Calibre o dispositivo usando uma placa padrão preta e branca. Coloque a placa de calibração branca perto do meio da placa. Ao fazer uma calibração, use a área próxima ao meio da placa. A calibração está concluída depois que a lâmpada pisca três vezes.
  2. Faça medições após 30 min a 4 °C (tempo de floração). Obtenha leituras de cores de três locais diferentes na amostra de músculo LT, evitando cuidadosamente o tecido conjuntivo e a gordura.
  3. À temperatura ambiente (20 °C), calcule uma média a partir dessas medições, conforme recomendado16.

5. Perdas de água

  1. Avalie a perda de purga (PL) para todas as amostras. Determine o PL das seções de lombo bovino medindo a variação entre o peso inicial antes do congelamento e o peso final após o congelamento / descongelamento.
    NOTA: Não avalie o PL de lombos bovinos de controle nunca congelados.
  2. Avalie a capacidade de retenção de água (WHC) pela diferença de peso de uma amostra de carne (aproximadamente 1,0 g) antes e depois de ser submetida a uma pressão de 10 kg por 5 min17.

6. Sensibilidade objetiva da carne

NOTA: A medida da força de cisalhamento de Warner-Bratzler (WBSF) foi realizada conforme descrito18,19.

  1. Posicionar as amostras numa grelha fixada a um refratário de vidro e cozer-nas num forno eléctrico industrial até atingir a temperatura final de 71 °C. Após a cozedura, arrefecer, pesar e refrigerar as amostras a 4 °C durante 24 h.
  2. Determine as perdas por cozimento (CL) usando a fórmula figure-protocol-10319.
    1. Determine a perda por gotejamento pesando o refratário antes e depois de cozinhar a amostra. Para isso, coloque as amostras em uma grade sobre um refratário de vidro para permitir a drenagem dos sucos e gorduras da carne durante o cozimento.
    2. Determine a perda por evaporação pesando apenas a amostra antes e depois do cozimento.
    3. Registre os pesos crus e cozidos e calcule a porcentagem de DL como o peso do gotejamento após o cozimento dividido pelo peso da amostra de carne descongelada.
    4. Calcular a percentagem de perda por evaporação (EVP) utilizando a fórmula [100 - (peso após cozedura) ÷ peso bruto × 100].
  3. Para a determinação da WBSF, seccionamos oito testemunhos com diâmetro de 1,27 cm utilizando um analisador de textura, equipado com lâmina Warner-Bratzler Shear Force de 3,07 mm e aresta cortante em forma de V (ângulo de 60°).
    1. Relate os resultados como a média de seis valores por amostra, em quilogramas (kg), após a exclusão dos extremos baixo e alto19.

7. Ensaio bioquímico

NOTA: A proteólise post-mortem foi avaliada estimando-se o índice de fragmentação miofibrilar (IMF), seguindo o procedimento original descrito por Culler et al.20 e adaptado para bovinos Bos indicus por Borges et al.21.

  1. Homogeneizar fragmentos de aproximadamente 3 g de amostras de LT (tecido muscular sem gordura e tecido conjuntivo) em uma solução tampão contendo 100 mM de cloreto de potássio, 20 mM de fosfato de potássio a pH 7, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1 mM de cloreto de magnésio e 1 mM de azida sódica a 2 °C, seguido de centrifugação (1.000 × g por 15 min a 4 °C).
    1. Ressuspender o sedimento em 10 volumes (v/m) de meio isolante com uma haste de agitação, depois sedimentá-lo novamente a 1.000 × g durante 15 min e decantar o sobrenadante.
    2. Ressuspender o sedimento em 2,5 volumes (v/p) de meio isolante e separar o tecido conjuntivo e os detritos passando-o por um filtro de polietileno (malha 18). Use 2,5 volumes adicionais (v/p) para permitir que as miofibrilas passem pelo filtro.
    3. Determinar a concentração proteica da suspensão de miofibrilas usando o método do biureto de Gornall et al.22. Diluir uma alíquota da suspensão miofibrilar com meio isolante até uma concentração proteica de 0,5 ± 0,05 mg/ml.
    4. Medir imediatamente a absorvância desta suspensão a 540 nm. Determinar a IFM por espectrofotometria a 540 nm. Multiplique a absorbância por 200 para obter o MFI para cada amostra (e relate-o como um índice sem uma unidade de medida).

8. Ensaio de biologia molecular

NOTA: Para a análise da cadeia pesada da miosina (MyHC), a proteína mais abundante no músculo esquelético bovino, as amostras de LT de ambos os grupos foram processadas seguindo o protocolo descrito na literatura23,24.

  1. Obtenha a separação eletroforética usando um gel SDS-PAGE gradiente (7-10%) e um gel de empilhamento a 4%. Aplique 25 μL de cada amostra ao gel e execute-o a 70 V, 28 mA e 4 ° C por 1 h, seguido por uma execução a 180 V, 12 mA e 4 ° C por 29 h.
  2. Empregue dois tampões diferentes nas corridas: o tampão de gel superior composto por glicina, base de Tris (hidroximetil) aminometano, dodecil sulfato de sódio (SDS) e água destilada, enquanto o tampão de gel inferior é idêntico ao tampão superior, com a adição de mercaptoetanol.
  3. Pinte os géis com Coomassie Blue e capture imagens usando o software apropriado.
  4. Identifique as isoformas de MyHC (MyHC-I, MyHC-IIa, MyHC-IIx/d) com base em seus pesos moleculares (223.900, 224.243 e 223.875 kDa, respectivamente). Realizar análises semiquantitativas por densitometria das bandas correspondentes a cada isoforma, utilizando software apropriado.
  5. Empregue o músculo sóleo de rato e extensor longo dos dedos (EDL) como controles positivos para classificar as isoformas de MyHC, reservando um poço em cada gel para carregar 40 μL da amostra processada.
  6. Para todos os dados, realizar a análise de variância (ANOVA) pelo teste F, utilizando o seguinte modelo:
    Yij = μ + ti + Ɛij
    onde Yij é o valor observado da unidade experimental referente ao tratamento i na repetição j; μ é o efeito geral da média; t é o efeito do tratamento (grupo genético) e ε é o erro experimental.
  7. Compare as médias usando o teste t de Student e adote o valor de P < 0,05 como probabilidade crítica.

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Resultados

A Tabela 1 apresenta as características de carcaça dos dois grupos genéticos investigados neste estudo. Notavelmente, foram identificadas diferenças (P < 0,01) em PCS, REA e BFT, com animais mestiços exibindo maiores valores, sugerindo um efeito de heterose.

Variável¹NeloreF1 Angus x NeloreSEMValor de p

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Discussão

Durante a avaliação da carcaça, é crucial medir com precisão as características de crescimento e qualidade após um período de resfriamento de 48 h para obter dados consistentes e comparáveis. Os dois modelos biológicos exibiram características de carcaça divergentes, particularmente HCW, REA e BFT, que são consistentes com os achados relatados em outros estudos. A média de PCS de touros Nelore está alinhada com as preferências do mercado brasileiro, que prioriza maior produção de carne por unidade anima...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pela FAPESP (processos 2023/05002-3; 2023/02662-2 e 2024/09871-9), CAPES (código de financiamento 001), CNPq (304158/2022-4) e pelo PROPE (IEPe-RC processo número 149) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneMerk, Darmstadt, GermanyCAS 67-64-1 | 100014solutions used for the electrophoretic separations
Anti-MYH-1 AntibodyMerk, Darmstadt, GermanyMABT846Rat soleus
Anti-Myosin antibodyAbcam, Massachusetts, United Statesab37484Myosin heavy chain
Anti-Myosin-2 (MYH2) AntibodyMerk, Darmstadt, GermanyMABT840Extensor digitorum longus (EDL)
Biological oxygen demand (BOD) incubatorTECNAL, São Paulo, BrazilTE-371/240LMeat aging
Chloroform; absolute analytical reagentSigma-Aldrich, Missouri, United States67-66-3Intramuscular fat
CIELab systemKonica Minolta Sensing, Tokyo, JapanCR-400 colorimeterMeat color
Coomassie BlueSigma-Aldrich, Missouri, United StatesC.I. 42655)Myosin heavy chain
Electric ovenVenâncio Aires, Rio Grande do Sul, BrazilMeat tenderness
EthanolMerk, Darmstadt, Germany64-17-5solutions used for the electrophoretic separations
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-Aldrich, Missouri, United States60-00-4Post-mortem proteolysis
Glass flasksSigma-Aldrich, Missouri, United Statessolutions used for the electrophoretic separations
GlycineSigma-Aldrich, Missouri, United StatesG6761Myosin heavy chain
Infrared spectroscopy - FoodScanFoss NIRSystems, Madson, United StatesFoodScan™ 2Intramuscular fat
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, Missouri, United States 7786-30-3Post-mortem proteolysis
MercaptoetanolSigma-Aldrich, Missouri, United StatesM6250Myosin heavy chain
Methanol, absolute analytical reagentSigma-Aldrich, Missouri, United States67-56-1Intramuscular fat
pH meterLineLab, São Paulo, BrazilAKLA 71980Meat pH
PlusOne 2-D Quant KitGE Healthcare ProductCode 80-6483-56Post-mortem proteolysis
PolypropyleneSigma-Aldrich, Missouri, United Statessolutions used for the electrophoretic separations
Potassium chlorideSigma-Aldrich, Missouri, United States7447-40-7Post-mortem proteolysis
Potassium phosphateSigma-Aldrich, Missouri, United StatesP0662Post-mortem proteolysis
R softwareVienna, Austriaversion 3.6.2Data analysis
Sodium azideSigma-Aldrich, Missouri, United States26628-22-8Post-mortem proteolysis
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich, Missouri, United States822050Myosin heavy chain
SpectrophotometerPerkin Elmer, Shelton, United StatesPerkin Elmer
Lambda 25 UV/Vis		Post-mortem proteolysis
Statistical Analysis SystemSAS, Cary, North Carolina, United Statesversion 9.1,Data analysis
Texture AnalyzerAMETEK Brookfield, Massachusetts, United
States		CTXMeat tenderness
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-Aldrich, Missouri, United States77-86-1Myosin heavy chain
UltrafreezerIndrel Scientific, Londrina, Paraná, Brazil.INDREL IULT 335 D - LCDSample storage
Ultrapure waterElga PURELAB Ultra Ionic systemsolutions used for the electrophoretic separations
Ultra-Turrax high shear mixerMarconi – MA102/E, Piracicaba, São Paulo, BrazilPost-mortem proteolysis

Referências

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