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要約

我々は、Bos indicusと交雑した雄牛の骨格筋組織を調査し、肉質特性の違いを説明しました。ワーナー・ブラッツラーせん断力(WBSF)は、4.7 kgから4.2 kgの範囲であることがわかりました。ミオシン重鎖アイソフォームは動物間の違いを明らかにし、筋原線維断片化指数は圧痛(WBSF)の変動に関するさらなる洞察を提供しました。

要約

この研究では、 Bos indicus と交雑種の雄牛の筋肉組織を調査して、肉質特性の違いを説明しました。枝肉形質、肉質パラメータ、および筋原線維タンパク質の生化学的および分子的研究について説明します。pH、筋肉内脂肪(IMF)、肉の色(L *、 a *、 b *)、水分損失、柔らかさ、および分子生物学的アッセイを評価する方法が概説されています。各メソッドのキャリブレーション、サンプル調製、およびデータ解析の詳細について説明する具体的な手順について説明します。これらには、IMF含有量の赤外分光法、客観的な圧痛評価、MyHCアイソフォームの電気泳動分離などの技術が含まれます。

カラーパラメータは、消費者の意思決定に影響を与える重要な品質特性である牛肉の柔らかさを予測するための潜在的なツールとして注目されました。この研究では、ワーナー・ブラッツラーせん断力(WBSF)法を採用し、ネロールとアンガス・ネロールでそれぞれ4.68kgと4.23kg(P < 0.01)の値を明らかにしました。総調理ロスと筋原線維断片化指数(MFI)を含む生化学的分析により、柔らかさの変動に関する洞察が得られました。筋繊維の種類、特にミオシン重鎖(MyHC)アイソフォームが調査されましたが、研究されたZebu動物にはMyHC-IIbアイソフォームが顕著に存在しませんでした。MyHC-Iと肉の柔らかさとの関係は、文献で異なる結果を明らかにし、この関連性の複雑さを強調しています。全体として、この研究は、ボス・インディカスと交雑種(ボス・トーラス×ボス・インディカス)の肉質に影響を与える要因に関する包括的な洞察を提供し、牛肉業界に貴重な情報を提供します。

概要

ブラジルは、約2億2,000万頭を数える世界最大の商業用牛の群れを擁し、世界第2位の食肉生産国としてランク付けされており、年間900万トン以上の枝肉相当を産出しています1。肉牛の生産部門は、国の農業システムに大きく貢献しており、年間総売上高は550億レアルを超えています。2004年以来、ブラジルは世界の食肉貿易において重要な役割を果たしており、世界の食肉貿易の~50%を占める180カ国以上に輸出しています2。

肉の柔らかさは、消費者の満足度と肉の消費に影響を与える最も重要な品質属性として際立っています3。研究者は、生化学的かつ客観的な方法を用いて肉の柔らかさを測定することで、動物の遺伝学、加工技術、保管条件などの要因に関する貴重な洞察を提供し、最終的には消費者の食肉製品の品質と一貫性を向上させることを目指しています。このような情報は、購入時の消費者の意思決定において肉の柔らかさが重要性を増しているため、有用です。さらに、肉の柔らかさの評価は、食肉生産および加工業界の品質管理に貴重な情報を提供します。生産者は、柔らかさを一貫して監視することで、食肉製品が望ましい基準と仕様を満たしていることを確認できます。このような状況の中、ブラジルの肉用牛生産者は、資本回転率を高めるために、交配種を使用した集中的な肥育場システムを徐々に採用しています。このシステムは、ブラジルで年間生産される枝肉の約10%トンを占めています4,5。

消費者による肉質向上への要求の高まりにより、肉用牛の生産者は、主にアバディーンアンガス6などのヨーロッパの品種と交配するようになりました。この戦略は、純粋なゼブ動物と比較して、優れた性能、望ましい枝肉形質、および強化された肉質で知られるF1アンガス-ネロールハイブリッドを生産することを目的としています7,8。ブラジルの熱帯地域では、成熟度が進んだ非去勢動物(雄牛)を仕上げ農場に利用するのが一般的であり、色、霜降り、柔らかさなどの肉質の属性が損なわれる可能性があります。特に、ブラジルの肥育場で終了した動物の95%が雄で、73%がネロールで、次いで22%が交雑種、5%がその他の遺伝子型であることが調査で明らかになりました9,10。

肉の柔らかさの根底にある生化学的メカニズムを理解することは、肉の品質を向上させるために非常に重要です。1つの重要な側面は、筋線維の構造的完全性に影響を与える死後タンパク質分解です11。筋原線維断片化指数(MFI)は、筋原線維分解の程度を定量化する広く使用されている生化学的アッセイであり、肉の柔らかさに関する洞察を提供します12。MFI法では、筋原線維タンパク質の断片化を測定することで、これは肉の柔らかさと直接相関します。このアッセイは、従来の食肉品質評価を補完し、肉の柔らかさの変動に寄与する生化学的プロセスをより深く理解することができます。

これに関連して、本研究では、肥育場で仕上げられた Bos indicus と交雑種(Bos taurus × Bos indicus)の雄牛の骨格筋を調査し、肉質特性の違いを説明することを目的としています。

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プロトコル

動物に関するすべての手続きは、UNESPボツカトゥキャンパスの動物使用倫理委員会(CEUA)がプロトコール0171/2018に基づいて定めた倫理研究基準に準拠していました。

1.実験動物

  1. 肥育場で、20〜24か月齢のネロール雄牛30頭(Bos indicus)とF1アンガス・ネロール雄牛30頭(Bos taurus × Bos indicus)をフィニッシュします。コンクリートの床とシェルタイプの水桶を備えた5 m x 6 mの集合囲いに両方の動物のグループを収容し、囲いごとに最大5匹の動物を収容できます。すべての動物が同じ管理グループ(同じ農場で生まれ育った)に属し、同じ肥育場期間に提出されていることを確認してください。
    注:この研究では、ネロール雄牛の平均初期体重は370.7 kgでしたが、F1アンガス-ネロール雄牛の平均初期体重は380.8 ± 17 kgでした。
  2. 肥育場ダイエット
    1. 仕上げ飼料が11.3%の粗飼料(ティフトン干し草とサトウキビのバガス)と88.7%の濃縮物(挽いた乾燥トウモロコシ穀物、大豆ミール、コーンウェット蒸留穀物、乾燥コーングルテン飼料、ミネラルコア)で構成されていることを確認してください。動物に120日間餌を与え、1 日2回 (午前10時と午後4時)自由に食事を提供します。
  3. 殺戮
    1. 実験期間の終了時に最終体重(BWf)を登録します。すべての動物は近くの食肉処理場で処理し、標準的な検査手順を順守します。屠殺の前に、動物が飼料と水の両方を控えて、最低16時間の絶食を受けることを確認してください。
      注:F1アンガス・ネロールの雄牛は615.09±57.53kgの最終体重を示し、ネロールの雄牛の体重は545.47±11.45kgでした。
  4. 枝肉形質の評価
    1. 最初に牛肉の枝肉の重さを量り、次に2〜4°Cで48時間冷却します。測定値には、推奨される13のように、12番目/13番目の肋骨界面でのホットカーカス重量(HCW)、リブアイ面積(REA)、および背脂肪の厚さ(BFT)が含まれます。小さなグリッド(18 cm x 13 cm)のグリッド法を使用してREAを決定し、キャリパーを使用してBFTをミリメートル単位で測定します。
      1. 各枝肉のREAは、網目状のグリッド(USDAのイールドグレード分類システムで使用されているものと同じ)を使用して測定し、中央に1つのドットがある1cm²の正方形に分割します。リブアイトレースの周囲にあるすべての正方形と、中央のドットを通るトレースの輪郭に沿った正方形を追加します。
      2. 評価サイトの 12番目と 13番目の 肋骨の間の任意の位置で BFT を測定します。この位置を決定するには、リブアイの長さを測定します。次に、内側の境界「A」から始めて、リブアイに沿って4分の3、「B」の半分の点を決定します。この点を通し、指定された肋骨に対して皮下脂肪と筋肉間脂肪との間の界面に直角にキャリパーを取ります。界面点から皮下脂肪の線に対して直角にキャリパーを配置して、皮下脂肪を測定します(補足図S1)。
  5. サンプリング
    1. 左半分の枝肉(±肉12.0cmの一部)、頭蓋方向の11番目と13番目の肋骨の間からLongissimus thoracis(LT)をサンプリングします。実験室で、肉サンプルを2.54cmのステーキに切片付けします。
  6. 老化
    1. 生物学的酸素要求量(BOD)インキュベーター内で0〜2°Cの温度で14日間のウェットエイジング期間後の肉質特性を評価します。肉の色、pH、筋肉内脂肪、パージ損失、保水能力、客観的な柔らかさ、調理損失の分析には、厚さ2.54cmのステーキを使用します。ステーキは高真空・低酸素透過性のビニール袋に別々に詰め、熟成時間に達した後は分析時まで-20°Cで冷凍保存します。牛肉のサンプルを4°Cで24時間解凍し、4°Cで30分間酸素にさらします(開花時間)。

2.肉のpH

  1. 浸透プローブを備えたデジタルpHゲージを使用して、肉のpHを測定します。pH 4.0および7.0のバッファーを使用して、室温25°Cでキャリブレーションします。 LT筋肉サンプルの3か所で肉のpHを測定します。データの読み取り値を手動で記録し、その後データシートをエクスポートします。肉のpHの3つの測定値の平均を計算します。

3.筋肉内脂肪

注:筋肉内脂肪(IMF)含有量は、近赤外(NIR)分光法14 および重量法15を使用して決定されました。

  1. LT筋から皮下脂肪をメスで取り除きます。次に、ミキサーを使用してステーキを5分間粉砕し、約180gのサンプルを組み込んで均質化します。サンプルをカップに入れ、サンプルチャンバー内に配置して、サンプルカップを回転させてテストサンプルのさまざまなゾーンのサブスキャンを実行します。最終結果のゾーンをマージします。
  2. サンプルごとに3回読み取ります。均質化後、サンプルをプレートに入れて後で読み取ります。装置をNIR透過に設定し、移動格子モノクロメーターで850nmから1050nmまでの領域をスキャンします。
  3. データシートをエクスポートし、IMFの平均3読み取り値を計算します。[(IMF平均サンプル重量)×100]という式を使用して、結果をパーセンテージで表します÷。
  4. LT筋肉サンプル(3.0 g)をクロロホルム/メタノールメタノール/クロロホルム(2:1)溶液と2分間ホモジナイズし、遠心分離(700 × g、10分、20°C)にかけ、親水性(上)、固体(中)、および疎水性(下)の相を分離します。
  5. 遠心分離後に得られた疎水性相を、わずかに吸引する漏斗に濾紙を使用してろ過します。ろ液(底相;クロロホルム中の脂質)を脂質相とラベル付けされたフラスコに移し、数分間放置した後、少なくとも5 mmのろ液を予め秤量したビーカーフラスコに移します。次に、クロロホルム層の容量(少なくとも150mL)を記録し、アルコール層を吸引します。
    1. 新鮮組織または凍結組織のサンプル100gアリコートを、100 mLのクロロホルムと200 mLのメタノールの混合物で2分間ホモジナイズします。混合物に100 mLのクロロホルムを加え、30秒間ブレンドし、100 mLの蒸留水を加え、さらに30秒間ブレンドします。
    2. ホモジネートを濾紙で濾過し、漏斗でわずかに吸引します。残留物が乾燥したらビーカーの底で圧力をかけ、溶剤の回収率を最大限に高めます。
    3. 濾液を500 mLメスシリンダーに移し、数分間放置して分離と清澄化を行います。クロロホルム層の容量(少なくとも150mL)を記録し、アルコール層を吸引します。
    4. 最上層を完全に削除してください。クロロホルム層には精製された脂質が含まれています。定量的な脂質抽出には、組織残渣に閉じ込められた脂質を、残渣と濾紙に100mLのクロロホルムをブレンドして回収します。
    5. 混合物を漏斗でろ過し、ブレンダージャーと残留物を合計50mLのクロロホルムですすいでください。アルコール層を除去する前に、この濾液を元の濾液と混合します。
      注:ろ過は通常迅速です。ビーカーの底で乾燥残留物に圧力をかけ、溶剤の回収率を最大限に高めます。
  6. サンプルをオーブンで乾燥させ、デシケーターで少なくとも24時間冷却し、溶媒が完全に蒸発するまで110°Cのオーブンに置き、さらにデシケーターで一晩冷却し、最後に再計量します。
  7. ビーカーの初期重量と最終重量の差を計算して、IMFの内容を決定します。

4.肉の色

  1. 黒と白の標準プレートを使用してデバイスを校正します。白いキャリブレーションプレートをプレートの中央近くに置きます。キャリブレーションを行うときは、プレートの中央付近の領域を使用してください。ランプが3回点滅したらキャリブレーションは完了です。
  2. 30分後、4°C(ブルーミング時間)で測定します。LT筋肉サンプルの3つの異なる場所から色測定値を取得し、結合組織と脂肪を慎重に避けます。
  3. 室温(20°C)で、推奨されている16に従って、これらの測定値から平均を計算します。

5. 水の損失

  1. すべてのサンプルのパージ損失(PL)を評価します。冷凍前の初期重量と凍結/解凍後の最終重量の変動を測定することにより、牛ロース肉切片のPLを決定します。
    注:冷凍されていないコントロールビーフロースのPLを評価しないでください。
  2. 10 kgの圧力に5分間17さらされる前後の肉サンプルの重量差(約1.0 g)により、保水力(WHC)を測定します。

6.客観的な肉の柔らかさ

注:ワーナー・ブラッツラーせん断力(WBSF)の測定は、18,19に記載されているように実施されました。

  1. ガラス耐火物に取り付けられたグリッドにサンプルを配置し、最終温度が71°Cに達するまで工業用電気オーブンで調理します。 調理後、サンプルを冷却し、秤量し、4°Cで24時間冷蔵します。
  2. 式 figure-protocol-4796を使用して調理損失(CL)を決定します。
    1. サンプルを調理する前と後に耐火物を秤量することにより、ドリップロスを決定します。この目的のために、サンプルをガラス耐火物の上のグリッドに配置して、調理中に肉汁と脂肪が排出されるようにします。
    2. 蒸解前と調理後のサンプルのみを計量することにより、蒸発損失を決定します。
    3. 生と調理済みの重量を記録し、DLの割合を調理後のドリップの重量を解凍した肉サンプルの重量で割ったものとして計算します。
    4. 蒸発損失率(EVP)は、[100-(調理後の重量)÷生重量×100]という式を使用して計算します。
  3. WBSFの測定には、テクスチャアナライザーを使用して直径1.27 cmの8つのコアをセクション化し、3.07 mmのワーナーブラッツラーせん断力ブレードとV字型(60°角度)の刃先を装備します。
    1. 結果を、低値と高値の極値19を除外した後、サンプルごとに6つの値の平均としてキログラム(kg)で報告します。

7. 生化学的アッセイ

注:死後タンパク質分解は、Culler et al.20によって概説され、Borges et al.21によってBos indicus牛に適応された元の手順に従って、筋原線維断片化指数(MFI)を推定することによって評価されました。

  1. 100 mM 塩化カリウム、pH 7 で 20 mM リン酸カリウム、1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1 mM 塩化マグネシウム、および 1 mM アジ化ナトリウム 2 °C で 1 mM を含む緩衝液中で、約 3 g の LT サンプル(脂肪除去された筋肉組織および結合組織)のフラグメントをホモジナイズし、2 °C で 1,000 mM の塩化カリウム四酢酸(EDTA)、1 mM 塩化マグネシウム、および 1 mM アジ化ナトリウムを 2 °C で 1,000 g × 15 分間)する緩衝液でホモジナイズします。
    1. 攪拌棒を使用して沈殿物を10容量(v / w)の分離媒体に再懸濁し、次に再び1,000 × g で15分間沈殿させ、上清をデカントします。
    2. 沈殿物を2.5容量(v / w)の分離媒体に再懸濁し、ポリエチレンストレーナー(18メッシュ)に通して結合組織と破片を分離します。追加の2.5容量(v / w)を使用して、筋原線維がストレーナを通過できるようにします。
    3. Gornallらのビウレット法を使用して、筋原線維の懸濁液のタンパク質濃度を決定します.22。ミオフィブリル懸 ?? 液のアリコートを分離培地で0.5 ± 0.05 mg / mLのタンパク質濃度に希釈します。.
    4. この懸濁液の吸光度を540nmですぐに測定します。540 nmの分光光度法を使用してMFIを測定します。吸光度に 200 を掛けて、各サンプルの MFI を求めます (そして、測定単位のない指標として報告します)。

8. 分子生物学的アッセイ

注:ウシ骨格筋に最も多く存在するタンパク質であるミオシン重鎖(MyHC)の分析のために、両群のLTサンプルを文献23,24に記載されているプロトコルに従って処理しました。

  1. グラジエントSDS-PAGEゲル(7-10%)および4%スタッキングゲルを使用して電気泳動分離を達成します。各サンプル25μLをゲルにアプし、70 V、28 mA、4 °Cで1時間分析した後、180 V、12 mA、4 °Cで29時間分析します。
  2. 分析では、グリシン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩基、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および蒸留水を含む上部ゲル緩衝液を使用しますが、下部ゲル緩衝液はメルカプトエタノールを添加した上部緩衝液と同じです。
  3. Coomassie Blueでゲルを染色し、適切なソフトウェアを使用して画像をキャプチャします。
  4. MyHCアイソフォーム(MyHC-I、MyHC-IIa、MyHC-IIx/d)を分子量(それぞれ223.900、224.243、223.875 kDa)に基づいて同定します。適切なソフトウェアを使用して、各アイソフォームに対応するバンドのデンシトメトリーによる半定量分析を実施します。
  5. マウスヒラメ筋と長指伸筋(EDL)をポジティブコントロールとしてMyHCアイソフォームを分類し、処理済みサンプル40μLをロードするために各ゲルに1ウェルを確保します。
  6. すべてのデータについて、次のモデルを使用して、F検定による分散分析(ANOVA)を実行します。
    Yij = μ + ti + Ɛij
    ここで、Yij は、反復 j での治療 i を参照する実験ユニットの観測値です。μは平均の一般的な効果です。tは治療効果(遺伝的グループ)、εは実験誤差です。
  7. スチューデントの t検定を使用して平均を比較し、危険確率として0.05< P値を採用します。

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結果

表1 は、この研究で調査した2つの遺伝子グループの枝肉形質を示しています。特に、HCW、REA、およびBFTで差が認められ(P < 0.01)、交雑種動物の方が値が高く、雑種強勢効果が示唆されました。

変数¹ネロールF1アンガス×ネロールSEMのP値

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ディスカッション

枝肉の評価では、48時間の冷却期間後の成長と品質特性を正確に測定して、一貫性のある比較可能なデータを取得することが重要です。2つの生物学的モデルは、特にHCW、REA、およびBFTの異なる枝肉形質を示し、これは他の研究で報告された結果と一致しています。ネロール雄牛の平均HCWは、脂肪含有量が少なく、動物単位あたりの肉生産量を増やすことを優先するブラジル市場の好みと一致?...

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開示事項

著者は何も開示していません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

謝辞

本研究は、サンパウロ州立大学獣医学部のFAPESP(助成金2023/05002-3、2023/02662-2、2024/09871-9)、CAPES(財務コード001)、CNPq(304158/2022-4)、およびサンパウロ州立大学獣医学部のPROPE(IEPe-RC助成金番号149)の助成を受けて行われました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneMerk, Darmstadt, GermanyCAS 67-64-1 | 100014solutions used for the electrophoretic separations
Anti-MYH-1 AntibodyMerk, Darmstadt, GermanyMABT846Rat soleus
Anti-Myosin antibodyAbcam, Massachusetts, United Statesab37484Myosin heavy chain
Anti-Myosin-2 (MYH2) AntibodyMerk, Darmstadt, GermanyMABT840Extensor digitorum longus (EDL)
Biological oxygen demand (BOD) incubatorTECNAL, São Paulo, BrazilTE-371/240LMeat aging
Chloroform; absolute analytical reagentSigma-Aldrich, Missouri, United States67-66-3Intramuscular fat
CIELab systemKonica Minolta Sensing, Tokyo, JapanCR-400 colorimeterMeat color
Coomassie BlueSigma-Aldrich, Missouri, United StatesC.I. 42655)Myosin heavy chain
Electric ovenVenâncio Aires, Rio Grande do Sul, BrazilMeat tenderness
EthanolMerk, Darmstadt, Germany64-17-5solutions used for the electrophoretic separations
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-Aldrich, Missouri, United States60-00-4Post-mortem proteolysis
Glass flasksSigma-Aldrich, Missouri, United Statessolutions used for the electrophoretic separations
GlycineSigma-Aldrich, Missouri, United StatesG6761Myosin heavy chain
Infrared spectroscopy - FoodScanFoss NIRSystems, Madson, United StatesFoodScan™ 2Intramuscular fat
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, Missouri, United States 7786-30-3Post-mortem proteolysis
MercaptoetanolSigma-Aldrich, Missouri, United StatesM6250Myosin heavy chain
Methanol, absolute analytical reagentSigma-Aldrich, Missouri, United States67-56-1Intramuscular fat
pH meterLineLab, São Paulo, BrazilAKLA 71980Meat pH
PlusOne 2-D Quant KitGE Healthcare ProductCode 80-6483-56Post-mortem proteolysis
PolypropyleneSigma-Aldrich, Missouri, United Statessolutions used for the electrophoretic separations
Potassium chlorideSigma-Aldrich, Missouri, United States7447-40-7Post-mortem proteolysis
Potassium phosphateSigma-Aldrich, Missouri, United StatesP0662Post-mortem proteolysis
R softwareVienna, Austriaversion 3.6.2Data analysis
Sodium azideSigma-Aldrich, Missouri, United States26628-22-8Post-mortem proteolysis
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich, Missouri, United States822050Myosin heavy chain
SpectrophotometerPerkin Elmer, Shelton, United StatesPerkin Elmer
Lambda 25 UV/Vis		Post-mortem proteolysis
Statistical Analysis SystemSAS, Cary, North Carolina, United Statesversion 9.1,Data analysis
Texture AnalyzerAMETEK Brookfield, Massachusetts, United
States		CTXMeat tenderness
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-Aldrich, Missouri, United States77-86-1Myosin heavy chain
UltrafreezerIndrel Scientific, Londrina, Paraná, Brazil.INDREL IULT 335 D - LCDSample storage
Ultrapure waterElga PURELAB Ultra Ionic systemsolutions used for the electrophoretic separations
Ultra-Turrax high shear mixerMarconi – MA102/E, Piracicaba, São Paulo, BrazilPost-mortem proteolysis

参考文献

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