Изучение длинной мышцы: разгадка ее корреляции с качеством мяса у Bos indicus и помесных быков

Резюме

Мы исследовали скелетную мышечную ткань у Bos indicus и помесных быков, чтобы объяснить различия в качественных характеристиках мяса. Было обнаружено, что поперечная сила Уорнера-Братцлера (WBSF) находится в диапазоне от 4,7 кг до 4,2 кг. Изоформы тяжелой цепи миозина выявили различия между животными, а индекс фрагментации миофибриллы позволил получить дополнительное представление о вариациях нежности (WBSF).

Аннотация

В этом исследовании изучалась мышечная ткань у Bos indicus и помесных быков, чтобы объяснить различия в качественных характеристиках мяса. Описаны характеристики туши, параметры качества мяса, биохимические и молекулярные исследования миофибриллярных белков. Были изложены методы оценки pH, внутримышечного жира (IMF), цвета мяса (L*, a*, b*), потерь воды, болезненности, а также молекулярно-биологические анализы. Описаны конкретные процедуры калибровки, подготовки образцов и анализа данных для каждого метода. К ним относятся такие методы, как инфракрасная спектроскопия для определения содержания IMF, объективная оценка нежности и электрофоретическое разделение изоформ MyHC.

Цветовые параметры были выделены в качестве потенциальных инструментов для прогнозирования нежности говядины, которая является важнейшим качественным признаком, влияющим на решения потребителей. В исследовании использовался метод поперечной силы Уорнера-Братцлера (WBSF), который выявил значения 4,68 и 4,23 кг для Неллора и Ангуса-Неллора (P < 0,01) соответственно. Общие потери при варке и биохимические анализы, включая индекс фрагментации миофибрилл (MFI), позволили получить представление о колебаниях нежности. Были исследованы типы мышечных волокон, в частности изоформы тяжелой цепи миозина (MyHC), с заметным отсутствием изоформы MyHC-IIb у исследуемых животных зебу. Связь между MyHC-I и нежностью мяса выявила различные результаты в литературе, что подчеркивает сложность этой связи. В целом, исследование дает всестороннее представление о факторах, влияющих на качество мяса быков породы Bos indicus и помесей (Bos taurus × Bos indicus), предлагая ценную информацию для мясной промышленности.

Введение

Бразилия имеет самое большое коммерческое стадо крупного рогатого скота в мире, насчитывающее около 220 миллионов животных и занимающее второе место по производству мяса, производя более 9 миллионов метрических тонн эквивалента туши в^год1. Сектор производства мясного скота вносит значительный вклад в национальную сельскохозяйственную систему, а общий годовой объем продаж превышает 55 миллиардов реалов. С 2004 года Бразилия является ключевым игроком в мировой торговле мясом, экспортируя его в более чем 180 стран, что составляет ~50% мировой торговли мясом^.

Нежность мяса выделяется как важнейший атрибут качества, влияющий на удовлетворенность потребителей и потребление мяса³. Используя биохимические и объективные методы измерения нежности мяса, исследователи стремятся получить ценную информацию о таких факторах, как генетика животных, методы обработки и условия хранения, что в конечном итоге повышает качество и консистенцию мясных продуктов для потребителей. Такая информация полезна, потому что нежность мяса приобрела все большее значение при принятии потребителями решений во время покупок. Кроме того, оценка нежности мяса предоставляет ценную информацию для контроля качества в мясоперерабатывающей промышленности. Постоянно отслеживая нежность, производители могут гарантировать, что мясная продукция соответствует желаемым стандартам и спецификациям. В этом контексте бразильские производители мясного скота постепенно внедряют интенсивные системы откормочных площадок с кроссбредными животными для увеличения оборачиваемости капитала. На эту систему приходится около 10% ежегодно производимых в Бразилии ^4,5 тонн туш.

Растущий спрос на улучшенное качество мяса со стороны потребителей побудил производителей мясного скота скрещиваться с европейскими породами, в первую очередь с абердин-ангусской породой⁶. Эта стратегия направлена на получение гибридов F1 ангус-неллор, известных превосходной производительностью, желательными характеристиками туши и улучшенным качеством мяса по сравнению с чистыми животными зебу ^7,8. В тропических регионах Бразилии распространена практика использования некастрированных животных (быков) высокой зрелости на откормочных фермах, что может поставить под угрозу качество мяса, такие как цвет, мраморность и нежность. Примечательно, что исследование показало, что 95% животных, откормленных на бразильских откормочных площадках, являются самцами, 73% из которых являются неллорами, за ними следуют 22% гибридных животных и 5% других^{генотипов.}

Понимание биохимических механизмов, лежащих в основе нежности мяса, имеет решающее значение для улучшения качества мяса. Одним из ключевых аспектов является посмертный протеолиз, который влияет на структурную целостность мышечных волокон¹¹. Индекс фрагментации миофибрилл (MFI) является широко используемым биохимическим анализом, который количественно оценивает степень деградации миофибриллы, позволяя получить представление о нежности мяса¹². Метод MFI предполагает измерение фрагментации миофибриллярных белков, которая напрямую коррелирует с нежностью мяса. Этот анализ дополняет традиционную оценку качества мяса и обеспечивает более глубокое понимание биохимических процессов, которые способствуют изменению нежности мяса.

В этом контексте в настоящем исследовании изучалась скелетная мускулатура Bos indicus по сравнению с помесью быков (Bos taurus × Bos indicus), откормленных на откормочной площадке, с целью объяснения различий в качественных характеристиках мяса.

протокол

Все процедуры с животными соответствовали этическим стандартам исследований, установленным Комитетом по этике использования животных (CEUA) "Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho" - UNESP Botucatu Campus, в соответствии с протоколом 0171/2018.

1. Подопытные животные

1. Откормите 30 быков Неллоре (Bos indicus) и 30 быков F1 Ангус-Неллор (Bos taurus × Bos indicus) в возрасте 20-24 месяцев на откормочной площадке. Обе группы животных размещаются в коллективных загонах размером 5 м х 6 м с бетонным полом и оборудованных поилками ракушечного типа, вмещающими до пяти животных в одном загоне. Убедитесь, что все животные принадлежат к одной и той же группе управления (рождены и выращены на одной ферме) и относятся к одному и тому же периоду откорма.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании быки Nellore имели среднюю начальную массу тела 370,7 кг, в то время как быки F1 Angus-Nellore имели среднюю начальную массу тела 380,8 ± 17 кг.
2. Рацион на откормочных площадках
   1. Убедитесь, что финишный рацион на 11,3% состоит из грубых кормов (сено тифтона и жмых сахарного тростника) и на 88,7% концентратов (молотое сухое зерно кукурузы, соевый шрот, кукурузное влажное зерно, сухой кукурузный глютен и минеральное ядро). Кормите животных в течение 120 дней и обеспечивайте рацион вволю два раза в день (в 10:00 и 16:00).
3. Убой
   1. Зарегистрируйте окончательную массу тела (BWf) в конце экспериментального периода. Обрабатывайте всех животных на ближайшей скотобойне, придерживаясь стандартных процедур проверки. Перед убоем убедитесь, что животные голодают не менее 16 часов, воздерживаясь от корма и воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Быки F1 Angus-Nellore показали итоговый вес тела 615,09 ± 57,53 кг, в то время как быки Nellore имели вес 545,47 ± 11,45 кг.
4. Оценка признаков туши
   1. Сначала взвесьте говяжьи туши, а затем подвергните их охлаждению при температуре 2-4 °C в течение 48 часов. Измерения включают вес горячей туши (HCW), область рибай (REA) и толщину шпика (BFT) на границе^12-го/^13-го ребер, как рекомендовано¹³. Определите REA методом сетки с помощью небольшой сетки (18 см х 13 см) и измерьте BFT в миллиметрах с помощью штангенциркуля.
      1. Измерьте REA в каждой туше с помощью сетчатой сетки (такой же, как используется в системе классификации USDA Yield Grade), разделенной на квадраты размером 1 см² с одной точкой посередине. Добавьте все квадраты в пределах периметра трассировки рибай и те, которые расположены вдоль контура обводки, проходящей через среднюю точку.
      2. Измерьте BFT в определенном месте на месте оценки в любом месте между^12-м/^13-м ребрами. Чтобы определить это положение, измерьте длину рибай; затем, начиная с медиальной границы «А», определите точку на трех четвертях пути вдоль рибай и на полпути через «В». Проведите штангенциркуль через эту точку и под прямым углом к указанному ребру к границе между подкожно-жировой клетчаткой и межмышечным жиром. Измерьте подкожный жир, расположив штангенциркуль под прямым углом к линии подкожно-жировой клетчатки от точки соприкосновения (дополнительный рисунок S1).
5. Выборка
   1. Образец Longissimus thoracis (LT) из левой полутуши (доля ± 12,0 см мяса), между^11-м и^13-м ребрами в краниальном направлении. В лаборатории образцы мяса разрезают на стейки диаметром 2,54 см.
6. Старение
   1. Оцените качественные характеристики мяса после 14-дневного периода влажной выдержки при температуре 0-2 °C в инкубаторе с биологической потребностью в кислороде (БПК). Используйте стейки толщиной 2,54 см для анализа цвета мяса, pH, внутримышечного жира, потерь при продувании, водоудерживающей способности, объективной нежности и потерь при приготовлении. Упакуйте стейки отдельно в полиэтиленовые пакеты для высокого вакуума и низкой кислородопроницаемости, а после достижения времени выдержки храните их в замороженном состоянии при температуре -20 °C до момента анализа. Разморозьте образцы говядины при 4 °C в течение 24 часов и подвергните их воздействию кислорода в течение 30 минут при 4 °C (время цветения).

2. pH мяса

1. Измерьте pH мяса с помощью цифрового рН-метра, оснащенного зондом проникновения. Откалибруйте его с помощью буферов pH 4,0 и 7,0 при комнатной температуре 25 °C. Измерьте pH мяса в трех местах образца мышц LT. Ручная запись показаний данных и последующий экспорт даташита; рассчитать среднее значение трех показателей рН мяса.

3. Внутримышечный жир

ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание внутримышечного жира (IMF) определяли с помощью ближней инфракрасной (NIR) спектроскопии¹⁴ и гравиметрического метода¹⁵.

1. Удалите подкожный жир из LT-мышцы с помощью скальпеля. Затем измельчите и гомогенизируйте стейк в течение 5 минут с помощью миксера, добавив примерно 180 г образца. Поместите образец в чашку, поместите его внутрь камеры для образца и выполните подсканирование различных зон исследуемого образца путем вращения чашки для образца; Объедините зоны для получения конечного результата.
2. Сделайте три показания для каждого образца. После гомогенизации поместите образцы в пластину для последующего считывания. Настройте аппарат на передачу NIR диапазона, с помощью монохроматора с подвижной решеткой, сканирующей область от 850 нм до 1050 нм.
3. Экспортируйте таблицу данных, а затем рассчитайте среднее значение трех показаний для МВФ. Выразите результаты в процентах, используя формулу: [(средний вес ÷ выборке МВФ) × 100].
4. Смешайте гомогенизацию образцов мышц LT (3,0 г) с раствором хлороформа/метанола/хлороформа (2:1) в течение 2 мин и подвергнуть их центрифугированию (700 × г; 10 мин; 20 °C) для разделения гидрофильной (верхней), твердой (средней) и гидрофобной (нижней) фаз.
5. Полученную после центрифугирования гидрофобную фазу отфильтровать с помощью фильтровальной бумаги на воронке с небольшим всасыванием. Перенесите фильтрат (нижняя фаза; липиды в хлороформе) в колбу с маркировкой липидной фазы и перелейте не менее 5 мм фильтрата в предварительно взвешенную колбу для стакана, дав ей постоять несколько минут. Затем зарегистрируйте объем слоя хлороформа (не менее 150 мл) и аспирируйте спиртовой слой.
   1. Гомогенизируйте 100 г аликвот образца свежей или замороженной ткани в течение 2 мин смесью из 100 мл хлороформа и 200 мл метанола. Добавьте в смесь 100 мл хлороформа, взбивайте в течение 30 секунд, добавьте 100 мл дистиллированной воды и взбивайте еще 30 секунд.
   2. Процедите гомогенат через фильтровальную бумагу на воронке с легким всасыванием. Надавите на нижнюю часть стакана, когда остатки станут сухими, чтобы обеспечить максимальное восстановление растворителя.
   3. Перелейте фильтрат в мерный цилиндр объемом 500 мл и дайте ему постоять несколько минут, чтобы обеспечить отделение и осветление. Запишите объем слоя хлороформа (не менее 150 мл) и аспирируйте спиртовой слой.
   4. Обязательно полностью снимите верхний слой; Слой хлороформа содержит очищенный липид. Для количественной экстракции липидов восстановите липиды, захваченные в остатках ткани, смешав остатки и фильтровальную бумагу со 100 мл хлороформа.
   5. Процедите смесь через воронку и промойте кувшин блендера и остаток в общей сложности 50 мл хлороформа. Смешайте этот фильтрат с исходным фильтратом перед удалением спиртового слоя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрация обычно быстрая; Надавите нижней частью стакана на сухой остаток, чтобы обеспечить максимальное извлечение растворителя.
6. Высушите образцы в духовке, охладите их в эксикаторе в течение не менее 24 часов, поместите их в духовку при температуре 110 °C до полного испарения растворителя, затем охладите их в эксикаторе на ночь и, наконец, снова взвесьте.
7. Определите содержание IMF, рассчитав разницу между начальным и конечным весом стакана.

4. Цвет мяса

1. Калибруйте прибор с помощью черной и белой стандартной пластины. Поместите белую калибровочную пластину в середину пластины. При выполнении калибровки используйте область рядом с серединой пластины. Калибровка завершается после того, как лампа мигнет три раза.
2. Проводите измерения через 30 минут при температуре 4 °C (время цветения). Получите показания цвета из трех разных мест на образце мышц LT, тщательно избегая соединительной ткани и жира.
3. При комнатной температуре (20 °C) рассчитайте среднее значение по этим измерениям, как рекомендуется¹⁶.

5. Потери воды

1. Оценка потерь на продувку (PL) для всех образцов. Определите PL секций говяжьей корейки, измерив разницу между начальным весом до заморозки и конечным весом после заморозки/размораживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не оценивайте PL никогда не замораживаемой контрольной говяжьей корейки.
2. Измеряйте водоудерживающую способность (WHC) по разнице в весе образца мяса (приблизительно 1,0 г) до и после воздействия давления 10 кг в течение 5 мин¹⁷.

6. Объективная нежность мяса

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение поперечной силы Уорнера-Братцлера (WBSF) проводилось так, как описано^18,19.

1. Поместите образцы на решетку, прикрепленную к стеклянному огнеупору, и готовьте их в промышленной электрической духовке до достижения конечной температуры 71 °C. После приготовления охладите, взвесьте и поставьте в холодильник при температуре 4 °C в течение 24 часов.
2. Определите потери при варке (CL) по формуле .
   1. Определите капельные потери, взвесив огнеупор до и после варки образца. С этой целью поместите образцы на сетку над стеклянным огнеупором, чтобы обеспечить стекание мясных соков и жира во время приготовления.
   2. Определите потери на испарение, взвешивая только образец до и после приготовления.
   3. Запишите вес сырого и приготовленного мяса и рассчитайте процент DL как вес капель после приготовления, разделенный на вес размороженного образца мяса.
   4. Рассчитайте процент потерь на испарение (EVP) по формуле [100 - (вес после приготовления) ÷ сырой вес × 100].
3. Для определения WBSF секция восьми кернов диаметром 1,27 см с помощью анализатора текстуры, оснащенного лезвием Warner-Bratzler Shear Force 3,07 мм и V-образной (угол 60°) режущей кромкой.
   1. Сообщите результаты в виде среднего значения шести значений на пробу в килограммах (кг) после исключения низких и высоких экстремумов¹⁹.

7. Биохимический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Посмертный протеолиз оценивали путем оценки индекса фрагментации миофибрилл (MFI) в соответствии с оригинальной процедурой, описанной Culler et ^al.20 и адаптированной для крупного рогатого скота Bos indicus Borges et ^al.21.

1. Гомогенизируйте фрагменты примерно 3 г образцов LT (лишенной жира мышечной ткани и соединительной ткани) в буферном растворе, содержащем 100 мМ хлорида калия, 20 мМ фосфата калия при pH 7, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1 мМ хлорида магния и 1 мМ азида натрия при 2 °C, с последующим центрифугированием (1000 × г в течение 15 мин при 4 °C).
   1. Повторно суспендируйте осадок в 10 объемах (v/w) изолирующей среды с помощью мешалочного стержня, затем снова осадите его в 1000 × г в течение 15 минут и сцедите надосадочную жидкость.
   2. Повторно суспендировать осадок в 2,5 объемах (v/w) изолирующей среды и отделить соединительную ткань от мусора, пропустив его через полиэтиленовое ситечко (18 меш). Используйте дополнительные 2,5 объема (v/w), чтобы миофибриллы прошли через ситечко.
   3. Определить белковую концентрацию суспензии миофибрилл с помощью биуретового метода Gornall et ^al.22. Разбавляют аликвоту суспензии миофибриллы с изолирующей средой до концентрации белка 0,5 ± 0,05 мг/мл.
   4. Немедленно измерьте абсорбцию этой суспензии при 540 нм. Определение MFI с помощью спектрофотометрии на длине волны 540 нм. Умножьте поглощение на 200, чтобы получить MFI для каждого образца (и сообщите его в виде индекса без единиц измерения).

8. Молекулярно-биологический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа тяжелой цепи миозина (MyHC), наиболее распространенного белка в скелетных мышцах крупного рогатого скота, образцы LT из обеих групп были обработаны в соответствии с протоколом, описанным в литературе^23,24.

1. Добейтесь электрофоретического разделения с помощью градиентного геля SDS-PAGE (7-10%) и 4% стекирующего геля. Нанесите 25 мкл каждого образца на гель и запустите его при 70 В, 28 мА и 4 °C в течение 1 ч, а затем прогоните при 180 В, 12 мА и 4 °C в течение 29 ч.
2. Используйте два различных буфера в прогонах: верхний гелевый буфер, содержащий глицин, трис(гидроксиметил)аминометановое основание, додецилсульфат натрия (SDS) и дистиллированную воду, в то время как нижний гелевый буфер идентичен верхнему буферу, с добавлением меркаптоэтанола.
3. Окрасьте гели с помощью Coomassie Blue и сделайте снимки с помощью соответствующего программного обеспечения.
4. Идентификация изоформ MyHC (MyHC-I, MyHC-IIa, MyHC-IIx/d) на основе их молекулярной массы (223,900, 224,243 и 223,875 кДа соответственно). Проведите полуколичественный анализ с помощью денситометрии полос, соответствующих каждой изоформе, с использованием соответствующего программного обеспечения.
5. Используйте камбаловидную мышцу крысы и мышцу разгибателя пальца (EDL) в качестве положительного контроля для классификации изоформ MyHC, резервируя одну лунку в каждом геле для загрузки 40 μл обработанного образца.
6. Для всех данных выполните дисперсионный анализ (ANOVA) с помощью F-критерия, используя следующую модель:
   Y_ij = μ + t_i + Ɛ_ij
   где Yij — наблюдаемое значение экспериментальной единицы, относящейся к обработке i при повторении j; μ — это общий эффект среднего значения; t — эффект лечения (генетическая группа), а ε — экспериментальная ошибка.
7. Сравните средние с помощью t-критерия Стьюдента и примите P-значение < 0,05 в качестве критической вероятности.

Результаты

В таблице 1 представлены черты туши двух генетических групп, изученных в этом исследовании. Примечательно, что были выявлены различия (P < 0,01) у медработников, РЭА и БОТ, при этом кроссбредные животные демонстрировали более высокие значения, что свидетельствует об эффекте г?...

Обсуждение

Во время оценки туши крайне важно точно измерить рост и качественные характеристики после 48-часового периода охлаждения, чтобы получить согласованные и сопоставимые данные. Две биологические модели продемонстрировали различные черты туши, в частности HCW, REA и BFT, что согласуется с резу?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Merk, Darmstadt, Germany	CAS 67-64-1 | 100014	solutions used for the electrophoretic separations
Anti-MYH-1 Antibody	Merk, Darmstadt, Germany	MABT846	Rat soleus
Anti-Myosin antibody	Abcam, Massachusetts, United States	ab37484	Myosin heavy chain
Anti-Myosin-2 (MYH2) Antibody	Merk, Darmstadt, Germany	MABT840	Extensor digitorum longus (EDL)
Biological oxygen demand (BOD) incubator	TECNAL, São Paulo, Brazil	TE-371/240L	Meat aging
Chloroform; absolute analytical reagent	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	67-66-3	Intramuscular fat
CIELab system	Konica Minolta Sensing, Tokyo, Japan	CR-400 colorimeter	Meat color
Coomassie Blue	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	C.I. 42655)	Myosin heavy chain
Electric oven	Venâncio Aires, Rio Grande do Sul, Brazil		Meat tenderness
Ethanol	Merk, Darmstadt, Germany	64-17-5	solutions used for the electrophoretic separations
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	60-00-4	Post-mortem proteolysis
Glass flasks	Sigma-Aldrich, Missouri, United States		solutions used for the electrophoretic separations
Glycine	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	G6761	Myosin heavy chain
Infrared spectroscopy - FoodScan	Foss NIRSystems, Madson, United States	FoodScan™ 2	Intramuscular fat
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	7786-30-3	Post-mortem proteolysis
Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	M6250	Myosin heavy chain
Methanol, absolute analytical reagent	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	67-56-1	Intramuscular fat
pH meter	LineLab, São Paulo, Brazil	AKLA 71980	Meat pH
PlusOne 2-D Quant Kit	GE Healthcare Product	Code 80-6483-56	Post-mortem proteolysis
Polypropylene	Sigma-Aldrich, Missouri, United States		solutions used for the electrophoretic separations
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	7447-40-7	Post-mortem proteolysis
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	P0662	Post-mortem proteolysis
R software	Vienna, Austria	version 3.6.2	Data analysis
Sodium azide	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	26628-22-8	Post-mortem proteolysis
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	822050	Myosin heavy chain
Spectrophotometer	Perkin Elmer, Shelton, United States	Perkin Elmer Lambda 25 UV/Vis	Post-mortem proteolysis
Statistical Analysis System	SAS, Cary, North Carolina, United States	version 9.1,	Data analysis
Texture Analyzer	AMETEK Brookfield, Massachusetts, United States	CTX	Meat tenderness
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	77-86-1	Myosin heavy chain
Ultrafreezer	Indrel Scientific, Londrina, Paraná, Brazil.	INDREL IULT 335 D - LCD	Sample storage
Ultrapure water	Elga PURELAB Ultra Ionic system		solutions used for the electrophoretic separations
Ultra-Turrax high shear mixer	Marconi – MA102/E, Piracicaba, São Paulo, Brazil		Post-mortem proteolysis