代谢功能障碍相关脂肪性肝病中脂肪沉积的体外建模

摘要

本文介绍了使用油酸诱导的 HepG2 细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。

摘要

由于经济和生活方式的变化，代谢功能障碍相关脂肪性肝病 （MASLD） 的患病率激增，导致重大的健康挑战。以前的报告研究了 MASLD 的动物和细胞模型的建立，突出了它们之间的差异。在这项研究中，通过在 MASLD 中诱导脂肪堆积来创建一个细胞模型。用不同浓度 （0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM） 的不饱和脂肪酸油酸刺激 HepG2 细胞以模拟 MASLD。使用细胞计数试剂盒 8 测定、油红 O 染色和脂质含量分析评估模型的疗效。本研究旨在为 MASLD 细胞创建一个易于操作的细胞模型。细胞计数试剂盒 8 测定结果显示，HepG2 细胞的存活率取决于油酸的浓度，GI₅₀ 为 1.875 mM。0.5 mM 和 1 mM 组的细胞活力显著低于对照组 （P < 0.05）。此外，油红 O 染色和脂质含量分析检查了不同油酸浓度 （0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM） 在 HepG2 细胞上的脂肪沉积。0.25 mM 、 0.5 mM 和 1 mM 组的脂质含量显著高于对照组 （P < 0.05）。此外，OA 组甘油三酯水平显著高于对照组 （P < 0.05）。

引言

代谢功能障碍相关脂肪性肝病 （MASLD） 包括一系列病症，包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎 （NASH）、肝硬化和肝细胞癌 1,2,3,4,5,6，所有这些都归因于酒精消耗以外的因素 7 .MASLD 是由代谢性肝损伤引起的最普遍的肝脏疾病，影响全球近四分之一的人口 8,9,10,11,12。虽然 MASLD 的确切发病机制尚未阐明，但各种理论试图解释其发展。一个流行的观点表明，从经典的 "two-hit" 理论转向 "multiple-hit" 模型¹。这些假设的核心是胰岛素抵抗的作用，这被认为是 MASLD 发病机制的关键¹³。研究表明，肝细胞中的胰岛素抵抗会导致游离脂肪酸水平升高，随后形成储存在肝脏内的甘油三酯^14,15。

研究人员已经使用 体内 和 体外 模型来模拟 MASLD 中的脂肪沉积;然而，完全复制其病理机制仍然具有挑战性。尽管存在这种限制，但这些模型有助于研究 MASLD 的潜在治疗靶点。然而，开发稳定的 MASLD 模型至关重要。虽然动物模型有效，但它们既耗时又昂贵，因此凸显了人们对 体外 细胞模型的兴趣日益浓厚。这些模型通常使用单一或多种游离脂肪酸，如油酸 （OA） 和棕榈酸）来重建饮食诱导的 MASLD。其中，人肝母细胞瘤细胞系 HepG2 常用于建立 MASLD 的 体外 细胞模型。

OA 诱导刺激 HepG2 细胞复制脂肪沉积，类似于 MASLD，这是一种具有悠久历史的方法。本研究的目的是证明用 0.25 mM OA 处理的 HepG2 细胞的活力、油红 O （ORO） 染色、脂质含量和甘油三酯 （TG） 水平。该实验的目的是为 MAFLD 建模研究的发展提供进一步的证据。

研究方案

注:有关本协议中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 细胞培养

1. 在含有 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）（含有 10% 胎牛血清 [FBS]、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）的培养瓶中培养 HepG2 细胞。将培养瓶保持在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中。

2. 通过细胞计数试剂盒 8 测量油酸对细胞活力的影响

1. 将特定体积的 OA 溶解在二甲基亚砜 （DMSO） 中，以达到 200 mM 的浓度。将溶液储存在 -20 °C 以备将来使用。
2. 将 HepG2 细胞以每孔 6 × 10³ 个细胞的细胞密度接种在 96 孔板中。向每个孔中加入 100 μL DMEM。将细胞在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育和培养 24 小时。将 HepG2 细胞分为两组:
   1. 对照组:添加细胞培养基。
   2. OA 组:向细胞培养基中加入 OA，使最终浓度达到 0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM 和 1 mM。
3. 初始孵育 24 小时后，弃去每个孔中的上清液，并根据指定的分组加入 OA，每孔添加 100 μL。对于对照组，向每个孔中加入 100 μL 细胞培养基。继续将细胞再孵育 24 小时。
   注意:确保每组有六个重复孔。为防止蒸发，向 96 孔板的孔外环中加入 100 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
4. 孵育 24 小时后，向每个孔中加入 10 μL 细胞计数试剂盒-8 （CCK-8），轻轻混匀，并在黑暗中孵育 2 小时。从培养箱中取出 96 孔板，将其放入酶标仪中，并测量 450 nm 处的吸光度值 （A₄₅₀）。根据 OD 计数 GI₅₀ 值。

3. 油红 O 染色观察细胞内脂滴形成

1. 将 HepG2 细胞以每孔 5 × 10^{5 个细胞} 的密度接种在 6 孔细胞培养板中，并在恒温培养箱中培养板 24 小时。请参阅 图 1 了解所描述步骤的直观表示。
2. 细胞培养 24 小时后，向每个孔中加入 2 mL 含有 OA 的细胞培养基，最终浓度达到 0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM 和 1 mM。再过 24 小时后，从每个孔中取出细胞培养基，并用 PBS 洗涤两次。向每个孔中加入 1 mL ORO 固定剂并孵育 30 分钟。
3. 通过将染色液 A 与染色液 B 以 3:2 的比例混合来制备 ORO 染色液。让混合物在室温下静置 10 分钟，然后通过 0.45 μm 过滤器过滤一次。将过滤后的溶液储存在避光的离心管中，直至使用。
4. 丢弃固定剂并用蒸馏水洗涤两次。向每个孔中加入 1 mL 60% 异丙醇并孵育 30 秒。弃去 60% 的异丙醇溶液，并在孵育 20 分钟之前向每个孔中加入 1 mL 新鲜制备的 ORO 染色溶液。弃去 ORO 染色溶液，向每个孔中加入 1 mL 60% 异丙醇，并孵育 30 秒。用水洗涤 5 次以去除多余的染料。
5. 用蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察。收集图像后，丢弃板中的液体并让其干燥。然后，向每个孔中加入 2 mL 异丙醇，并在轨道摇床上摇动板 10 分钟。将液体转移到新的 96 孔板中，每组 16 孔，每孔添加 100 μL。通过使用酶标仪在 510 nm 处测量每个孔的光密度 （OD） 来计算脂质含量 （A₅₁₀）。

4. 不同浓度油酸对 HepG2 细胞上清液中总甘油三酯的影响

1. 在室温下平衡试剂盒 20 分钟，然后准备实验所需的板。
2. 收集细胞上清液并以 1,570 × g 离心 10 分钟。设置标准孔和测试样品孔。向标准孔中加入 50 μL 标准（[S0 → S5] 浓度，然后加入:0、0.5、1、2、4、8 mmol/L）。除了空白孔和标准孔外，向样品孔中加入 10 μL 不同的样品，然后向每个孔中加入 40 μL 样品稀释剂。向每个孔中加入 100 μL 检测抗体辣根过氧化物酶，用板膜密封，并在 37 °C 下在恒温箱中孵育 1 小时。
3. 弃去上清液，在无尘纸上吸干，并用 1x 洗涤液洗涤每个孔。在室温下静置 1 分钟。重复洗涤过程 5 次。
4. 向每个孔中加入 50 μL 底物 A 和 50 μL 底物 B。轻轻混匀并在 37 °C 下孵育 15 分钟。 向每个孔中加入 50 μL 终止溶液，并在 15 分钟内测量每个孔在 450 nm （A₄₅₀） 处的 OD 值。
5. 沿 x 轴绘制标准品浓度，沿 y 轴绘制相应的吸光度 （OD） 值以执行线性回归，并推导出曲线方程以计算每个样品的浓度值。

5. 统计分析

1. 确定定量数据的显著差异。
2. 计算标准差 （SD） ±平均值并以图形方式表示数据。认为 P < 0.05 具有统计显著性。

结果

油酸对细胞活力的影响
HepG2 细胞暴露于不同浓度的 OA （0 mM、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM），导致细胞存活率在 0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM 和 1 mM 时与 0 mM 相比降低。与 0 mM 相比，在 0.5 mM （P < 0.05） 和 1 mM （P < 0.05） 时观察到统计学意义。由 CCK-8 试剂盒评估的 OA 对细胞活力影响的结果如图 2 所示。计算出 OA 处理的 HepG2 细胞的 GI₅₀

讨论

MASLD 是一种临床病理综合征，其特征是由于酒精和其他已确定的肝脏损伤因子以外的因素导致肝细胞中细胞内脂肪沉积过多¹⁸。MASLD 与获得性代谢应激性肝损伤有着错综复杂的联系，特别是与胰岛素抵抗和遗传易感性有关。为了有效地研究和筛选 MASLD 药物，选择合适的实验模型至关重要。建立细胞模型在 MASLD 研究中尤为重要，有助于更深入地了解病理机制和评估新药作用。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Millex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
0.45 µm filter	Millex
2 mL Crygenic Vials	CORNING	430659
25 cm2 Cell Culture Flask	CORNING	430639
6-well cell culture plate	CORNING	3516
96-well cell culture plate	CORNING	3599
Blood Count Plate	Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.	02270113
Cell Counting Kit-8 assays	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	CA1210-1000T
CO2 incubator	NUAIRE	NU-5710E
DMSO Dimethyl sulfoxide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	8122691
Enzyme Labeling Equipment	Tecan	Spark
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10099141
HepG2 cells line	Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)	221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instruction	Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute	20170301
Inverted Microscope for Cell Culture	Leica	DMi1
Isopropanol	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.	2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1262
Oleic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502071
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
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