代謝機能障害関連脂肪性肝疾患における脂肪沈着のin vitroモデリング

要約

この記事では、代謝機能障害に関連する脂肪性肝疾患のモデルとしてのオレイン酸誘導性HepG2細胞の使用について説明します。

要約

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)の有病率は、経済およびライフスタイルパターンの変化により急増し、重大な健康上の課題につながっています。これまでの報告では、MASLDの動物モデルと細胞モデルの確立について研究し、両者の違いを強調してきた。本研究では、MASLDに脂肪蓄積を誘導することにより、細胞モデルを作成しました。HepG2細胞を不飽和脂肪酸オレイン酸でさまざまな濃度(0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM)で刺激し、MASLDをエミュレートしました。モデルの有効性は、Cell Counting kit-8アッセイ、Oil Red O染色、および脂質含量分析を使用して評価しました。この研究は、MASLD細胞の簡単な操作性を持つ細胞モデルを作成することを目的としています。細胞計数キット-8アッセイの結果は、HepG2細胞の生存がオレイン酸の濃度に依存していることを示し、_GI50 は1.875 mMでした。0.5 mM群および1 mM群の細胞生存率は、対照群の細胞生存率よりも有意に低かった(P < 0.05)。さらに、Oil Red O染色および脂質含有量分析により、HepG2細胞上のさまざまなオレイン酸濃度(0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM)での脂肪沈着を調べました。0.25 mM、0.5 mM、および1 mM群の脂質含量は、対照群よりも有意に高かった(P < 0.05)。さらに、OA群のトリグリセリドレベルは、対照群のトリグリセリドレベルよりも有意に高かった(P < 0.05)。

概要

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)には、単純性脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬変、肝細胞がん1,2,3,4,5,6など、さまざまな疾患が含まれ、これらはすべてアルコール吸引以外の要因に起因します7 .MASLDは、代謝性肝障害によって引き起こされる最も一般的な肝疾患であり、世界人口のほぼ4分の1が罹患しています8,9,10,11,12。MASLDの正確な病因はまだ解明されていませんが、その発生を説明するためにさまざまな理論が試みられています。1つの一般的な概念は、古典的な「2ヒット」理論から「マルチヒット」モデル¹への出発を示唆しています。これらの仮説の中心にあるのは、MASLDの病因¹³において極めて重要であると考えられているインスリン抵抗性の役割です。研究によると、肝細胞のインスリン抵抗性は遊離脂肪酸のレベルを上昇させ、その後、肝臓内に貯蔵されたトリグリセリドを形成します^14,15。

研究者たちは、 in vivo モデルと in vitro モデルの両方を使用して、MASLDでの脂肪沈着をシミュレートしました。しかし、その病態メカニズムを完全に再現することは依然として困難です。この制限にもかかわらず、これらのモデルはMASLDの潜在的な治療標的の研究に役立っています。ただし、MASLDの安定したモデルの開発は非常に重要です。動物モデルは効果的ですが、時間と費用がかかるため、 in vitro 細胞モデルへの関心が高まっていることが浮き彫りになっています。これらのモデルは、多くの場合、オレイン酸(OA)やパルミチン酸などの単一または複数の遊離脂肪酸を使用して、食事誘発性MASLDを再現します。これらのうち、ヒト肝芽腫細胞株HepG2は、MASLDの in vitro 細胞モデルを確立するためによく使用されます。

OA誘導は、HepG2細胞を刺激して、確立された歴史を持つMASLDに似た脂肪沈着を再現します。この研究の目的は、0.25 mM OAで処理したHepG2細胞の生存率、Oil Red O(ORO)染色、脂質含量、およびトリグリセリド(TG)レベルを実証することでした。この実験の目的は、MAFLDモデリング研究の発展にさらなる証拠を提供することでした。

プロトコル

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. 細胞培養

1. ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(10%ウシ胎児血清[FBS]、100ユニット/ mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンを含む)を含む培養フラスコでHepG2細胞を培養します。培養フラスコを5%_CO2 インキュベーターで37°Cに維持します。

2. Cell Counting kit-8による細胞生存率に及ぼすオレイン酸の影響

1. 特定の量のOAをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、200 mMの濃度を達成します。溶液は、将来使用するために-20°Cで保存してください。
2. 96ウェルプレートにHepG2細胞を、ウェルあたり6×10³ 細胞の細胞密度で播種します。各ウェルに100 μLのDMEMを添加します。細胞をインキュベートし、5% CO₂ インキュベーターで37°Cで24時間培養します。HepG2細胞を2つのグループに分けます。
   1. 対照群:細胞培養培地を添加します。
   2. OA基:OAを細胞培養培地に添加して、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、および1 mMの最終濃度を達成します。
3. 最初のインキュベーションの24時間後、各ウェルから上清を捨て、指定されたグループに従ってOAを添加し、ウェルあたり100μLを添加します。コントロールグループでは、各ウェルに100 μLの細胞培養培地を加えます。細胞をさらに24時間インキュベートし続けます。
   注:各グループに6つのレプリケートウェルがあることを確認してください。蒸発を防ぐため、100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を96ウェルプレートのウェル外輪に加えます。
4. インキュベーション24時間後、各ウェルに10 μLのCell Counting kit-8 (CCK-8)を加え、穏やかに混合し、暗所で2時間インキュベートします。96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、マイクロプレートリーダーに入れて、450 nm(A₄₅₀)での吸光度値を測定します。GI₅₀ の値は、OD に従ってカウントされました。

3. 細胞内の脂肪滴形成を観察するためのオイルレッドO染色

1. HepG2細胞を6ウェル細胞培養プレートに5×10⁵ 細胞/ウェルの密度で播種し、プレートを恒温インキュベーターで24時間培養します。説明されている手順を視覚的に表現するには、 図 1 を参照してください。
2. 細胞培養の24時間後、OAを含む細胞培養培地2 mLを各ウェルに加え、最終濃度0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、および1 mMを達成します。さらに24時間後、各ウェルから細胞培養培地を取り出し、PBSで2回洗浄します。各ウェルに1 mLのORO固定液を加え、30分間インキュベートします。
3. ORO染色液は、染色液Aと染色液Bを3:2の割合で混合して調製します。混合物を室温で10分間放置し、0.45μmフィルターで1回ろ過します。ろ過した溶液は、使用するまで光から保護された遠心分離管に保管してください。
4. 固定液を捨て、蒸留水で2回洗います。60%イソプロパノール1 mLを各ウェルに加え、30秒間インキュベートします。イソプロパノール溶液の60%を廃棄し、調製したばかりのORO染色液1 mLを各ウェルに加えてから、20分間インキュベートします。ORO染色溶液を廃棄し、各ウェルに60%イソプロパノール1 mLを加え、30秒間インキュベートします。水で5回洗って余分な染料を取り除きます。
5. 細胞を蒸留水で覆い、顕微鏡で観察します。画像が収集されたら、プレート内の液体を捨てて乾かします。次に、各ウェルに2 mLのイソプロパノールを加え、オービタルシェーカーでプレートを10分間振とうします。液体を新しい96ウェルプレートに移し、各グループに16ウェルを配置し、ウェルあたり100μLを追加します。510 nm のマイクロプレートリーダー (A₅₁₀) を使用して各ウェルの光学密度 (OD) を測定することにより、脂質含有量を計算します。

4. HepG2細胞上清中の総トリグリセリドに及ぼす濃度のオレイン酸の違いの影響

1. キットを室温で20分間平衡化し、実験に必要なプレートを調製します。
2. 細胞上清を回収し、1,570 × g で10分間遠心分離します。標準ウェルとテストサンプルウェルを設定します。標準ウェルに50 μL([S0 → S5]濃度、続いて0、0.5、1、2、4、8 mmol / L)を標準ウェルに加えます。ブランクウェルとスタンダードウェルに加えて、10 μLの異なるサンプルをサンプルウェルに加え、続いて40 μLのサンプル希釈液を各ウェルに加えます。100 μLの検出抗体-西洋ワサビペルオキシダーゼを各ウェルに添加し、プレートメンブレンで密封し、恒温オーブンで37°Cで1時間インキュベートします。
3. 上清を捨て、ほこりのない紙で拭き取り、1x洗浄液でそれぞれをよく洗います。室温で1分間放置します。洗浄プロセスを5回繰り返します。
4. 各ウェルに50 μLの基質Aと50 μLの基質Bを添加します。穏やかに混合し、37°Cで15分間インキュベートします。 各ウェルに50μLの終端溶液を加え、450 nm(A₄₅₀)で各ウェルのOD値を15分以内に測定します。
5. X軸に沿って標準試料の濃度をプロットし、Y軸に沿って対応する吸光度(OD)値をプロットして線形回帰を実行し、曲線方程式を導き出して各サンプルの濃度値を計算します。

5. 統計分析

1. 定量的データの有意差を決定します。
2. 平均±標準偏差(SD)を計算し、データをグラフィカルに表示します。 0.05 は統計的に有意であると考えてください。

結果

細胞生存率に対するオレイン酸の影響
HepG2細胞は、さまざまな濃度のOA(0 mM、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM)に曝露され、その結果、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、および1 mMでの細胞生存率が0 mMと比較して低下しました。0 mMと比較して、0.5 mM(P < 0.05)および1 mM(P < 0.05)で統計的有意性が観察されました。CCK-8キットによって評価されたOAの細胞生存率への影響の結果を

ディスカッション

MASLDは、アルコールや他の確立された肝臓損傷剤¹⁸以外の要因による肝細胞への過剰な細胞内脂肪沈着を特徴とする臨床病理学的症候群である。MASLDは、後天性代謝ストレス肝障害と複雑に関連しており、特にインスリン抵抗性と遺伝的感受性に関連しています。MASLDの薬剤を効果的に研究し、スクリーニングするためには、適切な実験モデルを選択することが重要です。細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Millex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
0.45 µm filter	Millex
2 mL Crygenic Vials	CORNING	430659
25 cm2 Cell Culture Flask	CORNING	430639
6-well cell culture plate	CORNING	3516
96-well cell culture plate	CORNING	3599
Blood Count Plate	Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.	02270113
Cell Counting Kit-8 assays	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	CA1210-1000T
CO2 incubator	NUAIRE	NU-5710E
DMSO Dimethyl sulfoxide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	8122691
Enzyme Labeling Equipment	Tecan	Spark
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10099141
HepG2 cells line	Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)	221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instruction	Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute	20170301
Inverted Microscope for Cell Culture	Leica	DMi1
Isopropanol	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.	2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1262
Oleic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502071
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
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