מידול חוץ גופי של שקיעת שומן במחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי

Summary

מאמר זה מתאר את השימוש בתאי HepG2 הנגרמים על ידי חומצה אולאית כמודל למחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי.

Abstract

השכיחות של מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) זינקה עקב שינויים בדפוסי הכלכלה ואורח החיים, מה שהוביל לאתגרים בריאותיים משמעותיים. דוחות קודמים בחנו את הקמתם של מודלים של בעלי חיים ותאיים עבור MASLD, תוך הדגשת ההבדלים ביניהם. במחקר זה, מודל תאי נוצר על ידי גרימת הצטברות שומן ב- MASLD. תאי HepG2 עוררו עם חומצת השומן הבלתי רוויה חומצה אולאית בריכוזים שונים (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) כדי לחקות MASLD. יעילות המודל הוערכה באמצעות בדיקות קיט-8 לספירת תאים, צביעת O אדום שמן וניתוח תכולת שומנים. מחקר זה נועד ליצור מודל תאי פשוט לתפעול עבור תאי MASLD. תוצאות ממבחני ערכת ספירת התאים 8 הראו כי הישרדותם של תאי HepG2 הייתה תלויה בריכוז חומצה אולאית, עם GI₅₀ של 1.875 מילימול. כדאיות התאים בקבוצות 0.5 מילימטר ו-1 מילימטר הייתה נמוכה משמעותית מזו שבקבוצת הביקורת (P < 0.05). יתר על כן, בדיקת צביעת שמן אדום O וניתוח תכולת שומנים בחנו שקיעת שומן בריכוזים משתנים של חומצה אולאית (0.125 מילימול, 0.25 מילימול, 0.5 מילימול, 1 מילימול) על תאי HepG2. תכולת השומנים בקבוצות 0.25 mM, 0.5 mM ו- 1 mM הייתה גבוהה משמעותית מזו של קבוצת הביקורת (P < 0.05). בנוסף, רמות הטריגליצרידים בקבוצות OA היו גבוהות משמעותית מאלה בקבוצת הביקורת (P < 0.05).

Introduction

מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) כוללת מגוון מצבים, כולל סטאטוזיס פשוט, סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), שחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית ^1,2,3,4,5,6, כולם מיוחסים לגורמים אחרים מלבד צריכת אלכוהול⁷. MASLD היא מחלת הכבד הנפוצה ביותר הנגרמת על ידי פגיעה מטבולית בכבד, המשפיעה על כמעט רבע מאוכלוסיית העולם 8,9,10,11,12. בעוד שהפתוגנזה המדויקת של MASLD טרם הובהרה, תיאוריות שונות מנסות להסביר את התפתחותה. אחת התפיסות הרווחות מציעה סטייה מהתיאוריה הקלאסית של "שתי חבטות" לעבר מודל¹ של "שתי חבטות". במרכז השערות אלה נמצא תפקידה של התנגודת לאינסולין, אשר מאמינים כי היא מרכזית בפתוגנזה MASLD¹³. מחקרים מצביעים על כך שתנגודת לאינסולין בהפטוציטים מובילה לרמות מוגברות של חומצות שומן חופשיות, וכתוצאה מכך יוצרת טריגליצרידים המאוחסנים בכבד^14,15.

חוקרים השתמשו הן במודלים in vivo והן במודלים במבחנה כדי לדמות שקיעת שומן ב- MASLD; עם זאת, שכפול מלא של מנגנון הפתו-מנגנון שלו נותר מאתגר. למרות מגבלה זו, מודלים אלה סייעו בחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות עבור MASLD. עם זאת, פיתוח מודל יציב של MASLD הוא קריטי. בעוד מודלים של בעלי חיים הם יעילים, הם גוזלים זמן רב ויקרים, ובכך מדגישים את העניין הגובר במודלים תאיים חוץ גופיים . מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בחומצות שומן חופשיות בודדות או מרובות כגון חומצה אולאית (OA) וחומצה פלמיטית כדי ליצור מחדש MASLD המושרה על ידי דיאטה. בין אלה, קו תאי הפטובלסטומה האנושי HepG2 משמש לעתים קרובות כדי להקים מודלים תאיים במבחנה של MASLD.

אינדוקציה OA מגרה תאי HepG2 לשכפל שקיעת שומן בדומה ל- MASLD, שיטה עם היסטוריה מבוססת היטב. מטרת מחקר זה הייתה להדגים את הכדאיות, צביעת שמן אדום O (ORO), תכולת שומנים ורמת טריגליצרידים (TG) של תאי HepG2 שטופלו ב- 0.25 mM OA. מטרת ניסוי זה הייתה לספק ראיות נוספות לפיתוח מחקרי מודלים של MAFLD.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. תרבית תאים

1. תאי תרבית HepG2 בצלוחיות תרבית המכילות את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) (המכיל 10% נסיוב בקר עוברי [FBS], 100 יחידות / מ"ל פניצילין, וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל). שמור על צלוחיות התרבית ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ .

2. השפעת חומצה אולאית על כדאיות התא כפי שנמדדה על ידי ערכת ספירת תאים-8

1. להמיס נפח מסוים של OA בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להשיג ריכוז של 200 mM. אחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20°C לשימוש עתידי.
2. זרע תאי HepG2 בצלחת 96 בארות בצפיפות תאים של 6 × 10³ תאים לכל באר. הוסף 100 μL של DMEM לכל באר. לדגור ולתרבת את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ במשך 24 שעות. חלק את תאי HepG2 לשתי קבוצות:
   1. קבוצת ביקורת: הוספת מדיום תרבית תאים.
   2. קבוצת OA: הוסף OA למדיום תרבית התאים כדי להשיג ריכוזים סופיים של 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ו- 1 mM.
3. לאחר 24 שעות של הדגירה הראשונית, יש להשליך את הסופרנאטנט מכל באר ולהוסיף OA בהתאם לקיבוץ שצוין, תוך הוספת 100 μL לכל באר. עבור קבוצת הביקורת, הוסף 100 μL של מדיום תרבית תאים לכל באר. ממשיכים לדגור על התאים עוד 24 שעות.
   הערה: ודא שלכל קבוצה יש שש בארות משוכפלות. כדי למנוע אידוי, הוסף 100 μL של מלוחים חוצצי פוספט (PBS) לטבעת החיצונית של בארות בלוח 96 בארות.
4. לאחר 24 שעות של דגירה, הוסיפו 10 מיקרוליטר של ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) לכל באר, ערבבו בעדינות ודגרו במשך שעתיים בחושך. הסר את הצלחת בעלת 96 הקידוחים מהאינקובטור, מקם אותה בקורא המיקרו-צלחות ומדד את ערך הספיגה ב-450 ננומטר (A₄₅₀). ערכי GI₅₀ נספרו על פי OD.

3. שמן אדום O צביעה כדי לצפות היווצרות טיפות שומנים תאית

1. זרע תאי HepG2 בצלחות תרבית תאים של 6 בארות בצפיפות של 5 × 10⁵ תאים לבאר ותגדל את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה קבועה למשך 24 שעות. עיינו באיור 1 לקבלת ייצוג חזותי של השלבים המתוארים.
2. לאחר 24 שעות של תרבית תאים, הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים המכיל OA לכל באר, וקבל ריכוזים סופיים של 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, ו 1 mM. לאחר 24 שעות נוספות, הסר את מדיום תרבית התאים מכל באר ושטוף פעמיים עם PBS. מוסיפים 1 מ"ל של קיבוע ORO לכל באר ודגרים במשך 30 דקות.
3. הכינו את תמיסת הצביעה ORO על ידי ערבוב תמיסת צביעה A עם תמיסת צביעה B ביחס של 3:2. הניחו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן סננו אותה פעם אחת דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. יש לאחסן את התמיסה המסוננת בצינור צנטריפוגה המוגן מפני אור עד לשימוש.
4. יש להשליך את הקיבוע ולשטוף פעמיים במים מזוקקים. מוסיפים 1 מ"ל של 60% איזופרופנול לכל באר ודגרים במשך 30 שניות. יש להשליך 60% מתמיסת האיזופרופנול ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת כתמים ORO טרייה לכל באר לפני הדגירה למשך 20 דקות. יש להשליך את תמיסת הצביעה ORO, להוסיף 1 מ"ל של 60% איזופרופנול לכל באר, ולדגור במשך 30 שניות. יש לשטוף 5 פעמים במים כדי להסיר עודפי צבע.
5. מכסים את התאים במים מזוקקים ומתבוננים תחת מיקרוסקופ. לאחר איסוף התמונות, השליכו את הנוזל שבצלחת והניחו לו להתייבש. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של isopropanol לכל באר ולנער את הצלחת על שייקר מסלול במשך 10 דקות. מעבירים את הנוזל לצלחת חדשה בת 96 בארות, עם 16 בארות בכל קבוצה, ומוסיפים 100 מיקרוליטר לכל באר. חשב את תכולת השומנים על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) של כל באר באמצעות קורא microplate ב 510 ננומטר (A₅₁₀).

4. השפעות ריכוזים שונים של חומצה אולאית על סך הטריגליצרידים בסופרנאטנט תאי HepG2

1. אזנו את הערכה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות והכינו את הצלחות הדרושות לניסוי.
2. אספו את הסופרנאטנט והצנטריפוגה של התא ב-1,570 × גרם למשך 10 דקות. קביעת בארות סטנדרטיות ובדיקת בארות לדוגמה. הוסף 50 μL של ריכוז סטנדרטי ([S0 → S5] ואחריו 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol / L) לבארות סטנדרטיות. בנוסף לבארות הריקות והסטנדרטיות, הוסף 10 μL של דגימות שונות לבארות הדגימה, ולאחר מכן הוסף 40 μL של מדלל דגימה לכל באר. מוסיפים 100 מיקרוליטר של נוגדן-חזרת לגילוי פרוקסידאז לכל באר, אוטמים עם קרום צלחת ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת בתנור בטמפרטורה קבועה.
3. השליכו את הסופרנטנט, ייבשו כתם על נייר נטול אבק, ושטפו כל באר בתמיסת כביסה אחת. השאירו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך דקה. חזרו על תהליך הכביסה 5x.
4. הוסף 50 μL של מצע A ו 50 μL של מצע B לכל באר. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 15 דקות ב-37°C. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סיום לכל באר ומדוד את ערך OD של כל באר ב- 450 ננומטר (_{A 450}) תוך 15 דקות.
5. התווה את ריכוז התקן לאורך ציר x ואת ערך הבליעה המתאים (OD) לאורך ציר y כדי לבצע רגרסיה ליניארית וגזור את משוואת העקומה כדי לחשב את ערך הריכוז של כל דגימה.

5. ניתוח סטטיסטי

1. לקבוע הבדלים משמעותיים בנתונים כמותיים.
2. חשב את הממוצע ± סטיית תקן (SD) וייצג באופן גרפי את הנתונים. שקול P < 0.05 להיות מובהק סטטיסטית.

תוצאות

השפעת חומצה אולאית על כדאיות התא
תאי HepG2 נחשפו לריכוזים משתנים של OA (0 מילימול, 0.125 מילימול, 0.25 מילימול, 0.5 מילימול, 1 מילימול), וכתוצאה מכך חלה ירידה בשיעורי הישרדות התאים ב-0.125 מילימול, 0.25 מילימול, 0.5 מילימטר ו-1 מילימטר בהשוואה ל-0 מילימול. מובהקות סטטיסטית נצפתה ב 0.5 mM (P < 0.05) ו 1 mM ...

Discussion

MASLD היא תסמונת קלינופתולוגית המאופיינת בתצהיר שומן תוך תאי מוגזם בהפטוציטים עקב גורמים מעבר לאלכוהול וסוכנים מזיקים אחרים לכבד¹⁸. MASLD קשור באופן מורכב לפגיעה בכבד בלחץ מטבולי נרכש, הקשורה בעיקר לתנגודת לאינסולין ולרגישות גנטית. כדי לחקור ולסנן ביעילות תרופות עבור MASLD, חיוני ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Millex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
0.45 µm filter	Millex
2 mL Crygenic Vials	CORNING	430659
25 cm2 Cell Culture Flask	CORNING	430639
6-well cell culture plate	CORNING	3516
96-well cell culture plate	CORNING	3599
Blood Count Plate	Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.	02270113
Cell Counting Kit-8 assays	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	CA1210-1000T
CO2 incubator	NUAIRE	NU-5710E
DMSO Dimethyl sulfoxide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	8122691
Enzyme Labeling Equipment	Tecan	Spark
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10099141
HepG2 cells line	Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)	221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instruction	Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute	20170301
Inverted Microscope for Cell Culture	Leica	DMi1
Isopropanol	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.	2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1262
Oleic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502071
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
SPSS 24.0		Statistics software