Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı için bir model olarak oleik asit kaynaklı HepG2 hücrelerinin kullanımını açıklamaktadır.

Özet

Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığının (MASLD) prevalansı, ekonomik ve yaşam tarzı modellerindeki değişiklikler nedeniyle artmış ve önemli sağlık sorunlarına yol açmıştır. Önceki raporlar, MASLD için hayvan ve hücresel modellerin kurulmasını incelemiş ve aralarındaki farkları vurgulamıştır. Bu çalışmada, MASLD'de yağ birikimi indüklenerek hücresel bir model oluşturulmuştur. HepG2 hücreleri, MASLD'yi taklit etmek için çeşitli konsantrasyonlarda (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) doymamış yağ asidi oleik asit ile uyarıldı. Modelin etkinliği, hücre sayma kiti-8 testleri, Yağ Kırmızısı O boyaması ve lipid içerik analizi kullanılarak değerlendirildi. Bu çalışma, MASLD hücreleri için kullanımı basit bir hücresel model oluşturmayı amaçlamıştır. Hücre sayma kiti-8 testlerinden elde edilen sonuçlar, HepG2 hücrelerinin hayatta kalmasının, 1.875 mM'lik bir GI50 ile oleik asit konsantrasyonuna bağlı olduğunu gösterdi. 0.5 mM ve 1 mM gruplarındaki hücre canlılığı, kontrol grubundakilerden anlamlı derecede düşüktü (P < 0.05). Ayrıca, Yağ Kırmızısı O boyama ve lipit içerik analizi, HepG2 hücrelerinde değişen oleik asit konsantrasyonlarında (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) yağ birikimini inceledi. 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM gruplarının lipid içeriği kontrol grubundan anlamlı derecede yüksekti (P < 0.05). Ek olarak, OA gruplarındaki trigliserit düzeyleri kontrol grubundakilere göre anlamlı olarak yüksekti (P < 0.05).

Giriş

Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), basit steatoz, alkolsüz steatohepatit (NASH), siroz ve hepatosellüler karsinom 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere bir dizi durumu kapsar ve bunların tümü alkol tüketimi dışındaki faktörlere atfedilir 7. MASLD, metabolik karaciğer hasarının neden olduğu en yaygın karaciğer hastalığıdır ve küresel nüfusun yaklaşık dörtte birini etkiler 8,9,10,11,12. MASLD'nin patogenezi henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, çeşitli teoriler MASLD'nin gelişimini açıklamaya çalışmaktadır. Hakim olan bir kavram, klasik "iki vuruş" teorisinden "çoklu vuruş" modeline doğru bir sapma olduğunu göstermektedir1. Bu hipotezlerin merkezinde, MASLD patogenezinde çok önemli olduğuna inanılan insülin direncinin rolü yer almaktadır13. Araştırmalar, hepatositlerdeki insülin direncinin, serbest yağ asitleri seviyelerinin artmasına yol açtığını ve ardından karaciğerde depolanan trigliseritleri oluşturduğunu göstermektedir14,15.

Araştırmacılar, MASLD'de yağ birikimini simüle etmek için hem in vivo hem de in vitro modelleri kullandılar; Yine de patomekanizmasını tam olarak kopyalamak zor olmaya devam ediyor. Bu sınırlamaya rağmen, bu modeller MASLD için potansiyel terapötik hedeflerin incelenmesinde etkili olmuştur. Bununla birlikte, kararlı bir MASLD modelinin geliştirilmesi çok önemlidir. Hayvan modelleri etkili olsa da, zaman alıcı ve pahalıdır, bu nedenle in vitro hücresel modellere artan ilgiyi vurgulamaktadır. Bu modeller, diyete bağlı MASLD'yi yeniden oluşturmak için genellikle oleik asit (OA) ve palmitik asit gibi tekli veya çoklu serbest yağ asitleri kullanır. Bunlar arasında, insan hepatoblastom hücre hattı HepG2, MASLD'nin in vitro hücresel modellerini oluşturmak için sıklıkla kullanılır.

OA indüksiyonu, HepG2 hücrelerini, köklü bir geçmişe sahip bir yöntem olan MASLD'ye benzer yağ birikimini çoğaltmak için uyarır. Bu çalışmanın amacı, 0.25 mM OA ile tedavi edilen HepG2 hücrelerinin canlılığını, Yağ Kırmızı O (ORO) boyamasını, lipid içeriğini ve trigliserid (TG) düzeyini göstermektir. Bu deneyin amacı, MAFLD modelleme çalışmalarının geliştirilmesi için daha fazla kanıt sağlamaktı.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Hücre kültürü

  1. Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) (% 10 fetal sığır serumu [FBS], 100 birim / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren) içeren kültür şişelerinde kültür HepG2 hücrelerinin kültürü. Kültür şişelerini %5'lik bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de tutun.

2. Oleik asidin hücre sayma kiti-8 ile ölçülen hücre canlılığı üzerindeki etkisi

  1. 200 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için belirli bir OA hacmini dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. Solüsyonu ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.
  2. Oyuk başına 6 × 10 3 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakada tohumHepG2 hücreleri. Her oyuğa 100 μL DMEM ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin ve kültürleyin. HepG2 hücrelerini iki gruba ayırın:
    1. Kontrol grubu: hücre kültürü ortamı ekleyin.
    2. OA grubu: 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM'lik nihai konsantrasyonları elde etmek için hücre kültürü ortamına OA ekleyin.
  3. İlk inkübasyondan 24 saat sonra, süpernatanı her bir oyuktan atın ve kuyucuk başına 100 μL ekleyerek belirtilen gruplamaya göre OA ekleyin. Kontrol grubu için, her oyuğa 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat daha inkübe etmeye devam edin.
    NOT: Her grubun altı çoğaltma kuyusu olduğundan emin olun. Buharlaşmayı önlemek için, 96 oyuklu plakadaki oyukların dış halkasına 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
  4. 24 saatlik inkübasyondan sonra, her bir oyuğa 10 μL hücre sayma kiti-8 (CCK-8) ekleyin, hafifçe karıştırın ve karanlıkta 2 saat inkübe edin. 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın, mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve absorbans değerini 450 nm'de (A450) ölçün. GI50 değerleri OD'ye göre sayıldı.

3. Hücre içi lipid damlacık oluşumunu gözlemlemek için Yağ Kırmızısı O boyama

  1. HepG2 hücrelerini, oyuk başına 5 × 105 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu hücre kültürü plakalarında tohumlayın ve plakaları 24 saat boyunca sabit sıcaklıkta bir inkübatörde kültürleyin. Açıklanan adımların görsel bir temsili için Şekil 1'e bakın.
  2. 24 saatlik hücre kültüründen sonra, her bir oyuğa OA içeren 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM'lik nihai konsantrasyonlar elde edin. Ek bir 24 saat sonra, hücre kültürü ortamını her bir oyuktan çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Her oyuğa 1 mL ORO fiksatif ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.
  3. Boyama çözeltisi A'yı boyama çözeltisi B ile 3:2 oranında karıştırarak ORO boyama çözeltisini hazırlayın. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, ardından 0,45 μm'lik bir filtreden bir kez süzün. Filtrelenmiş çözeltiyi kullanıma kadar ışıktan korunan bir santrifüj tüpünde saklayın.
  4. Sabitleyiciyi atın ve damıtılmış suyla iki kez yıkayın. Her oyuğa 1 mL% 60 izopropanol ekleyin ve 30 saniye inkübe edin. İzopropanol çözeltisinin% 60'ını atın ve 20 dakika inkübe etmeden önce her bir kuyucuğa 1 mL taze hazırlanmış ORO leke çözeltisi ekleyin. ORO boyama solüsyonunu atın, her oyuğa 1 mL% 60 izopropanol ekleyin ve 30 saniye inkübe edin. Fazla boyayı çıkarmak için 5 kez suyla yıkayın.
  5. Hücreleri damıtılmış suyla örtün ve mikroskop altında gözlemleyin. Görüntüler toplandıktan sonra, plakadaki sıvıyı atın ve kurumasını bekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 2 mL izopropanol ekleyin ve plakayı bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika çalkalayın. Sıvıyı, her grupta 16 kuyucuk bulunan ve kuyucuk başına 100 μL ekleyen 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın. 510 nm'de (A510) bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun optik yoğunluğunu (OD) ölçerek lipit içeriğini hesaplayın.

4. Farklı oleik asit konsantrasyonlarının HepG2 hücre süpernatanında toplam trigliserit üzerindeki etkileri

  1. Kiti oda sıcaklığında 20 dakika dengeleyin ve deney için gerekli plakaları hazırlayın.
  2. Hücre süpernatanını toplayın ve 1,570 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Standart kuyuları ayarlayın ve numune kuyularını test edin. Standart kuyucuklara 50 μL standart ([S0 → S5] konsantrasyonu ve ardından: 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol / L) ekleyin. Boş ve standart kuyucuklara ek olarak, numune kuyucuklarına 10 μL farklı numune ekleyin, ardından her bir kuyucuğa 40 μL numune seyreltici ekleyin. Her oyuğa 100 μL tespit antikoru-yaban turpu peroksidaz ekleyin, bir plaka zarı ile kapatın ve sabit sıcaklıktaki bir fırında 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Süpernatanı atın, tozsuz kağıt üzerinde kurulayın ve her birini 1x yıkama solüsyonuyla yıkayın. 1 dakika oda sıcaklığında bekletin. Yıkama işlemini 5 kez tekrarlayın.
  4. Her oyuğa 50 μL substrat A ve 50 μL substrat B ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 50 μL sonlandırma çözeltisi ekleyin ve her kuyucuğun OD değerini 15 dakika içinde 450 nm'de (A450) ölçün.
  5. Doğrusal regresyon gerçekleştirmek için x ekseni boyunca standardın konsantrasyonunu ve y ekseni boyunca karşılık gelen absorbans (OD) değerini çizin ve her bir numunenin konsantrasyon değerini hesaplamak için eğri denklemini türetin.

5. İstatistiksel analiz

  1. Nicel verilerdeki önemli farklılıkları belirleyin.
  2. Ortalama ± standart sapmayı (SD) hesaplayın ve verileri grafiksel olarak gösterin. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.

Sonuçlar

Oleik asidin hücre canlılığı üzerindeki etkisi
HepG2 hücreleri, değişen OA konsantrasyonlarına (0 mM, 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) maruz bırakıldı, bu da 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM'de hücre sağkalım oranlarında bir azalmaya neden oldu. 0 mM ile karşılaştırıldığında 0.5 mM (P < 0.05) ve 1 mM (P < 0.05) olarak istatistiksel anlamlılık gözlendi. CCK-8 kiti tarafından değerlendirildiği gibi, OA'nın hücre canlılığı üzerindeki etkisinin sonu...

Tartışmalar

MASLD, alkol ve diğer yerleşik karaciğere zarar veren ajanların dışındaki faktörlere bağlı olarak hepatositlerde aşırı hücre içi yağ birikimi ile karakterize klinikopatolojik bir sendromdur18. MASLD, özellikle insülin direnci ve genetik yatkınlık ile ilişkili olan edinilmiş metabolik stres karaciğer hasarı ile karmaşık bir şekilde bağlantılıdır. MASLD için ilaçları etkili bir şekilde incelemek ve taramak için uygun bir deneysel model seçmek çok önemlidir. Bir...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, İç Moğolistan Özerk Bölgesi Bilim ve Teknoloji Bölümü bilim ve teknoloji programının 2018 Destekli Projesi kapsamında "Koumiss'in Moğol tıbbının bölgesel hastalıkları üzerindeki iyileştirici etkisinin temel konuları üzerine çalışma" tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm filterMillex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0.45 µm filterMillex
2 mL Crygenic VialsCORNING430659
25 cm2 Cell Culture FlaskCORNING430639
6-well cell culture plateCORNING3516
96-well cell culture plateCORNING3599
Blood Count PlateShanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.02270113
Cell Counting Kit-8 assaysBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. CA1210-1000T
CO2 incubatorNUAIRENU-5710E
 DMSO Dimethyl sulfoxide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. D8371
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco8122691
Enzyme Labeling EquipmentTecanSpark
Fetal Bovine Serum, QualifiedGibco10099141
HepG2 cells lineBeijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instructionNanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
Inverted Microscope for Cell CultureLeicaDMi1 
IsopropanolTianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured CellsBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. G1262
Oleic acid Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502071
Penicillin StreptomycinGibco15140122
SPSS 24.0Statistics software

Referanslar

  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072 (2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334 (2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238 (2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476 (2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319 (2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287 (2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536 (2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494 (2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287 (2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (4), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489 (2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541 (2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847 (2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255 (2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635 (2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20 (2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de bu aysay 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır