Modelagem in vitro da deposição de gordura na doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica

Resumo

Este artigo descreve o uso de células HepG2 induzidas por ácido oleico como modelo para doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica.

Resumo

A prevalência de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) aumentou devido a mudanças nos padrões econômicos e de estilo de vida, levando a desafios de saúde significativos. Relatórios anteriores estudaram o estabelecimento de modelos animais e celulares para MASLD, destacando diferenças entre eles. Neste estudo, foi criado um modelo celular induzindo o acúmulo de gordura em MASLD. As células HepG2 foram estimuladas com o ácido graxo insaturado ácido oleico em várias concentrações (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) para emular MASLD. A eficácia do modelo foi avaliada usando ensaios de contagem de células-8, coloração Oil Red O e análise do conteúdo lipídico. Este estudo teve como objetivo criar um modelo celular simples de operar para células MASSLD. Os resultados dos ensaios do kit de contagem de células-8 mostraram que a sobrevivência das células HepG2 foi dependente da concentração de ácido oleico, com um GI₅₀ de 1,875 mM. A viabilidade celular nos grupos 0,5 mM e 1 mM foi significativamente menor do que no grupo controle (P < 0,05). Além disso, a coloração Oil Red O e a análise do conteúdo lipídico examinaram a deposição de gordura em concentrações variadas de ácido oleico (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) em células HepG2. O conteúdo lipídico dos grupos 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM foi significativamente maior do que o do grupo controle (P < 0,05). Além disso, os níveis de triglicerídeos nos grupos OA foram significativamente maiores do que os do grupo controle (P < 0,05).

Introdução

A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) engloba uma variedade de condições, incluindo esteatose simples, esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), cirrose e carcinoma hepatocelular ^1,2,3,4,5,6, todas atribuídas a outros fatores além do consumo de álcool ⁷. A MASLD é a doença hepática mais prevalente causada por lesão hepática metabólica, afetando quase um quarto da população mundial 8,9,10,11,12. Embora a patogênese precisa do MASLD ainda não tenha sido elucidada, várias teorias tentam explicar seu desenvolvimento. Uma noção predominante sugere um afastamento da teoria clássica de "dois golpes" em direção a um modelo de "múltiplos golpes"¹. Central para essas hipóteses é o papel da resistência à insulina, que se acredita ser fundamental na patogênese da MASLD¹³. Pesquisas indicam que a resistência à insulina nos hepatócitos leva ao aumento dos níveis de ácidos graxos livres, formando posteriormente triglicerídeos armazenados no fígado^14,15.

Os pesquisadores usaram modelos in vivo e in vitro para simular a deposição de gordura em MASLD; No entanto, replicar totalmente seu mecanismo patológico continua sendo um desafio. Apesar dessa limitação, esses modelos têm sido fundamentais no estudo de potenciais alvos terapêuticos para MASLD. No entanto, o desenvolvimento de um modelo estável de MASLD é crucial. Embora os modelos animais sejam eficazes, eles são demorados e caros, destacando assim o crescente interesse em modelos celulares in vitro . Esses modelos geralmente usam ácidos graxos livres únicos ou múltiplos, como ácido oleico (OA) e ácido palmítico, para recriar MASLD induzido por dieta. Dentre estes, a linhagem celular de hepatoblastoma humano HepG2 é frequentemente utilizada para estabelecer modelos celulares in vitro de MASLD.

A indução da OA estimula as células HepG2 a replicar a deposição de gordura semelhante ao MASLD, um método com uma história bem estabelecida. O objetivo deste estudo foi demonstrar a viabilidade, a coloração Oil Red O (ORO), o conteúdo lipídico e o nível de triglicerídeos (TG) de células HepG2 tratadas com OA 0,25 mM. O objetivo deste experimento foi fornecer mais evidências para o desenvolvimento de estudos de modelagem MAFLD.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Cultura de células

1. Cultura de células HepG2 em frascos de cultura contendo Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco (contendo 10% de soro fetal bovino [FBS], 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Manter os frascos de cultura a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.

2. Efeito do ácido oleico na viabilidade celular medida pelo kit de contagem de células-8

1. Dissolver um volume específico de OA em dimetilsulfóxido (DMSO) até atingir uma concentração de 200 mM. Conservar a solução a -20 °C para utilização futura.
2. Semeie células HepG2 em uma placa de 96 poços com uma densidade celular de 6 × 10³ células por poço. Adicione 100 μL de DMEM a cada poço. Incubar e cultivar as células a 37 °C em uma incubadora de CO_{5% 2} por 24 h. Divida as células HepG2 em dois grupos:
   1. Grupo controle: adicionar meio de cultura celular.
   2. Grupo OA: adicione OA ao meio de cultura celular para atingir concentrações finais de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM.
3. Após 24 h de incubação inicial, descartar o sobrenadante de cada alvéolo e adicionar OA de acordo com o agrupamento especificado, adicionando 100 μL por alvéolo. Para o grupo de controle, adicione 100 μL de meio de cultura de células a cada poço. Continue a incubar as células por mais 24 horas.
   NOTA: Certifique-se de que cada grupo tenha seis poços replicados. Para evitar a evaporação, adicione 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao anel externo de poços na placa de 96 poços.
4. Após 24 h de incubação, adicione 10 μL de kit de contagem de células-8 (CCK-8) a cada poço, misture delicadamente e incube por 2 h no escuro. Retire a placa de 96 poços da incubadora, coloque-a no leitor de microplacas e meça o valor de absorbância a 450 nm (A₄₅₀). Os valores do IG₅₀ foram contados de acordo com a DO.

3. Coloração Oil Red O para observar a formação de gotículas lipídicas intracelulares

1. Semeie células HepG2 em placas de cultura de células de 6 poços a uma densidade de 5 × 10⁵ células por poço e cultive as placas em uma incubadora de temperatura constante por 24 h. Consulte a Figura 1 para obter uma representação visual das etapas descritas.
2. Após 24 h de cultura celular, adicione 2 mL de meio de cultura celular contendo OA a cada poço, atingindo concentrações finais de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM. Após mais 24 horas, remover o meio de cultura celular de cada alvéolo e lavar duas vezes com PBS. Adicione 1 mL de fixador ORO a cada poço e incube por 30 min.
3. Prepare a solução de coloração ORO misturando a solução de coloração A com a solução de coloração B na proporção de 3:2. Deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por 10 min e, em seguida, filtre-a uma vez com um filtro de 0,45 μm. Conservar a solução filtrada num tubo de centrifugação protegido da luz até à utilização.
4. Descarte o fixador e lave duas vezes com água destilada. Adicione 1 mL de isopropanol a 60% em cada poço e incube por 30 s. Descarte 60% da solução de isopropanol e adicione 1 mL de solução de coloração ORO recém-preparada em cada poço antes de incubar por 20 min. Descarte a solução de coloração ORO, adicione 1 mL de isopropanol a 60% em cada poço e incube por 30 s. Lave 5x com água para remover o excesso de corante.
5. Cubra as células com água destilada e observe ao microscópio. Depois que as imagens forem coletadas, descarte o líquido na placa e deixe secar. Em seguida, adicione 2 mL de isopropanol a cada poço e agite a placa em um agitador orbital por 10 min. Transfira o líquido para uma nova placa de 96 poços, com 16 poços em cada grupo, adicionando 100 μL por poço. Calcular o teor de lípidos medindo a densidade ótica (DO) de cada alvéolo utilizando um leitor de microplacas a 510 nm (A₅₁₀).

4. Efeitos de diferentes concentrações de ácido oleico sobre triglicerídeos totais em sobrenadantes de células HepG2

1. Equilibre o kit em temperatura ambiente por 20 min e prepare as placas necessárias para o experimento.
2. Recolher o sobrenadante da célula e centrifugar a 1.570 × g durante 10 min. Defina poços padrão e teste de poços de amostra. Adicione 50 μL de concentração padrão ([S0 → S5] seguido por: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol / L) aos poços padrão. Além dos poços em branco e padrão, adicione 10 μL de amostras diferentes aos poços de amostra, seguido pela adição de 40 μL de diluente de amostra a cada poço. Adicionar 100 μL de peroxidase de anticorpo-rábano de detecção a cada alvéolo, selar com uma membrana de placa e incubar a 37 °C durante 1 h numa estufa de temperatura constante.
3. Descarte o sobrenadante, seque em papel livre de poeira e lave cada poço com 1x solução de lavagem. Deixe repousar em temperatura ambiente por 1 min. Repita o processo de lavagem 5x.
4. Adicione 50 μL de substrato A e 50 μL de substrato B a cada poço. Misture delicadamente e incube por 15 min a 37 °C. Adicione 50 μL de solução de terminação a cada poço e meça o valor OD de cada poço a 450 nm (A₄₅₀) em 15 min.
5. Plote a concentração do padrão ao longo do eixo x e o valor de absorbância (OD) correspondente ao longo do eixo y para realizar a regressão linear e derive a equação da curva para calcular o valor da concentração de cada amostra.

5. Análise estatística

1. Determine diferenças significativas nos dados quantitativos.
2. Calcule a média ± desvio padrão (DP) e represente graficamente os dados. Considere P < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

Efeito do ácido oleico na viabilidade celular
As células HepG2 foram expostas a concentrações variadas de OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), resultando em uma diminuição nas taxas de sobrevivência celular em 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM em comparação com 0 mM. Observou-se significância estatística em 0,5 mM (P < 0,05) e 1 mM (P < 0,05) quando comparados a 0 mM. Os resultados do impacto da OA na viabilidade celular, conforme avaliado pelo kit CCK-8, são mostra...

Discussão

A MASLD é uma síndrome clínico-patológica caracterizada pela deposição excessiva de gordura intracelular nos hepatócitos devido a fatores além do álcool e outros agentes prejudiciais ao fígado estabelecidos¹⁸. A MASLD está intrinsecamente ligada à lesão hepática por estresse metabólico adquirido, notadamente associada à resistência à insulina e à suscetibilidade genética. Para estudar e rastrear efetivamente os medicamentos para MASLD, é crucial selecionar um modelo experiment...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Millex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
0.45 µm filter	Millex
2 mL Crygenic Vials	CORNING	430659
25 cm2 Cell Culture Flask	CORNING	430639
6-well cell culture plate	CORNING	3516
96-well cell culture plate	CORNING	3599
Blood Count Plate	Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.	02270113
Cell Counting Kit-8 assays	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	CA1210-1000T
CO2 incubator	NUAIRE	NU-5710E
DMSO Dimethyl sulfoxide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	8122691
Enzyme Labeling Equipment	Tecan	Spark
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10099141
HepG2 cells line	Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)	221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instruction	Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute	20170301
Inverted Microscope for Cell Culture	Leica	DMi1
Isopropanol	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.	2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1262
Oleic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502071
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
SPSS 24.0		Statistics software