研究小鼠的正畸牙齿运动

摘要

在这里，我们提出了一种研究正畸牙齿移动 （OTM） 的方案，作为研究骨适应机制、牙根吸收和骨细胞对机械刺激的反应的合适模型。本综合指南提供了有关 OTM 模型、显微计算机断层扫描采集和后续分析的详细信息。

摘要

正畸牙齿移动 （OTM） 代表了一个动态过程，其中牙槽骨分别在破骨细胞和成骨细胞协调下在压缩部位发生吸收和在张力部位发生沉积。这种机制是研究骨骼适应各个方面的有价值的模型，包括根吸收和细胞对机械力刺激的反应。此处概述的协议提供了一种研究 OTM 的直接方法，将 0.35 N 确定为采用镍钛 （NiTi） 螺旋弹簧的小鼠模型中的最佳力。利用显微计算机断层扫描分析，我们通过评估水泥-牙釉质交界处线性距离的差异来量化 OTM。评估还包括对正畸诱导的炎性根吸收的分析，评估根矿物质密度和根体积占总体积的百分比等参数。这个全面的协议有助于促进我们对骨重塑过程的理解，并增强开发有效正畸治疗策略的能力。

引言

骨重塑是一个由破骨细胞、成骨细胞、骨衬里细胞和骨细胞精心策划的持续过程，对于维持成人骨骼的完整性至关重要 ^1,2。这个动态过程主要由破骨细胞和成骨细胞的分化和活性驱动，涉及骨骼的再吸收和沉积，由机械应力和负荷触发 ^3,4,5。

动物实验在阐明支撑正畸牙齿移动 （OTM） 的复杂生物学和细胞机制方面发挥着关键作用^6,7。这个过程涉及多种细胞类型，例如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、成纤维细胞以及位于颌骨和牙周韧带内的免疫细胞，如巨噬细胞和 T 细胞 ^7,8。这些细胞对机械刺激和局部环境的变化做出动态反应，影响周围骨骼的组成和结构 ^7,8。此外，它们还会在细胞水平上触发炎症反应，即使不存在病原体。这种炎症反应在增加骨组织更新中发挥作用⁹。

各种动物模型，包括小鼠、大鼠、兔子、狗和猴子，已被用于 OTM ^7,8,10 的实验研究。其中，啮齿动物，尤其是小鼠，被青睐用于研究牙齿移动和骨骼重塑的初始阶段⁶。以前的研究强调了使用小鼠模型优于大鼠模型的优势，主要是由于转基因菌株的广泛可用性，从而能够详细探索 OTM 中的遗传影响 ^7,11。目前，两种主要模型用于诱导小鼠牙齿移动。第一种方法需要在第一上磨牙和上切牙之间插入镍钛 （NiTi） 螺旋弹簧 ^4,12。第二种方法涉及在第一和第二上磨牙¹³ 之间的齿间间隙内放置松紧带。分析的主要结果通常包括牙齿移动的大小和骨骼微结构，最好使用显微计算机断层扫描 （micro-CT） 进行评估¹⁴。理想情况下，评估牙根的完整性对于确保使用适当的力来产生 OT^M4 很重要。

虽然显微 CT 被广泛认为是评估矿化组织微结构的金标准¹⁴，但缺乏用于扫描、分析和报告数据的标准化方法和协议通常会给辨别所采用的精确程序、解释结果和促进不同 OTM 模型之间的比较带来挑战^14,15。

在这里，我们提供了 OTM 小鼠模型的分步指南，包括 OTM、骨微结构和牙根的显微 CT 采集和分析。这种方法需要对第一磨牙施加受控的机械力，以诱导颚骨内的运动。选择此方法源于几个因素，包括可行性、相关性和精度。这种方法可以进行详细的定量分析，为正畸牙齿移动的生物过程提供有价值的见解，并促进未来改进正畸治疗策略的开发。

研究方案

所有程序均严格遵守米纳斯吉拉斯联邦大学道德委员会制定的道德标准（第 166/2022 号）。在每次实验之前，必须进行样本量计算。使用体重约 20-30 克的 8-10 周龄雄性 C57BL6/J 野生型小鼠。小鼠必须饲养在保持在 25 °C 的房间内的笼子中，坚持 12 小时的光照/12 小时的黑暗循环。连接线圈后，应用软食喂养动物。日常监测应包括对体重和整体健康状况的评估。

1. 机械诱导的牙槽骨重塑

1. 使用远端切割钳，使用正畸 Weingart 钳子将 0.25 x 0.76 英寸的 NiTi 开圈弹簧切割成以下尺寸，即六个环和两个垂直于弹簧的环状末端。
2. 使用 Mathieu 镊子和圆形仪器作为尺寸参考，将直径为 0.20 mm 的圆形铬镍 （CrNi） 线塑造成所需的配置，并带有环形末端。
3. 将线圈的环形端和 0.20 mm 圆形 CrNi 线放在一起。
4. 通过腹膜内注射 0.2 mL 含有甲苯噻嗪 （10 mg/Kg） 和氯胺酮 （100 mg/Kg） 的溶液麻醉动物。在开始手术之前，使用踏板反射评估麻醉深度。用镊子小心地捏住动物的一个脚趾。没有反射表明有足够的全身麻醉平面。为避免角膜损伤和术后疼痛，请在动物麻醉后涂抹眼部润滑剂。
5. 将动物放在手术台上的背卧位，固定其四肢以限制运动并启用口腔内通路。
6. 使用由直径为 0.50 mm 的金属丝制成并用 0.08 mm 金属丝固定的开口器，以促进完全可视化，同时防止头部移动。使用右侧作为实验侧（OTM 侧），使用左侧作为没有正畸线圈的对照（控制侧）。
   注意:必须使用立体显微镜和光学光系统实现口内结构的增强可视化。
7. 分别使用丙酮和自蚀刻引物清洁和蚀刻右第一磨牙和切牙表面。该系统是自蚀刻的，这意味着它不需要事先进行酸调节。
   1. 一步涂上底漆，底漆还同时起酸和粘合剂的作用。使用微刷，收集少量自蚀刻底漆并将其涂抹在上第一磨牙和门牙的咬合面上。在此步骤中必须小心，以确保自蚀刻底漆不会到达第一磨牙和第二磨牙之间的近端表面，因为这可能会导致牙科元件粘在一起，从而阻止牙齿移动。在磨牙和门牙的咬合表面对引物进行光固化 30 秒。
8. 用光固化树脂和光固化将六环 NiTi 开圈弹簧的远端粘合到右第一上颌磨牙的咬合面上，持续 30 秒。在金属丝的边缘添加额外的树脂增量，以避免对小鼠造成伤害并光固化 30 秒。
9. 使用专门设计的设备激活线圈，该装置由连接到手术台的导轨和曲柄机构组成。这使得纵向运动可以来回滑动。
10. 将 0.20 mm 圆线的自由环状端连接到张力计的钩子上。
11. 启动曲柄后，沿导轨移动手术台，直到测功机记录到 0.35 N 的力。
12. 将 0.20 毫米圆线粘合到两个上门牙上以固定线圈。在实验期间不进行进一步的重新激活。剪断电线，将动物从测功机上分离。 添加另一份树脂，使设备的金属边缘不会暴露在外，也不会伤害动物。光固化 30 秒。从桌子上拆下动物。
13. 右上第一磨牙与在近中方向施加 0.35 N 力的装置由实验侧组成。使用上颌骨的左侧（没有正畸矫治器）作为对照 ^4,16。
14. 将此设备维护 12 天，无需任何激活。不要使用任何止痛药。正畸运动是通过炎症过程发生的，止痛药物可能会对花生四烯酸级联产生负面影响，影响骨重塑的速度并可能使结果无效。
15. 手术结束后，皮下注射生理盐水溶液治疗动物，以避免在适应期间使用该设备脱水。将动物放在单独的笼子里加热，直到它完全恢复，只有在这段时间之后才能将动物放在集体笼子里。
16. 在^第 12 天对小鼠实施安乐死，腹膜内注射含有甲苯噻嗪 （10 mg/Kg） 和氯胺酮 （100 mg/Kg） 的 0.2 mL 溶液镇静，然后用锋利的剪刀斩首。

2. 显微 CT 测量

1. 用锋利的剪刀切割所有软组织收获上颌骨，矢状面的颧骨，冠状面的额鼻缝合和蝶枕同步骨质。将上颌骨浸入 10% 中性缓冲福尔马林 （pH=7.4） 中固定 48 小时。在此期间后，将甲醛溶液改为 70% 酒精。
2. 使用以下参数对上颌骨进行显微 CT 扫描以进行高分辨率扫描:各向同性体素大小为 9 至 18 μm，X 射线设置为 50 kV，0.5 mm 铝滤光片和 0.5° 旋转角度。在 microCT 扫描期间可以安装多个下巴。
3. 使用显微计算机断层扫描 （microCT） 制造商指示的显微断层扫描重建程序重建获取的图像¹⁷.
4. 使用所用显微断层扫描制造商指示的 3D 检查程序定位重建的图像。
5. 通过测量右半上颌骨（OTM 侧）的第一磨牙和第二磨牙相对于左半上颌骨（对照侧）的第一磨牙和第二磨牙的水泥-牙釉质交界处 （CEJ） 之间的线性距离差来量化 OTM。使用适当的 microCT 分析仪软件和线工具进行此测量 17,18,19,20。
6. 检查样本是否存在正畸诱导的炎症根吸收 （OIIRR）。通过使用不规则的手动绘制的感兴趣区域轮廓方法，选择第一上颌磨牙前庭根的感兴趣区域 （ROI）。测量以下参数:根矿物质密度 （RMD;g/cm³） 和根体积与总体积的百分比 （RV/TV; %）。使用适当的 microCT 分析仪软件和 3D 体积测量工具进行此测量^16,21。
7. 使用 Mimics 软件进行第一上颌磨牙的重建，并分析获得的数据，以得出有关实验模型中 OTM 和 OIIRR 的结论^16,21。

结果

该协议能够使用 NiTi 螺旋弹簧研究 OTM 小鼠模型。施加 0.35 N 的力时，第一和第二磨牙之间控制侧的平均 CEJ 距离为 243.69 μm（图 1A，A 行），而 OTM 侧的测量值为 284.66 μm（图 1A，B 行）。OTM 和对照侧之间的差异为 40.97 μm （图 1B）。使用适当的 microCT 分析仪软件，使用线条工具在至少六个不同的部分测量右半上颌骨（O...

讨论

在这里，我们描述了一种标准化方案，旨在阐明 OTM 期间骨重塑的细胞和分子机制。要彻底了解小鼠的这些机制，需要一个精心规划的方案，以确保准确性和可靠性 ^7,11。我们研究小组进行的研究表明，该协议通过结合张力计和专门设计的装置有效地减少了操作员的可变性，将 0.35 N 确立为小鼠模型 4,16,17,18,19,...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A