Étude du mouvement orthodontique des dents chez la souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l’étude du mouvement des dents orthodontiques (OTM), servant de modèle approprié pour étudier les mécanismes d’adaptation osseuse, de résorption radiculaire et de réponse des cellules osseuses aux stimuli mécaniques. Ce guide complet fournit des informations détaillées sur le modèle OTM, l’acquisition de la micro-tomodensitométrie et l’analyse ultérieure.

Résumé

Le mouvement orthodontique des dents (OTM) représente un processus dynamique dans lequel l’os alvéolaire subit une résorption aux sites de compression et un dépôt aux sites de tension, orchestré par les ostéoclastes et les ostéoblastes, respectivement. Ce mécanisme sert de modèle précieux pour l’étude de divers aspects de l’adaptation osseuse, y compris la résorption radiculaire et la réponse cellulaire aux stimuli de force mécanique. Le protocole décrit ici offre une approche simple pour étudier l’OTM, établissant 0,35 N comme force optimale dans un modèle murin utilisant un ressort hélicoïdal nickel-titane (NiTi). À l’aide de l’analyse par micro-tomodensitométrie, nous avons quantifié l’OTM en évaluant l’écart de la distance linéaire à la jonction ciment-émail. L’évaluation comprenait également une analyse de la résorption radiculaire inflammatoire induite par l’orthodontie, évaluant des paramètres tels que la densité minérale racinaire et le pourcentage de volume radiculaire par volume total. Ce protocole complet contribue à faire progresser notre compréhension des processus de remodelage osseux et à améliorer la capacité à développer des stratégies de traitement orthodontique efficaces.

Introduction

Le remodelage osseux est un processus continu orchestré par les ostéoclastes, les ostéoblastes, les cellules de la muqueuse osseuse et les ostéocytes, essentiels au maintien de l’intégrité du squelette adulte ^1,2. Principalement entraîné par la différenciation et l’activité des ostéoclastes et des ostéoblastes, ce processus dynamique implique la résorption et le dépôt de l’os, déclenchés par le stress mécanique et la mise en charge ^3,4,5.

Les expériences sur les animaux jouent un rôle central dans l’élucidation des mécanismes biologiques et cellulaires complexes qui sous-tendent le mouvement orthodontique des dents (OTM)^6,7. Ce processus implique un large éventail de types de cellules, tels que les ostéoblastes, les ostéoclastes, les ostéocytes, les fibroblastes et les cellules immunitaires comme les macrophages et les lymphocytes T, situés dans l’os de la mâchoire et le ligament parodontal ^7,8. Ces cellules répondent dynamiquement aux stimuli mécaniques et aux changements dans le milieu local, influençant la composition et l’architecture de l’os environnant ^7,8. De plus, ils déclenchent également une réponse inflammatoire au niveau cellulaire, même s’il n’y a pas d’agents pathogènes présents. Cette réponse inflammatoire joue un rôle dans l’augmentation du renouvellement du tissu osseux⁹.

Divers modèles animaux, y compris des souris, des rats, des lapins, des chiens et des singes, ont été utilisés dans des études expérimentales d’OTM ^7,8,10. Parmi ceux-ci, les rongeurs, en particulier les souris, sont privilégiés pour étudier les phases initiales du mouvement des dents et du remodelage osseux⁶. Des recherches antérieures ont souligné les avantages de l’utilisation de modèles murins par rapport aux modèles de rats, principalement en raison de la disponibilité généralisée de souches génétiquement modifiées, permettant une exploration détaillée des influences génétiques dans OTM ^7,11. Actuellement, deux modèles principaux sont utilisés pour induire le mouvement des dents chez la souris. La première méthode consiste à insérer un ressort hélicoïdal en nickel-titane (NiTi) entre la première molaire supérieure et les incisives supérieures ^4,12. La deuxième approche consiste à placer un élastique dans l’espace interdentaire entre la première et la deuxième molaire supérieure¹³. Les principaux critères de jugement analysés comprennent généralement l’amplitude du mouvement de la dent et la microarchitecture osseuse, de préférence évaluée à l’aide de la micro-tomodensitométrie (micro-CT)¹⁴. Idéalement, l’évaluation de l’intégrité des racines dentaires est importante pour s’assurer que des forces appropriées sont employées pour produire de l’OT^M4.

Bien que la micro-TDM soit largement reconnue comme la référence pour l’évaluation de la microarchitecture des tissus minéralisés¹⁴, l’absence de méthodologies et de protocoles standardisés pour le balayage, l’analyse et la communication des données présente souvent des défis pour discerner les procédures précises utilisées, interpréter les résultats et faciliter les comparaisons entre différents modèles OTM ^14,15.

Nous présentons ici un guide étape par étape du modèle murin OTM, y compris l’acquisition et l’analyse de l’OTM, de la microstructure osseuse et des racines dentaires. Cette méthode consiste à appliquer une force mécanique contrôlée à la première molaire pour induire un mouvement à l’intérieur de l’os de la mâchoire. Le choix de cette méthode découle de plusieurs facteurs, notamment la faisabilité, la pertinence et la précision. Une telle approche permet une analyse quantitative détaillée, fournissant des informations précieuses sur les processus biologiques sous-jacents au mouvement des dents orthodontiques et facilitant le développement de stratégies de traitement orthodontique améliorées à l’avenir.

Protocole

Toutes les procédures ont été strictement respectées dans le respect des normes éthiques établies par le Comité d’éthique de l’Universidade Federal de Minas Gerais (n° 166/2022). Avant chaque expérience, un calcul de la taille de l’échantillon est obligatoire. Utilisez des souris mâles de type sauvage C57BL6/J âgées de 8 à 10 semaines pesant environ 20 à 30 g. Les souris doivent être logées dans une cage à l’intérieur d’une pièce maintenue à 25 °C, en respectant un cycle de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité. Après la fixation de la bobine, l’animal doit être nourri avec un régime doux. La surveillance quotidienne doit inclure des évaluations du poids corporel et de la santé globale.

1. Remodelage osseux alvéolaire induit mécaniquement

1. À l’aide d’une pince à coupe distale, coupez le ressort hélicoïdal ouvert NiTi de 0,25 x 0,76 pouce aux dimensions suivantes de six boucles et deux extrémités en forme de boucle positionnées perpendiculairement au ressort à l’aide d’une pince orthodontique Weingart.
2. Façonnez le fil rond en chrome-nickel (CrNi) de 0,20 mm de diamètre dans la configuration souhaitée avec des extrémités en forme de boucle à l’aide d’une pince à épiler Mathieu et d’un instrument de forme ronde comme référence de taille.
3. Assemblez les extrémités en forme de boucle de la bobine et le fil CrNi rond de 0,20 mm.
4. Anesthésier l’animal par une injection intrapéritonéale de 0,2 mL de solution contenant de la xylazine (10 mg/Kg) et de la kétamine (100 mg/Kg). Avant de commencer la procédure, évaluez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de la pédale. Pincez soigneusement l’un des orteils de l’animal à l’aide d’une pince à épiler. L’absence de réflexe indique un plan adéquat d’anesthésie générale. Pour éviter les blessures à la cornée et les douleurs postopératoires, appliquez un lubrifiant oculaire après l’anesthésie de l’animal.
5. Placez l’animal en décubitus dorsal sur une table chirurgicale, en immobilisant ses membres pour restreindre les mouvements et permettre l’accès intra-oral.
6. Utilisez un ouvre-bouche, fabriqué à partir d’un fil de 0,50 mm de diamètre et fixé avec un fil de 0,08 mm, pour faciliter une visualisation complète tout en empêchant le mouvement de la tête. Utilisez le côté droit comme côté expérimental (côté OTM) et le côté gauche comme témoin sans bobine orthodontique (côté contrôle).
   REMARQUE : Une meilleure visualisation des structures intrabuccales doit être obtenue à l’aide d’un stéréomicroscope et d’un système de lumière optique.
7. Nettoyez et mordancez les premières molaires et incisives droites à l’aide d’acétone et d’un apprêt automordançant, respectivement. Le système est auto-mordançant, ce qui signifie qu’il ne nécessite pas de conditionnement acide préalable.
   1. Appliquez l’apprêt en une seule étape, qui fonctionne également à la fois comme un acide et un adhésif. À l’aide d’un micropinceau, prélevez une petite quantité d’apprêt automordançant et appliquez-la sur la surface occlusale de la première molaire supérieure et des incisives. Il faut veiller à ce que l’apprêt automordançant n’atteigne pas la surface proximale entre la première et la deuxième molaire, car cela pourrait entraîner le collage des éléments dentaires, empêchant ainsi le mouvement des dents. Photopolymériser l’apprêt à la surface occlusale des molaires et des incisives pendant 30 s.
8. Collez l’extrémité distale d’un ressort hélicoïdal ouvert NiTi à six boucles sur la surface occlusale de la première molaire maxillaire droite avec de la résine photopolymérisable et photopolymérisez pendant 30 s. Ajoutez un incrément de résine supplémentaire sur le bord du fil pour éviter d’endommager les souris et photopolymérisez pendant 30 s.
9. Activez l’antenne à l’aide d’un appareil spécialement conçu composé d’un rail et d’un mécanisme à manivelle fixés à la table chirurgicale. Cela permet au mouvement longitudinal de glisser d’avant en arrière.
10. Connectez l’extrémité libre en forme de boucle du fil rond de 0,20 mm au crochet du tensiomètre.
11. Lors de l’activation de la manivelle, déplacez la table chirurgicale le long du rail jusqu’à ce que le dynamomètre enregistre une force de 0,35 N.
12. Collez le fil rond de 0,20 mm aux deux incisives supérieures pour ancrer la bobine. Aucune autre réactivation n’est effectuée pendant la période d’expérimentation. Coupez le fil pour détacher l’animal du dynamomètre.  Ajoutez un autre incrément de résine pour que le bord métallique de l’appareil ne soit pas exposé et ne blesse pas l’animal. Photopolymérisation pendant 30 s. Démontez l’animal de la table.
13. La première molaire supérieure droite avec un dispositif imposant une force de 0,35 N dans la direction mésiale est constituée du côté expérimental. Utilisez le côté gauche du maxillaire (sans appareil orthodontique) comme commande ^4,16.
14. Maintenez cet appareil pendant une période de 12 jours sans qu’aucune activation ne soit nécessaire. N’utilisez aucun médicament antidouleur. Le mouvement orthodontique se produit par le biais d’un processus inflammatoire, et les médicaments analgésiques peuvent affecter négativement la cascade d’acide arachidonique, ce qui a un impact sur le taux de remodelage osseux et peut invalider les résultats.
15. Après la fin de la chirurgie, traitez les animaux avec une injection sous-cutanée de solution saline pour éviter la déshydratation pendant la période d’adaptation avec l’appareil. Gardez l’animal dans une cage individuelle chauffée jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli et ce n’est qu’après cette période qu’il place l’animal dans des cages collectives.
16. Euthanasier la souris le 12^ème jour par sédation avec injection intrapéritonéale d’une solution de 0,2 mL contenant de la xylazine (10 mg/Kg) et de la kétamine (100 mg/Kg) suivie d’une décapitation avec des ciseaux tranchants.

2. Mesures micro-CT

1. Prélevez l’os maxillaire avec des ciseaux tranchants coupant tous les tissus mous, l’os zygomatique dans le plan sagittal, et la suture fronto-nasale et la synchondrose sphéno-occipitale dans le plan coronal. Immerger l’os maxillaire dans du formol tamponné neutre à 10 % (pH = 7,4) pendant une période de fixation de 48 h. Après cette période, changez la solution de formaldéhyde en alcool à 70%.
2. Effectuez une micro-tomodensitométrie de l’os maxillaire avec les paramètres suivants pour les balayages haute résolution : taille de voxel isotrope de 9 à 18 μm, réglages de rayons X de 50 kV, filtre en aluminium de 0,5 mm et angle de rotation de 0,5°. Plus d’une mâchoire peut être ajustée pendant la scintigraphie microCT.
3. Reconstruire les images acquises à l’aide du programme de reconstruction par microtomographie indiqué par le fabricant de la microtomodensitométrie (microTDM) utilisée¹⁷.
4. Positionnez les images reconstruites à l’aide du programme d’inspection 3D indiqué par le fabricant de la microtomographie utilisée.
5. Quantifier l’OTM en mesurant la différence de distance linéaire entre la jonction ciment-émail (CEJ) de la première et de la deuxième molaire de l’hémi-maxillaire droit (côté OTM) par rapport à l’hémi-maxillaire gauche (côté contrôle). Utilisez le logiciel d’analyse microCT approprié avec l’outil de ligne pour cette mesure 17,18,19,20.
6. Vérifiez que les échantillons ne présentent pas de résorption radiculaire inflammatoire induite par l’orthodontie (OIIRR). Sélectionnez la région d’intérêt (ROI) de la racine disto-vestibulaire de la première molaire maxillaire à l’aide d’une méthode de contournage manuelle de la région d’intérêt anatomique irrégulière. Mesurez les paramètres suivants : densité minérale racinaire (RMD ; g/cm³) et pourcentage du volume racinaire par volume total (RV/TV ; %). Utilisez le logiciel d’analyse microCT approprié avec l’outil volumétrique 3D pour cette mesure ^16,21.
7. Effectuer la reconstruction de la première molaire maxillaire à l’aide du logiciel Mimics et analyser les données obtenues pour tirer des conclusions concernant l’OTM et l’OIIRR dans le modèle expérimental^16,21.

Résultats

Ce protocole permet d’étudier un modèle de souris OTM à l’aide d’un ressort hélicoïdal NiTi. Avec une force de 0,35 N appliquée, la distance CEJ moyenne du côté du contrôle entre la première et la deuxième molaire était de 243,69 μm (figure 1A, ligne A), tandis que du côté OTM était mesurée à 284,66 μm (figure 1A, ligne B). La différence entre l’OTM et le côté témoin était de 40,97 μm (figure 1B

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole standardisé conçu pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents au remodelage osseux au cours de l’OTM. Une compréhension approfondie de ces mécanismes chez la souris nécessite un protocole méticuleusement planifié pour garantir l’exactitude et la fiabilité ^7,11. Des études menées par notre groupe de recherche ont montré que ce protocole réduit efficacement la variabilité de l’opérat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A