Untersuchung der kieferorthopädischen Zahnbewegung bei Mäusen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM) vor, das als geeignetes Modell dient, um die Mechanismen der Knochenanpassung, der Wurzelresorption und der Reaktion von Knochenzellen auf mechanische Reize zu untersuchen. Dieser umfassende Leitfaden bietet detaillierte Informationen über das OTM-Modell, die Mikrocomputertomographie-Erfassung und die anschließende Analyse.

Zusammenfassung

Die kieferorthopädische Zahnbewegung (OTM) stellt einen dynamischen Prozess dar, bei dem der Alveolarknochen an den Kompressionsstellen resorbiert und an den Zugstellen abgelagert wird, orchestriert von Osteoklasten bzw. Osteoblasten. Dieser Mechanismus dient als wertvolles Modell für die Untersuchung verschiedener Aspekte der Knochenanpassung, einschließlich der Wurzelresorption und der zellulären Reaktion auf mechanische Kraftreize. Das hier skizzierte Protokoll bietet einen einfachen Ansatz zur Untersuchung von OTM, indem es 0,35 N als optimale Kraft in einem Mausmodell mit einer Nickel-Titan (NiTi)-Schraubenfeder festlegt. Mit Hilfe der Mikro-Computertomographie-Analyse haben wir die OTM quantifiziert, indem wir die Diskrepanz im linearen Abstand an der Zement-Schmelz-Verbindung bewertet haben. Die Bewertung umfasste auch eine Analyse der kieferorthopädisch induzierten entzündlichen Wurzelresorption, wobei Parameter wie die Wurzelmineraldichte und der prozentuale Anteil des Wurzelvolumens am Gesamtvolumen bewertet wurden. Dieses umfassende Protokoll trägt dazu bei, unser Verständnis von Knochenumbauprozessen zu verbessern und die Fähigkeit zur Entwicklung effektiver kieferorthopädischer Behandlungsstrategien zu verbessern.

Einleitung

Der Knochenumbau ist ein fortlaufender Prozess, der von Osteoklasten, Osteoblasten, Knochenschleimhautzellen und Osteozyten orchestriert wird und für die Aufrechterhaltung der Integrität des adulten Skeletts unerlässlich ist ^1,2. Dieser dynamische Prozess, der in erster Linie durch die Differenzierung und Aktivität von Osteoklasten und Osteoblasten angetrieben wird, beinhaltet die Resorption und Ablagerung von Knochen, ausgelöst durch mechanische Belastung und Belastung ^3,4,5.

Tierversuche spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung der komplizierten biologischen und zellulären Mechanismen, die der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM) zugrunde ^liegen6,7. An diesem Prozess ist eine Vielzahl von Zelltypen beteiligt, wie z. B. Osteoblasten, Osteoklasten, Osteozyten, Fibroblasten und Immunzellen wie Makrophagen und T-Zellen, die sich im Kieferknochen und im Parodontalband befinden ^7,8. Diese Zellen reagieren dynamisch auf mechanische Reize und Veränderungen des lokalen Milieus und beeinflussen so die Zusammensetzung und Architektur des umgebenden Knochens ^7,8. Darüber hinaus lösen sie auch auf zellulärer Ebene eine Entzündungsreaktion aus, obwohl keine Krankheitserreger vorhanden sind. Diese Entzündungsreaktion spielt eine Rolle bei der Erhöhung des Umsatzes von Knochengewebe⁹.

Verschiedene Tiermodelle, darunter Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hunde und Affen, wurden in experimentellen Studien mit OTM^{verwendet 7,8,10}. Unter diesen werden Nagetiere, insbesondere Mäuse, bevorzugt, um die Anfangsphasen der Zahnbewegung und des Knochenumbaus zu untersuchen⁶. Frühere Forschungen haben die Vorteile der Verwendung von Mausmodellen gegenüber Rattenmodellen hervorgehoben, vor allem aufgrund der weit verbreiteten Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen, die eine detaillierte Untersuchung der genetischen Einflüsse in OTM ermöglichen ^7,11. Derzeit werden zwei Hauptmodelle eingesetzt, um Zahnbewegungen bei Mäusen zu induzieren. Das erste Verfahren besteht darin, eine Schraubenfeder aus Nickel-Titan (NiTi) zwischen dem ersten oberen Backenzahn und den oberen Schneidezähnen ^4,12 einzusetzen. Der zweite Ansatz besteht darin, ein elastisches Band innerhalb des Zahnzwischenraums zwischen dem ersten und dem zweiten oberen Molaren¹³ zu platzieren. Zu den primären analysierten Endpunkten gehören in der Regel das Ausmaß der Zahnbewegung und die Mikroarchitektur des Knochens, die vorzugsweise mit Hilfe von Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) bewertet ^werden14. Im Idealfall ist die Beurteilung der Integrität der Zahnwurzeln wichtig, um sicherzustellen, dass geeignete Kräfte zur Herstellung von OT^M4 eingesetzt werden.

Während die Mikro-CT weithin als Goldstandard für die Bewertung der Mikroarchitektur mineralisierter Gewebe anerkannt ist¹⁴, stellt das Fehlen standardisierter Methoden und Protokolle für das Scannen, Analysieren und Melden von Daten oft eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, die genauen Verfahren zu erkennen, die Ergebnisse zu interpretieren und Vergleiche zwischen verschiedenen OTM-Modellen zu erleichtern^14,15.

Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das OTM-Mausmodell, einschließlich Mikro-CT-Erfassung und Analyse von OTM, Knochenmikrostruktur und Zahnwurzeln. Bei dieser Methode wird eine kontrollierte mechanische Kraft auf den ersten Backenzahn ausgeübt, um eine Bewegung im Kieferknochen zu induzieren. Die Auswahl dieser Methode ergibt sich aus mehreren Faktoren, darunter Machbarkeit, Relevanz und Präzision. Ein solcher Ansatz ermöglicht eine detaillierte quantitative Analyse, die wertvolle Einblicke in die biologischen Prozesse liefert, die der kieferorthopädischen Zahnbewegung zugrunde liegen, und die Entwicklung verbesserter kieferorthopädischer Behandlungsstrategien in der Zukunft erleichtert.

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Protokoll

Alle Verfahren halten sich strikt an die ethischen Standards, die von der Ethikkommission der Universidade Federal de Minas Gerais (Nr. 166/2022) festgelegt wurden. Vor jedem Versuch ist eine Berechnung der Stichprobengröße obligatorisch. Verwenden Sie 8-10 Wochen alte männliche C57BL6/J-Wildtyp-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 20-30 g. Die Mäuse müssen in einem Käfig in einem Raum gehalten werden, der bei 25 °C gehalten wird und einem Zyklus von 12 h Licht und 12 Stunden Dunkelheit entspricht. Nach dem Anbringen der Spirale sollte das Tier mit einer weichen Fütterung gefüttert werden. Die tägliche Überwachung sollte die Beurteilung des Körpergewichts und des allgemeinen Gesundheitszustands umfassen.

1. Mechanisch induzierter Umbau des Alveolarknochens

1. Schneiden Sie mit einer distalen Schnittzange die 0,25 x 0,76 Zoll große NiTi-Feder mit offener Spirale mit einer kieferorthopädischen Weingart-Zange auf die folgenden Abmessungen von sechs Schlaufen und zwei schlaufenförmigen Enden, die senkrecht zur Feder positioniert sind.
2. Formen Sie den runden Chrom-Nickel (CrNi)-Draht mit einem Durchmesser von 0,20 mm in die gewünschte Konfiguration mit schlaufenförmigen Enden, indem Sie eine Mathieu-Pinzette und ein rundes Instrument als Größenreferenz verwenden.
3. Setzen Sie die schlaufenförmigen Enden der Spule und den 0,20 mm runden CrNi-Draht zusammen.
4. Betäuben Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von 0,2 ml Lösung, die Xylazin (10 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) enthält. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, beurteilen Sie die Narkosetiefe mit dem Pedalreflex. Kneifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette in einen der Zehen des Tieres. Das Fehlen eines Reflexes deutet auf eine adäquate Ebene der Vollnarkose hin. Um Hornhautverletzungen und postoperative Schmerzen zu vermeiden, tragen Sie nach der Betäubung des Tieres ein Augengleitmittel auf.
5. Positionieren Sie das Tier im dorsalen Dekubitus auf einem Operationstisch und fixieren Sie seine Gliedmaßen, um die Bewegung einzuschränken und einen intraoralen Zugang zu ermöglichen.
6. Verwenden Sie einen Mundöffner, der aus einem Draht mit einem Durchmesser von 0,50 mm gefertigt und mit einem Draht von 0,08 mm gesichert ist, um eine vollständige Visualisierung zu erleichtern und gleichzeitig Kopfbewegungen zu verhindern. Verwenden Sie die rechte Seite als experimentelle Seite (OTM-Seite) und die linke Seite als Kontrolle ohne kieferorthopädische Spule (Kontrollseite).
   HINWEIS: Eine verbesserte Visualisierung intraoraler Strukturen muss mit einem Stereomikroskop und einem optischen Lichtsystem erreicht werden.
7. Reinigen und ätzen Sie die rechten ersten Molaren- und Schneidezahnoberflächen mit Aceton bzw. einer selbstätzenden Grundierung. Das System ist selbstätzend, was bedeutet, dass es keine vorherige Säurekonditionierung erfordert.
   1. Tragen Sie in einem Arbeitsgang die Grundierung auf, die gleichzeitig als Säure und Klebstoff fungiert. Sammeln Sie mit einer Mikrobürste eine kleine Menge selbstätzende Grundierung und tragen Sie sie auf die Kaufläche des oberen ersten Backenzahns und der Schneidezähne auf. Bei diesem Schritt muss darauf geachtet werden, dass der selbstätzende Primer nicht die proximale Oberfläche zwischen dem ersten und zweiten Molaren erreicht, da dies dazu führen kann, dass die Zahnelemente zusammenkleben und die Zahnbewegung verhindert wird. Die Lichthärtung des Primers an der Kaufläche der Backenzähne und Schneidezähne für 30 s aus.
8. Kleben Sie das distale Ende einer NiTi-Feder mit offener Spirale mit sechs Schleifen auf die Kaufläche des rechten ersten Oberkiefermolaren mit lichthärtendem Harz und lichthärten Sie 30 s lang. Fügen Sie zusätzliches Harzinkrement an der Kante des Drahtes hinzu, um Schäden an den Mäusen zu vermeiden, und härten Sie 30 s lang aus.
9. Aktivieren Sie die Spule mit einer speziell entwickelten Vorrichtung, die aus einer Schiene und einem Kurbelmechanismus besteht, die am Operationstisch befestigt sind. Dadurch kann die Längsbewegung hin und her gleiten.
10. Verbinden Sie das freie, schlaufenförmige Ende des 0,20 mm Runddrahtes mit dem Haken des Zugkraftmessers.
11. Bewegen Sie den Operationstisch nach Betätigung der Kurbel entlang der Schiene, bis der Prüfstand eine Kraft von 0,35 N registriert.
12. Kleben Sie den 0,20 mm Runddraht an die beiden oberen Schneidezähne, um die Spule zu verankern. Während des Versuchszeitraums wird keine weitere Reaktivierung durchgeführt. Schneiden Sie den Draht ab, um das Tier vom Prüfstand zu lösen.  Fügen Sie eine weitere Stufe Harz hinzu, damit die Metallkante des Geräts nicht freiliegt und das Tier nicht verletzt wird. Lichthärtung für 30 s. Zerlegen Sie das Tier vom Tisch.
13. Der obere rechte erste Molaren mit einer Vorrichtung, die eine Kraft von 0,35 N in mesialer Richtung aufbringt, besteht aus der experimentellen Seite. Verwenden Sie die linke Seite des Oberkiefers (ohne kieferorthopädische Apparatur) als Kontrolle ^4,16.
14. Warten Sie dieses Gerät für einen Zeitraum von 12 Tagen, ohne dass eine Aktivierung erforderlich ist. Nehmen Sie keine Schmerzmittel ein. Kieferorthopädische Bewegungen erfolgen durch einen entzündlichen Prozess, und schmerzlindernde Medikamente können die Arachidonsäurekaskade negativ beeinflussen, was sich auf die Geschwindigkeit des Knochenumbaus auswirkt und möglicherweise die Ergebnisse ungültig macht.
15. Behandeln Sie die Tiere nach Beendigung der Operation mit einer subkutanen Injektion von Kochsalzlösung, um eine Dehydrierung während der Anpassungsphase mit dem Gerät zu vermeiden. Halten Sie das Tier in einem Einzelkäfig mit Heizung, bis es vollständig genesen ist, und setzen Sie das Tier erst nach dieser Zeit in Sammelkäfige.
16. Euthanasieren Sie die Maus am 12^. Tag durch Sedierung mit intraperitonealer Injektion einer 0,2 ml Lösung, die Xylazin (10 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) enthält, gefolgt von einer Enthauptung mit einer scharfen Schere.

2. Mikro-CT-Messungen

1. Entnehmen Sie den Oberkieferknochen mit einer scharfen Schere, die das gesamte Weichgewebe durchtrennt, den Jochbein in der Sagittalebene sowie die frontonasale Naht und die spheno-okzipitale Synchondrose in der koronalen Ebene. Tauchen Sie den Oberkieferknochen für eine Fixierzeit von 48 h in 10% neutrales gepuffertes Formalin (pH=7,4). Wechseln Sie nach dieser Zeit die Formaldehydlösung zu 70% igem Alkohol.
2. Führen Sie eine Mikro-CT-Untersuchung des Oberkieferknochens mit den folgenden Parametern für hochauflösende Scans durch: isotrope Voxelgröße von 9 bis 18 μm, Röntgeneinstellungen von 50 kV, 0,5 mm Aluminiumfilter und Drehwinkel von 0,5°. Während der microCT-Untersuchung kann mehr als ein Kiefer angepasst werden.
3. Rekonstruieren Sie die aufgenommenen Bilder mit dem Mikrotomographie-Rekonstruktionsprogramm, das vom Hersteller der verwendeten Mikrocomputertomographie (microCT) angegeben wurde¹⁷.
4. Positionieren Sie die rekonstruierten Bilder mit dem 3D-Inspektionsprogramm, das vom Hersteller der verwendeten Mikrotomographie angegeben wird.
5. Quantifizieren Sie die OTM, indem Sie die Differenz im linearen Abstand zwischen dem Zement-Schmelz-Übergang (CEJ) des ersten und zweiten Molaren des rechten Hemi-Maxilla (OTM-Seite) relativ zur linken Hemi-Maxilla (Kontrollseite) messen. Verwenden Sie die richtige microCT-Analysatorsoftware mit dem Linienwerkzeug für diese Messung 17,18,19,20.
6. Überprüfen Sie die Proben auf das Vorhandensein einer kieferorthopädisch induzierten entzündlichen Wurzelresorption (OIIRR). Wählen Sie die Region of Interest (ROI) der disto-vestibulären Wurzel des ersten Oberkiefermolaren aus, indem Sie eine unregelmäßige, anatomische Region of Interest verwenden, die manuell gezeichnet wird. Messen Sie die folgenden Parameter: Wurzelmineraldichte (RMD; g/cm³) und prozentualer Anteil des Wurzelvolumens pro Gesamtvolumen (RV/TV; %). Verwenden Sie für diese Messung die richtige microCT-Analysatorsoftware mit dem volumetrischen 3D-Tool^16,21.
7. Führen Sie die Rekonstruktion des ersten Oberkiefermolaren mit der Mimics-Software durch und analysieren Sie die erhaltenen Daten, um Rückschlüsse auf OTM und OIIRR im experimentellen Modell^{zu ziehen 16,21}.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung eines OTM-Mausmodells mit einer NiTi-Schraubenfeder. Bei einer Kraft von 0,35 N betrug der mittlere CEJ-Abstand auf der Kontrollseite zwischen dem ersten und zweiten Molaren 243,69 μm (Abbildung 1A, Zeile A), während er auf der OTM-Seite bei 284,66 μm gemessen wurde (Abbildung 1A, Zeile B). Die Differenz zwischen der OTM- und der Kontrollseite betrug 40,97 μm (Abbildung 1B).<...

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Diskussion

Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll, das entwickelt wurde, um die zellulären und molekularen Mechanismen aufzuklären, die dem Knochenumbau während der OTM zugrunde liegen. Ein gründliches Verständnis dieser Mechanismen bei Mäusen erfordert ein akribisch geplantes Protokoll, um Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu gewährleisten ^7,11. Studien, die von unserer Forschungsgruppe durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass dieses Protokoll die Varia...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A