חקר תנועת שיניים אורתודונטית בעכברים

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקר תנועת שיניים אורתודונטית (OTM), המשמש מודל מתאים לחקר מנגנוני הסתגלות העצם, ספיגת שורשים ותגובת תאי עצם לגירויים מכניים. מדריך מקיף זה מספק מידע מפורט על מודל OTM, רכישת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת וניתוח עוקב.

Abstract

תנועת שיניים אורתודונטית (OTM) מייצגת תהליך דינמי שבו עצם הנאדית עוברת ספיגה באתרי דחיסה ושקיעה באתרי מתח, בתיאום אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים, בהתאמה. מנגנון זה משמש מודל רב ערך לחקר היבטים שונים של הסתגלות עצם, כולל ספיגת שורשים והתגובה התאית לגירויי כוח מכניים. הפרוטוקול המתואר כאן מציע גישה פשוטה לחקר OTM, וקובע 0.35 N ככוח האופטימלי במודל עכבר המשתמש בקפיץ סליל ניקל-טיטניום (NiTi). באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת, כימתנו OTM על ידי הערכת הפער במרחק הליניארי בצומת צמנט-אמייל. ההערכה כללה גם ניתוח של ספיגת שורשים דלקתית הנגרמת על ידי אורתודונטיה, הערכת פרמטרים כגון צפיפות מינרלים בשורש ואחוז נפח השורש לנפח כולל. פרוטוקול מקיף זה תורם לקידום ההבנה שלנו של תהליכי עיצוב מחדש של העצם ולשיפור היכולת לפתח אסטרטגיות טיפול אורתודונטיות יעילות.

Introduction

עיצוב מחדש של העצם הוא תהליך מתמשך המתוזמר על ידי אוסטאוקלסטים, אוסטאובלסטים, תאי רירית עצם ואוסטיאוציטים, החיוני לשמירה על שלמות השלד הבוגר ^1,2. מונע בעיקר על ידי התמיינות ופעילות של אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים, תהליך דינמי זה כולל ספיגה מחדש ושקיעה של עצם, המופעלת על ידי לחץ מכני ועומס ^3,4,5.

ניסויים בבעלי חיים ממלאים תפקיד מרכזי בהבהרת המנגנונים הביולוגיים והתאיים המורכבים העומדים בבסיס תנועת שיניים אורתודונטית (OTM)^6,7. תהליך זה מערב מגוון רחב של סוגי תאים, כגון אוסטאובלסטים, אוסטאוקלסטים, אוסטיאוציטים, פיברובלסטים ותאי חיסון כמו מקרופאגים ותאי T, הממוקמים בתוך עצם הלסת ורצועת החניכיים ^7,8. תאים אלה מגיבים באופן דינמי לגירויים מכניים ולשינויים בסביבה המקומית, ומשפיעים על ההרכב והארכיטקטורה של^העצם הסובבת ^7,8. יתר על כן, הם גם מעוררים תגובה דלקתית ברמה התאית, למרות שאין פתוגנים נוכחים. תגובה דלקתית זו ממלאת תפקיד בהגדלת התחלופה של רקמת עצם⁹.

מודלים שונים של בעלי חיים, כולל עכברים, חולדות, ארנבות, כלבים וקופים, שימשו במחקרים ניסיוניים של OTM ^7,8,10. בין אלה, מכרסמים, בעיקר עכברים, מועדפים לחקר השלבים הראשונים של תנועת השיניים ועיצוב העצם⁶. מחקרים קודמים הדגישו את היתרונות של שימוש במודלים של עכברים על פני מודלים של חולדות, בעיקר בשל הזמינות הרחבה של זנים מהונדסים גנטית, המאפשרים חקירה מפורטת של השפעות גנטיות ב- OTM ^7,11. כיום, שני מודלים עיקריים משמשים כדי לגרום לתנועת שיניים בעכברים. השיטה הראשונה כוללת החדרת קפיץ סליל ניקל-טיטניום (NiTi) בין הטוחנת העליונה הראשונה לבין החותכות העליונות ^4,12. הגישה השנייה כוללת הצבת רצועה אלסטית בתוך החלל הבין-דנטלי בין הטוחנות העליונות הראשונה והשנייה¹³. התוצאות העיקריות המנותחות כוללות בדרך כלל את גודל תנועת השן ואת מיקרו-ארכיטקטורת העצם, רצוי להעריך באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT)¹⁴. באופן אידיאלי, הערכת שלמות שורשי השיניים חשובה כדי להבטיח שהכוחות המתאימים מופעלים כדי לייצר OT^M4.

בעוד שמיקרו-CT מוכר באופן נרחב כתקן הזהב להערכת המיקרו-ארכיטקטורה של רקמות מינרליות¹⁴, היעדר מתודולוגיות ופרוטוקולים סטנדרטיים לסריקה, ניתוח ודיווח נתונים מציב לעתים קרובות אתגרים בהבחנה בין ההליכים המדויקים הננקטים, פירוש התוצאות והקלה על השוואות בין מודלים שונים של OTM ^14,15.

כאן, אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב למודל העכבר OTM, כולל רכישה וניתוח של מיקרו-CT של OTM, מיקרו-מבנה עצם ושורשי שיניים. שיטה זו כרוכה בהפעלת כוח מכני מבוקר על הטוחנת הראשונה כדי לגרום לתנועה בתוך עצם הלסת. הבחירה בשיטה זו נובעת ממספר גורמים, ביניהם היתכנות, רלוונטיות ודיוק. גישה כזו מאפשרת ניתוח כמותי מפורט, המספק תובנות חשובות על התהליכים הביולוגיים העומדים בבסיס תנועת שיניים אורתודונטית ומקל על פיתוח אסטרטגיות טיפול אורתודונטיות משופרות בעתיד.

Protocol

כל הנהלים דבקו בקפדנות בסטנדרטים האתיים שנקבעו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הפדרלית של מינאס ז'ראיס (מס '166/2022). לפני כל ניסוי, חישוב גודל מדגם הוא חובה. יש להשתמש בעכברי בר זכרים בני 8-10 שבועות מסוג C57BL6/J במשקל של כ-20-30 גרם. יש לשכן את העכברים בכלוב בתוך חדר המתוחזק בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, תוך הקפדה על מחזור אור של 12 שעות / 12 שעות חושך. בעקבות חיבור סליל, החיה צריכה להיות מוזנת עם דיאטה רכה. ניטור יומי צריך לכלול הערכות של משקל הגוף והבריאות הכללית.

1. שיפוץ עצם מכתשית המושרה מכנית

1. באמצעות צבת חיתוך דיסטלית, חתכו את קפיץ הסליל הפתוח NiTi בגודל 0.25 x 0.76 אינץ' לממדים הבאים של שש לולאות ושני קצוות בצורת לולאה הממוקמים בניצב לקפיץ באמצעות צבת ויינגרט אורתודונטית.
2. עצבו את חוט הכרום-ניקל העגול בקוטר 0.20 מ"מ (CrNi) לתצורה הרצויה עם קצוות בצורת לולאה באמצעות פינצטה Mathieu ומכשיר בצורת עגול כהתייחסות לגודל.
3. חבר את הקצוות בצורת לולאה של הסליל ואת חוט CrNi עגול בקוטר 0.20 מ"מ.
4. להרדים את בעל החיים עם הזרקה intraperitoneal של 0.2 מ"ל של פתרון המכיל xylazine (10 מ"ג / ק"ג) וקטמין (100 מ"ג / ק"ג). לפני תחילת ההליך, להעריך את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס הדוושה. צבטו בזהירות את אחת מאצבעות הרגליים של החיה באמצעות פינצטה. היעדר רפלקס מצביע על מישור נאות של הרדמה כללית. כדי למנוע פציעות בקרנית וכאבים לאחר הניתוח, להחיל חומר סיכה עיני לאחר החיה מורדמת.
5. מקם את בעל החיים בדקוביטוס גבי על שולחן ניתוחים, משתק את גפיו כדי להגביל את התנועה ולאפשר גישה תוך אוראלית.
6. השתמש בפותחן פה, מעוצב מחוט בקוטר 0.50 מ"מ ומאובטח בחוט 0.08 מ"מ, כדי להקל על הדמיה מלאה תוך מניעת תנועת ראש. השתמש בצד ימין כצד הניסוי (צד OTM) ובצד שמאל כבקרה ללא סליל אורתודונטי (צד בקרה).
   הערה: הדמיה משופרת של מבנים אינטרה-אוראליים חייבת להתבצע באמצעות סטריאומיקרוסקופ ומערכת אור אופטית.
7. נקו וחרטו את הטוחנת הראשונה הימנית ואת המשטחים החותכים באמצעות אצטון ופריימר לחריטה עצמית, בהתאמה. המערכת היא תחריט עצמי, כלומר היא אינה דורשת התניה חומצית מוקדמת.
   1. מרחו את הפריימר בצעד אחד, שמתפקד בו זמנית גם כחומצה וכדבק. בעזרת מיקרו-מברשת, אספו כמות קטנה של פריימר לחריטה עצמית ומרחו אותו על המשטח הנסתר של הטוחנת הראשונה העליונה והחותכות. יש להקפיד בשלב זה על מנת להבטיח כי פריימר החריטה העצמית לא יגיע למשטח הפרוקסימלי בין הטוחנות הראשונה והשנייה, שכן הדבר עלול לגרום לאלמנטים הדנטליים להידבק זה לזה ולמנוע תזוזת שיניים. אור לרפא את הפריימר על פני השטח הסתומים של הטוחנות והחותכות במשך 30 שניות.
8. חברו את הקצה הדיסטלי של קפיץ סליל NiTi בעל שש לולאה אל פני השטח הנסתרים של הטוחנת המקסילרית הראשונה הימנית עם שרף שנרפא באור וריפוי קל למשך 30 שניות. הוסף תוספת שרף נוספת לקצה החוט כדי למנוע נזק לעכברים וריפוי קל למשך 30 שניות.
9. הפעל את הסליל באמצעות מכשיר שתוכנן במיוחד המורכב ממנגנון מסילה וארכובה המחובר לשולחן הניתוחים. זה מאפשר תנועה אורכית להחליק קדימה ואחורה.
10. חבר את הקצה החופשי בצורת לולאה של החוט העגול בקוטר 0.20 מ"מ לוו של מד המתח.
11. עם הפעלת הארכובה, הזיזו את שולחן הניתוחים לאורך המסילה עד שהדינמומטר ירשום כוח של 0.35 N.
12. חברו את החוט העגול בקוטר 0.20 מ"מ לשתי החותכות העליונות כדי לעגן את הסליל. לא מתבצעת הפעלה מחדש נוספת במהלך תקופת הניסוי. חותכים את החוט כדי לנתק את החיה מהדינמומטר.  הוסף תוספת נוספת של שרף כך שקצה המתכת של המכשיר לא ייחשף ולא יפגע בחיה. תרופה קלה ל -30 שניות. לפרק את החיה מהשולחן.
13. הטוחנת הראשונה הימנית העליונה עם מכשיר המטיל כוח של 0.35 N בכיוון המזיאלי מורכבת מהצד הניסיוני. השתמש בצד שמאל של המקסילה (ללא מכשיר אורתודונטי) כבקרה ^4,16.
14. שמור על התקן זה לתקופה של 12 יום ללא צורך בהפעלה. אין להשתמש בתרופות למניעת כאב. תנועה אורתודונטית מתרחשת בתהליך דלקתי, ותרופות לשיכוך כאבים עלולות להשפיע לרעה על מפל החומצה הארכידונית, להשפיע על קצב עיצוב העצם מחדש ולפסול את התוצאות.
15. לאחר סיום הניתוח, יש לטפל בבעלי החיים בהזרקה תת עורית של תמיסת מלח כדי למנוע התייבשות במהלך תקופת ההסתגלות עם המכשיר. החזיקו את בעל החיים בכלוב בודד עם חימום עד שהוא מתאושש לחלוטין ורק לאחר תקופה זו הכניסו את החיה לכלובים קולקטיביים.
16. הרדימו את העכבר ביום^ה-12 המבוצע על ידי טשטוש עם הזרקה תוך צפקית של תמיסת 0.2 מ"ל המכילה קסילזין (10 מ"ג/ק"ג) וקטמין (100 מ"ג/ק"ג) ולאחר מכן עריפת ראשים במספריים חדים.

2. מדידות מיקרו-CT

1. קצרו את העצם המקסילרית עם מספריים חדים חותכים את כל הרקמה הרכה, את העצם הזיגומטית במישור הסגיטלי, ואת התפר הקדמי ואת סינכונדרוזיס ספנו-אוקסיפיטלי במישור העטרה. יש לטבול את העצם המקסילרית בפורמלין חוצץ ניטרלי 10% (pH=7.4) למשך תקופת קיבוע של 48 שעות. לאחר תקופה זו, לשנות את תמיסת פורמלין ל 70% אלכוהול.
2. בצע סריקת micro-CT של העצם המקסילרית עם הפרמטרים הבאים עבור סריקות ברזולוציה גבוהה: גודל ווקסל איזוטרופי של 9 עד 18 מיקרומטר, הגדרות רנטגן של 50 קילו וולט, מסנן אלומיניום 0.5 מ"מ וזווית סיבוב של 0.5°. ניתן להתאים יותר מלסת אחת במהלך סריקת microCT.
3. לשחזר את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנית שחזור מיקרוטומוגרפיה שצוין על ידי היצרן של טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת (microCT) בשימוש¹⁷.
4. מקם את התמונות המשוחזרות באמצעות תוכנית הבדיקה 3D שצוין על ידי היצרן של מיקרוטומוגרפיה בשימוש.
5. כימות OTM על ידי מדידת ההבדל במרחק ליניארי בין צומת צמנט-אמייל (CEJ) של הטוחנות הראשונה והשנייה של ההמי-מקסילה הימנית (צד OTM) ביחס להמי-מקסילה השמאלית (צד הבקרה). השתמש בתוכנת ניתוח microCT המתאימה עם כלי הקו למדידה זו 17,18,19,20.
6. בדוק את הדגימות עבור נוכחות של ספיגת שורש דלקתית הנגרמת על ידי יישור שיניים (OIIRR). בחר את אזור העניין (ROI) של השורש הדיסטו-וסטיבולרי של הטוחנת המקסילרית הראשונה באמצעות אזור עניין אנטומי לא סדיר המשורטט בשיטת מתאר ידנית. מדוד את הפרמטרים הבאים: צפיפות מינרלים בשורש (RMD; גר'/ס"מ³) ואחוז נפח השורש לנפח כולל (RV/TV; %). השתמש בתוכנת ניתוח microCT המתאימה עם הכלי הנפחי התלת-ממדי למדידה זו^16,21.
7. בצע את השחזור של הטוחנת המקסילרית הראשונה באמצעות תוכנת Mimics ונתח את הנתונים שהתקבלו כדי להסיק מסקנות לגבי OTM ו- OIIRR במודל הניסוי^16,21.

תוצאות

פרוטוקול זה מאפשר לחקור מודל עכבר OTM באמצעות קפיץ סליל NiTi. עם כוח של 0.35 N שהופעל, המרחק הממוצע של CEJ בצד הבקרה בין הטוחנות הראשונה והשנייה היה 243.69 מיקרומטר (איור 1A, קו A), בעוד שבצד OTM נמדד ב 284.66 מיקרומטר (איור 1A, קו B). ההבדל בין צד ה-OTM לבין צד הבקרה היה 40.97 מיקרומטר ...

Discussion

כאן, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי שנועד להבהיר את המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס עיצוב מחדש של עצם במהלך OTM. הבנה מעמיקה של מנגנונים אלה בעכברים דורשת פרוטוקול מתוכנן בקפידה כדי להבטיח דיוק ואמינות ^7,11. מחקרים שנערכו על ידי קבוצת המחקר שלנו הראו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A