Estudio del movimiento dental ortodóncico en ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar el movimiento dental ortodóncico (OTM), que sirve como modelo adecuado para investigar los mecanismos de adaptación ósea, resorción radicular y la respuesta de las células óseas a estímulos mecánicos. Esta guía completa proporciona información detallada sobre el modelo OTM, la adquisición de microtomografías computarizadas y el análisis posterior.

Resumen

El movimiento dental ortodóncico (OTM) representa un proceso dinámico en el que el hueso alveolar sufre reabsorción en los sitios de compresión y deposición en los sitios de tensión, orquestados por osteoclastos y osteoblastos, respectivamente. Este mecanismo sirve como un modelo valioso para estudiar varios aspectos de la adaptación ósea, incluida la reabsorción radicular y la respuesta celular a los estímulos de fuerza mecánica. El protocolo descrito aquí ofrece un enfoque sencillo para investigar OTM, estableciendo 0,35 N como la fuerza óptima en un modelo de ratón que emplea un resorte helicoidal de níquel-titanio (NiTi). Utilizando el análisis de tomografía microcomputarizada, cuantificamos la OTM evaluando la discrepancia en la distancia lineal en la unión cemento-esmalte. La evaluación también incluyó un análisis de la reabsorción radicular inflamatoria inducida por la ortodoncia, evaluando parámetros como la densidad mineral de la raíz y el porcentaje de volumen radicular por volumen total. Este protocolo integral contribuye a avanzar en nuestra comprensión de los procesos de remodelación ósea y mejora la capacidad de desarrollar estrategias efectivas de tratamiento ortodóncico.

Introducción

El remodelado óseo es un proceso continuo orquestado por osteoclastos, osteoblastos, células de revestimiento óseo y osteocitos, esenciales para mantener la integridad del esqueleto adulto ^1,2. Impulsado principalmente por la diferenciación y actividad de osteoclastos y osteoblastos, este proceso dinámico implica la reabsorción y deposición de hueso, desencadenada por el estrés mecánico y la carga ^3,4,5.

Los experimentos con animales desempeñan un papel fundamental en la elucidación de los intrincados mecanismos biológicos y celulares que subyacen al movimiento dental ortodóncico (OTM)^6,7. Este proceso involucra una amplia gama de tipos de células, como osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, fibroblastos y células inmunitarias como macrófagos y células T, situadas dentro de la mandíbula y el ligamento periodontal ^7,8. Estas células responden dinámicamente a estímulos mecánicos y cambios en el medio local, influyendo en la composición y arquitectura del hueso circundante ^7,8. Además, también desencadenan una respuesta inflamatoria a nivel celular, aunque no haya patógenos presentes. Esta respuesta inflamatoria desempeña un papel en el aumento del recambio del tejido óseo⁹.

Se han utilizado varios modelos animales, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros y monos, en estudios experimentales de OTM ^7,8,10. Entre estos, los roedores, particularmente los ratones, son los preferidos para investigar las fases iniciales del movimiento dental y la remodelación ósea⁶. Investigaciones previas han enfatizado las ventajas del uso de modelos de ratón sobre modelos de rata, principalmente debido a la amplia disponibilidad de cepas genéticamente modificadas, lo que permite una exploración detallada de las influencias genéticas en OTM ^7,11. Actualmente, se emplean dos modelos principales para inducir el movimiento de los dientes en ratones. El primer método consiste en insertar un resorte helicoidal de níquel-titanio (NiTi) entre el primer molar superior y los incisivos superiores ^4,12. El segundo abordaje consiste en colocar una banda elástica dentro del espacio interdental entre el primer y el segundo molar superior¹³. Los resultados primarios analizados suelen incluir la magnitud del movimiento dental y la microarquitectura ósea, evaluada preferentemente mediante microtomografía computarizada (micro-TC)¹⁴. Idealmente, la evaluación de la integridad de las raíces dentales es importante para garantizar que se empleen las fuerzas adecuadas para producir OT^M4.

Si bien la micro-TC es ampliamente reconocida como el estándar de oro para evaluar la microarquitectura de los tejidos mineralizados¹⁴, la ausencia de metodologías y protocolos estandarizados para escanear, analizar y reportar datos a menudo presenta desafíos para discernir los procedimientos precisos empleados, interpretar los resultados y facilitar las comparaciones entre diferentes modelos de OTM^14,15.

Aquí, presentamos una guía paso a paso para el modelo de ratón OTM, incluida la adquisición de micro-CT y el análisis de OTM, microestructura ósea y raíces dentales. Este método consiste en aplicar una fuerza mecánica controlada al primer molar para inducir el movimiento dentro de la mandíbula. La selección de este método se deriva de varios factores, como la viabilidad, la relevancia y la precisión. Este enfoque permite un análisis cuantitativo detallado, proporcionando información valiosa sobre los procesos biológicos que subyacen al movimiento de los dientes ortodóncicos y facilitando el desarrollo de mejores estrategias de tratamiento ortodóncico en el futuro.

Protocolo

Todos los procedimientos se adhirieron estrictamente a las normas éticas establecidas por el Comité de Ética de la Universidad Federal de Minas Gerais (n.º 166/2022). Antes de cada experimento, es obligatorio calcular el tamaño de la muestra. Utilice ratones machos de tipo salvaje C57BL6/J de 8 a 10 semanas de edad con un peso aproximado de 20 a 30 g. Los ratones deben estar alojados en una jaula dentro de una habitación mantenida a 25 °C, siguiendo un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad. Después de la fijación de la bobina, el animal debe alimentarse con una dieta blanda. El control diario debe incluir evaluaciones del peso corporal y la salud general.

1. Remodelado óseo alveolar inducido mecánicamente

1. Usando alicates de corte distal, corte el resorte de bobina abierta NiTi de 0.25 x 0.76 pulgadas a las siguientes dimensiones de seis bucles y dos extremos en forma de bucle colocados perpendicularmente al resorte con alicates ortodónticos Weingart.
2. Dé la forma al alambre redondo de cromo-níquel (CrNi) de 0,20 mm de diámetro a la configuración deseada con extremos en forma de bucle utilizando pinzas Mathieu y un instrumento de forma redonda como referencia de tamaño.
3. Junte los extremos en forma de bucle de la bobina y el alambre CrNi redondo de 0,20 mm.
4. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de 0,2 mL de solución que contiene xilacina (10 mg/Kg) y ketamina (100 mg/Kg). Antes de comenzar el procedimiento, evalúe la profundidad de la anestesia utilizando el reflejo del pedal. Pellizque cuidadosamente uno de los dedos del animal con unas pinzas. La ausencia de reflejo indica un plano adecuado de anestesia general. Para evitar lesiones corneales y dolor postoperatorio, aplique un lubricante ocular después de anestesiar al animal.
5. Coloque al animal en decúbito dorsal sobre una mesa quirúrgica, inmovilizando sus extremidades para restringir el movimiento y permitir el acceso intraoral.
6. Utilice un abridor de boca, hecho de alambre de 0,50 mm de diámetro y asegurado con un alambre de 0,08 mm, para facilitar la visualización completa y evitar el movimiento de la cabeza. Utilice el lado derecho como el lado experimental (lado OTM) y el lado izquierdo como el control sin una bobina ortodóntica (lado de control).
   NOTA: La visualización mejorada de las estructuras intraorales debe lograrse utilizando un microscopio estereoscópico y un sistema de luz óptica.
7. Limpie y grabe las superficies del primer molar e incisivo derecho con acetona y una imprimación autograbante, respectivamente. El sistema es autograbado, por lo que no requiere un acondicionamiento previo con ácido.
   1. Aplique la imprimación en un solo paso, que también funciona simultáneamente como ácido y adhesivo. Con un micropincel, recoja una pequeña cantidad de imprimación autograbante y aplíquela en la superficie oclusal del primer molar superior y los incisivos. En este paso se debe tener cuidado para que la imprimación autograbante no llegue a la superficie proximal entre los primeros y segundos molares, ya que esto podría hacer que los elementos dentales se peguen entre sí, impidiendo el movimiento de los dientes. Fotopolimerizar la imprimación en la superficie oclusal de los molares e incisivos durante 30 s.
8. Fije el extremo distal de un muelle helicoidal abierto NiTi de seis bucles a la superficie oclusal del primer molar maxilar derecho con resina fotopolimerizable y fotopolimerización durante 30 s. Agregue un incremento adicional de resina al borde del alambre para evitar daños a los ratones y fotocure durante 30 s.
9. Active la bobina utilizando un aparato específicamente diseñado que consta de un riel y un mecanismo de manivela conectado a la mesa quirúrgica. Esto permite que el movimiento longitudinal se deslice hacia adelante y hacia atrás.
10. Conecte el extremo en forma de bucle libre del cable redondo de 0,20 mm al gancho del medidor de tensión.
11. Al activar la manivela, mueva la mesa quirúrgica a lo largo del riel hasta que el dinamómetro registre una fuerza de 0,35 N.
12. Une el alambre redondo de 0,20 mm a ambos incisivos superiores para anclar la bobina. No se realizan más reactivaciones durante el período experimental. Corta el cable para separar al animal del dinamómetro.  Agregue otro incremento de resina para que el borde metálico del dispositivo no quede expuesto y no lastime al animal. Fotopolimerización durante 30 s. Desmonta el animal de la mesa.
13. El primer molar superior derecho con un dispositivo que impone una fuerza de 0,35 N en la dirección mesial consiste en el lado experimental. Utilizar el lado izquierdo del maxilar (sin aparato ortodóncico) como control ^4,16.
14. Mantenga este dispositivo durante un período de 12 días sin que sea necesario activarlo. No use ningún medicamento para el control del dolor. El movimiento ortodóntico se produce a través de un proceso inflamatorio, y la medicación para aliviar el dolor puede afectar negativamente a la cascada de ácido araquidónico, afectando a la tasa de remodelación ósea y potencialmente invalidando los resultados.
15. Una vez finalizada la cirugía, tratar a los animales con una inyección subcutánea de solución salina para evitar la deshidratación durante el periodo de adaptación con el dispositivo. Mantener al animal en una jaula individual con calefacción hasta que esté completamente recuperado y solo después de este período colocar al animal en jaulas colectivas.
16. Sacrificar al ratón a los 12^{días mediante} sedación con inyección intraperitoneal de una solución de 0,2 mL que contiene xilacina (10 mg/Kg) y ketamina (100 mg/Kg) seguida de decapitación con tijeras afiladas.

2. Mediciones de micro-TC

1. Extraiga el hueso maxilar con tijeras afiladas cortando todo el tejido blando, el hueso cigomático en el plano sagital y la sutura frontonasal y la sincondrosis esfenooccipital en el plano coronal. Sumergir el hueso maxilar en formol tamponado neutro al 10% (pH=7,4) durante un periodo de fijación de 48 h. Después de este período, cambie la solución de formaldehído a 70% de alcohol.
2. Realice una exploración micro-CT del hueso maxilar con los siguientes parámetros para exploraciones de alta resolución: tamaño de vóxel isotrópico de 9 a 18 μm, configuración de rayos X de 50 kV, filtro de aluminio de 0,5 mm y ángulo de rotación de 0,5°. Se puede colocar más de una mandíbula durante la exploración por microCT.
3. Reconstruir las imágenes adquiridas utilizando el programa de reconstrucción por microtomografía indicado por el fabricante de la microtomografía computarizada (microTC) utilizada¹⁷.
4. Coloque las imágenes reconstruidas utilizando el programa de inspección 3D indicado por el fabricante de la microtomografía utilizada.
5. Cuantificar la OTM midiendo la diferencia de distancia lineal entre la unión cemento-esmalte (CEJ) de los primeros y segundos molares del hemimaxilar derecho (lado OTM) en relación con el hemimaxilar izquierdo (lado control). Utilice el software de análisis de microCT adecuado con la herramienta de línea para esta medición 17,18,19,20.
6. Verifique las muestras para detectar la presencia de reabsorción radicular inflamatoria inducida por ortodoncia (OIIRR). Seleccione la región de interés (ROI) de la raíz disto-vestibular del primer molar maxilar mediante un método de contorno manual de la región anatómica de interés irregular. Mida los siguientes parámetros: densidad mineral radicular (RMD; g/cm³) y porcentaje de volumen radicular por volumen total (RV/TV; %). Utilice el software de análisis de microCT adecuado con la herramienta volumétrica 3D para esta medición^16,21.
7. Realizar la reconstrucción del primer molar maxilar con el software Mimics y analizar los datos obtenidos para extraer conclusiones sobre OTM y OIIRR en el modelo experimental^16,21.

Resultados

Este protocolo permite la investigación de un modelo de ratón OTM utilizando un muelle helicoidal de NiTi. Con una fuerza de 0,35 N aplicada, la distancia media de CEJ en el lado control entre los primeros y segundos molares fue de 243,69 μm (Figura 1A, línea A), mientras que en el lado OTM se midió en 284,66 μm (Figura 1A, línea B). La diferencia entre el OTM y el lado control fue de 40,97 μm (Figura 1B). L...

Discusión

Aquí, describimos un protocolo estandarizado diseñado para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la remodelación ósea durante la OTM. Una comprensión profunda de estos mecanismos en ratones requiere un protocolo meticulosamente planificado para garantizar la precisión y la fiabilidad ^7,11. Los estudios realizados por nuestro grupo de investigación han demostrado que este protocolo reduce eficazmente la variabilidad del operador al...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A