Farelerde Ortodontik Diş Hareketinin İncelenmesi

Özet

Burada, ortodontik diş hareketini (OTM) incelemek için kemik adaptasyonu, kök rezorpsiyonu ve kemik hücrelerinin mekanik uyaranlara tepkisi mekanizmalarını araştırmak için uygun bir model olarak hizmet veren bir protokol sunuyoruz. Bu kapsamlı kılavuz, OTM modeli, mikro bilgisayarlı tomografi alımı ve sonraki analizler hakkında ayrıntılı bilgi sağlar.

Özet

Ortodontik diş hareketi (OTM), alveol kemiğinin sırasıyla osteoklastlar ve osteoblastlar tarafından düzenlenen, kompresyon bölgelerinde rezorpsiyona ve gerginlik bölgelerinde birikmeye uğradığı dinamik bir süreci temsil eder. Bu mekanizma, kök rezorpsiyonu ve mekanik kuvvet uyaranlarına hücresel tepki dahil olmak üzere kemik adaptasyonunun çeşitli yönlerini incelemek için değerli bir model görevi görür. Burada özetlenen protokol, OTM'yi araştırmak için basit bir yaklaşım sunar ve nikel-titanyum (NiTi) helezon yay kullanan bir fare modelinde en uygun kuvvet olarak 0,35 N'yi belirler. Mikro bilgisayarlı tomografi analizinden yararlanarak, çimento-emaye bağlantısındaki doğrusal mesafedeki tutarsızlığı değerlendirerek OTM'yi ölçtük. Değerlendirme ayrıca, ortodontik kaynaklı inflamatuar kök rezorpsiyonunun bir analizini, kök mineral yoğunluğu ve toplam hacim başına kök hacmi yüzdesi gibi parametreleri değerlendirmeyi de içeriyordu. Bu kapsamlı protokol, kemiğin yeniden şekillendirilme süreçleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye ve etkili ortodontik tedavi stratejileri geliştirme yeteneğimizi geliştirmeye katkıda bulunur.

Giriş

Kemiğin yeniden şekillenmesi, yetişkin iskeletinin bütünlüğünü korumak için gerekli olan osteoklastlar, osteoblastlar, kemik astar hücreleri ve osteositler tarafından düzenlenen devam eden bir süreçtir ^1,2. Öncelikle osteoklastların ve osteoblastların farklılaşması ve aktivitesi tarafından yönlendirilen bu dinamik süreç, mekanik stres ve yükleme ^3,4,5 ile tetiklenen kemiğin emilmesini ve birikmesini içerir.

Hayvan deneyleri, ortodontik diş hareketinin (OTM) temelini oluşturan karmaşık biyolojik ve hücresel mekanizmaların aydınlatılmasında çok önemli bir rol ^{oynamaktadır6,7}. Bu süreç, çene kemiği ve periodontal ligament içinde yer alan osteoblastlar, osteoklastlar, osteositler, fibroblastlar ve makrofajlar ve T hücreleri gibi bağışıklık hücreleri gibi çok çeşitli hücre tiplerini içerir ^7,8. Bu hücreler, mekanik uyaranlara ve yerel ortamdaki değişikliklere dinamik olarak yanıt vererek, çevredeki kemiğin bileşimini ve mimarisini etkiler ^7,8. Ayrıca, mevcut hiçbir patojen olmamasına rağmen, hücresel düzeyde bir inflamatuar yanıtı da tetiklerler. Bu enflamatuar yanıt, kemik dokusunun döngüsünün artmasında rol oynar⁹.

OTM ^7,8,10'un deneysel çalışmalarında fareler, sıçanlar, tavşanlar, köpekler ve maymunlar dahil olmak üzere çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Bunlar arasında, kemirgenler, özellikle fareler, diş hareketinin ve kemiğin yeniden şekillenmesinin ilk aşamalarını araştırmak için tercih edilmektedir⁶. Önceki araştırmalar, öncelikle genetik olarak değiştirilmiş suşların yaygın olarak bulunması nedeniyle, fare modellerinin sıçan modellerine göre avantajlarını vurgulamış ve OTM^7,11'deki genetik etkilerin ayrıntılı olarak araştırılmasını sağlamıştır. Şu anda, farelerde diş hareketini indüklemek için iki ana model kullanılmaktadır. İlk yöntem, birinci üst azı dişi ile üst kesici dişler ^4,12 arasına bir nikel-titanyum (NiTi) helezon yay yerleştirilmesini gerektirir. İkinci yaklaşım, birinci ve ikinci üst azı dişleri¹³ arasındaki interdental boşluğa elastik bir bant yerleştirmeyi içerir. Analiz edilen birincil sonuçlar tipik olarak diş hareketinin büyüklüğünü ve kemik mikro mimarisini içerir ve tercihen mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) kullanılarak ^{değerlendirilir14}. İdeal olarak, diş köklerinin bütünlüğünün değerlendirilmesi, OT^M4'ü üretmek için uygun kuvvetlerin kullanıldığından emin olmak için önemlidir.

Mikro-BT, mineralize dokuların^mikro mimarisini değerlendirmek için altın standart olarak yaygın olarak kabul edilirken14, verilerin taranması, analiz edilmesi ve raporlanması için standartlaştırılmış metodolojilerin ve protokollerin olmaması, kullanılan kesin prosedürleri ayırt etmede, sonuçları yorumlamada ve farklı OTM modelleri arasında karşılaştırmaları kolaylaştırmada genellikle zorluklar ortaya çıkarmaktadır^14,15.

Burada, mikro-CT alımı ve OTM, kemik mikro yapısı ve diş köklerinin analizi dahil olmak üzere OTM fare modeline adım adım bir kılavuz sunuyoruz. Bu yöntem, çene kemiği içinde hareketi indüklemek için birinci azı dişine kontrollü mekanik kuvvet uygulanmasını gerektirir. Bu yöntemin seçimi, fizibilite, alaka düzeyi ve kesinlik dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden kaynaklanır. Böyle bir yaklaşım, ortodontik diş hareketinin altında yatan biyolojik süreçler hakkında değerli bilgiler sağlayarak ve gelecekte iyileştirilmiş ortodontik tedavi stratejilerinin geliştirilmesini kolaylaştırarak ayrıntılı kantitatif analize olanak tanır.

Protokol

Tüm prosedürler, Universidade Federal de Minas Gerais Etik Komitesi (No. 166/2022) tarafından belirlenen etik standartlara sıkı sıkıya bağlı kalmıştır. Her deneyden önce, bir örneklem büyüklüğü hesaplaması zorunludur. Yaklaşık 20-30 g ağırlığında 8-10 haftalık erkek C57BL6/J vahşi tip fareler kullanın. Fareler, 25 °C'de tutulan bir oda içinde, 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsüne bağlı kalarak bir kafese yerleştirilmelidir. Bobin bağlantısını takiben, hayvan yumuşak bir diyetle beslenmelidir. Günlük izleme, vücut ağırlığı ve genel sağlık değerlendirmelerini içermelidir.

1. Mekanik olarak indüklenen alveolar kemik yeniden şekillenmesi

1. Distal kesim pensesi kullanarak, 0.25 x 0.76 inç NiTi açık helezon yayını, ortodontik Weingart pense kullanarak yaya dik olarak yerleştirilmiş altı ilmek ve iki halka şeklindeki ucun aşağıdaki boyutlarına kadar kesin.
2. 0,20 mm çapındaki yuvarlak krom-nikel (CrNi) teli, Mathieu cımbız ve boyut referansı olarak yuvarlak şekilli bir alet kullanarak ilmek şeklindeki uçlarla istenen konfigürasyona göre şekillendirin.
3. Bobinin halka şeklindeki uçlarını ve 0,20 mm yuvarlak CrNi telini bir araya getirin.
4. Hayvanı, ksilazin (10 mg / Kg) ve ketamin (100 mg / Kg) içeren 0.2 mL çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. İşleme başlamadan önce, pedal refleksini kullanarak anestezi derinliğini değerlendirin. Cımbız kullanarak hayvanın ayak parmaklarından birini dikkatlice sıkıştırın. Bir refleksin olmaması, yeterli bir genel anestezi düzlemini gösterir. Kornea yaralanmalarını ve ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için, hayvan uyuşturulduktan sonra oküler bir kayganlaştırıcı uygulayın.
5. Hayvanı dorsal dekübitte cerrahi bir masaya yerleştirin, hareketi kısıtlamak ve ağız içi erişimi sağlamak için uzuvlarını hareketsiz hale getirin.
6. Kafa hareketini önlerken tam görselleştirmeyi kolaylaştırmak için 0,50 mm çapında telden yapılmış ve 0,08 mm tel ile sabitlenmiş bir ağız açıcı kullanın. Sağ tarafı deney tarafı olarak (OTM tarafı) ve sol tarafı ortodontik bobin olmadan kontrol tarafı olarak kullanın (Kontrol tarafı).
   NOT: Ağız içi yapıların gelişmiş görselleştirilmesi, bir stereomikroskop ve bir optik ışık sistemi kullanılarak sağlanmalıdır.
7. Sağ birinci azı dişi ve kesici yüzeyleri sırasıyla aseton ve kendiliğinden aşınan bir astar kullanarak temizleyin ve aşındırın. Sistem kendi kendine aşındırılır, yani önceden asit şartlandırması gerektirmez.
   1. Astarı, aynı anda hem asit hem de yapıştırıcı olarak işlev gören tek bir adımda uygulayın. Bir mikro fırça kullanarak, az miktarda kendiliğinden aşındırma astarı toplayın ve üst birinci azı dişi ve kesici dişlerin oklüzal yüzeyine uygulayın. Bu adımda, kendiliğinden aşındırılan astarın birinci ve ikinci azı dişleri arasındaki proksimal yüzeye ulaşmamasını sağlamak için dikkatli olunmalıdır, çünkü bu, diş elemanlarının birbirine yapışmasına ve diş hareketini engellemesine neden olabilir. Işık, azı dişlerinin ve kesici dişlerin oklüzal yüzeyindeki astarı 30 saniye boyunca sertleştirir.
8. Altı halkalı bir NiTi açık helezon yayın distal ucunu, ışıkla sertleşen reçine ve 30 saniye boyunca ışıkla sertleşen sağ maksiller azı dişinin oklüzal yüzeyine yapıştırın. Farelere zarar vermemek için telin kenarına ek reçine artışı ekleyin ve 30 saniye boyunca ışıkla sertleşin.
9. Ameliyat masasına bağlı bir ray ve krank mekanizmasından oluşan özel olarak tasarlanmış bir aparat kullanarak bobini etkinleştirin. Bu, uzunlamasına hareketin ileri geri kaymasını sağlar.
10. 0.20 mm'lik yuvarlak telin serbest halka şeklindeki ucunu gergi ölçerin kancasına bağlayın.
11. Krankın aktivasyonu üzerine, dinamometre 0,35 N'lik bir kuvvet kaydedene kadar ameliyat masasını ray boyunca hareket ettirin.
12. Bobini sabitlemek için 0.20 mm'lik yuvarlak teli her iki üst kesici dişe bağlayın. Deney süresi boyunca başka bir reaktivasyon gerçekleştirilmez. Hayvanı dinamometreden ayırmak için teli kesin.  Cihazın metal kenarının açıkta kalmaması ve hayvana zarar vermemesi için başka bir reçine artışı ekleyin. 30 s için hafif kür. Hayvanı masadan sökün.
13. Sağ üst birinci azı dişi, mesial yönde 0.35 N'luk bir kuvvet uygulayan bir cihazla deneysel taraftan oluşur. Maksillanın sol tarafını (ortodontik aparey olmadan) kontrol ^4,16 olarak kullanın.
14. Bu cihazı herhangi bir aktivasyon gerekmeden 12 günlük bir süre boyunca koruyun. Herhangi bir ağrı kontrol ilacı kullanmayın. Ortodontik hareket, enflamatuar bir süreçle gerçekleşir ve ağrı giderici ilaçlar, araşidonik asit kaskadını olumsuz yönde etkileyerek kemiğin yeniden şekillenme oranını etkileyebilir ve potansiyel olarak sonuçları geçersiz kılabilir.
15. Ameliyatın bitiminden sonra, cihazla adaptasyon döneminde dehidrasyonu önlemek için hayvanları deri altı tuzlu su çözeltisi enjeksiyonu ile tedavi edin. Hayvanı tamamen iyileşene kadar ısıtmalı ayrı bir kafeste tutun ve ancak bu süreden sonra hayvanı toplu kafeslere yerleştirin.
16. 12^{. günde}, ksilazin (10 mg / Kg) ve ketamin (100 mg / Kg) içeren 0.2 mL'lik bir çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu ile sedasyon ile fareyi ötenazi yapın ve ardından keskin bir makasla dekapitasyon yapın.

2. Mikro-CT ölçümleri

1. Maksiller kemiği, tüm yumuşak dokuları, sagital düzlemdeki elmacık kemiğini ve koronal düzlemde frontonazal sütürü ve sfeno-oksipital senkondrozu kesen keskin bir makasla hasat edin. Maksiller kemiği 48 saatlik bir fiksasyon süresi boyunca% 10 nötr tamponlu formaline (pH = 7.4) daldırın. Bu süreden sonra formaldehit çözeltisini% 70 alkolle değiştirin.
2. Yüksek çözünürlüklü taramalar için aşağıdaki parametrelerle maksiller kemiğin mikro-BT taramasını gerçekleştirin: 9 ila 18 μm izotropik voksel boyutu, 50 kV X-ışını ayarları, 0,5 mm alüminyum filtre ve 0,5° dönüş açısı. MikroCT taraması sırasında birden fazla çene takılabilir.
3. Kullanılan mikro bilgisayarlı tomografi (mikroBT) üreticisi tarafından belirtilen mikrotomografi rekonstrüksiyon programını kullanarak elde edilen görüntüleri yeniden oluşturun¹⁷.
4. Kullanılan mikrotomografinin üreticisi tarafından belirtilen 3D İnceleme programını kullanarak yeniden yapılandırılmış görüntüleri konumlandırın.
5. Sağ hemi-maksillanın (OTM tarafı) birinci ve ikinci azı dişlerinin çimento-emaye birleşimi (CEJ) arasındaki doğrusal mesafe farkını sol hemi-maksillaya (kontrol tarafı) göre ölçerek OTM'yi ölçün. Bu ölçüm 17,18,19,20 için hat aracıyla uygun mikroCT analizör yazılımını kullanın.
6. Ortodontik kaynaklı inflamatuar kök rezorpsiyonu (OIIRR) varlığı için numuneleri kontrol edin. Birinci maksiller azı dişinin disto-vestibüler kökünün ilgilenilen bölgesini (ROI) düzensiz, anatomik bir ilgilenilen bölgeyi manuel olarak çizilen şekillendirme yöntemi kullanarak seçin. Aşağıdaki parametreleri ölçün: kök mineral yoğunluğu (RMD; g/^cm3) ve toplam hacim başına kök hacmi yüzdesi (RV/TV; %). Bu ölçüm için 3D hacimsel araçla uygun mikroCT analizör yazılımını kullanın^16,21.
7. Mimics yazılımını kullanarak birinci maksiller molarin rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin ve deneysel modelde^OTM ve OIIRR ile ilgili sonuçlar çıkarmak için elde edilen verileri analiz edin ^16,21.

Sonuçlar

Bu protokol, bir NiTi helezon yayı kullanan bir OTM fare modelinin araştırılmasını sağlar. 0.35 N'luk bir kuvvet uygulandığında, birinci ve ikinci azı dişleri arasındaki kontrol tarafındaki ortalama CEJ mesafesi 243.69 μm (Şekil 1A, çizgi A), OTM tarafında ise 284.66 μm olarak ölçüldü (Şekil 1A, çizgi B). OTM ve kontrol tarafları arasındaki fark 40.97 μm idi (Şekil 1B). Sağ hemi-maksill...

Tartışmalar

Burada, OTM sırasında kemik yeniden şekillenmesinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları aydınlatmak için tasarlanmış standart bir protokolü açıklıyoruz. Farelerde bu mekanizmaların tam olarak anlaşılması, doğruluğu ve güvenilirliği sağlamak için titizlikle planlanmış bir protokol gerektirir ^7,11. Araştırma grubumuz tarafından yürütülen çalışmalar, bu protokolün bir gerginlik ölçer ve özel olarak tasarlanmış ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A