Estudando o movimento dentário ortodôntico em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a movimentação dentária ortodôntica (MOT), servindo como um modelo adequado para investigar os mecanismos de adaptação óssea, reabsorção radicular e a resposta das células ósseas a estímulos mecânicos. Este guia abrangente fornece informações detalhadas sobre o modelo OTM, aquisição de microtomografia computadorizada e análise subsequente.

Resumo

A movimentação dentária ortodôntica (MOT) representa um processo dinâmico no qual o osso alveolar sofre reabsorção nos locais de compressão e deposição nos locais de tensão, orquestrados por osteoclastos e osteoblastos, respectivamente. Esse mecanismo serve como um modelo valioso para estudar vários aspectos da adaptação óssea, incluindo a reabsorção radicular e a resposta celular a estímulos de força mecânica. O protocolo descrito aqui oferece uma abordagem direta para investigar OTM, estabelecendo 0,35 N como a força ideal em um modelo de camundongo empregando uma mola helicoidal de níquel-titânio (NiTi). Utilizando análise de microtomografia computadorizada, quantificamos a OTM avaliando a discrepância na distância linear na junção cimento-esmalte. A avaliação também incluiu uma análise da reabsorção radicular inflamatória induzida por ortodontia, avaliando parâmetros como densidade mineral radicular e a porcentagem de volume radicular por volume total. Este protocolo abrangente contribui para o avanço de nossa compreensão dos processos de remodelação óssea e aumenta a capacidade de desenvolver estratégias eficazes de tratamento ortodôntico.

Introdução

A remodelação óssea é um processo contínuo orquestrado por osteoclastos, osteoblastos, células de revestimento ósseo e osteócitos, essenciais para manter a integridade do esqueleto adulto ^1,2. Impulsionado principalmente pela diferenciação e atividade de osteoclastos e osteoblastos, esse processo dinâmico envolve a reabsorção e deposição do osso, desencadeada por estresse mecânico e carga ^3,4,5.

Experimentos com animais desempenham um papel fundamental na elucidação dos intrincados mecanismos biológicos e celulares que sustentam o movimento dentário ortodôntico (OTM)^6,7. Esse processo envolve uma gama diversificada de tipos de células, como osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, fibroblastos e células imunes como macrófagos e células T, situadas no maxilar e no ligamento periodontal ^7,8. Essas células respondem dinamicamente a estímulos mecânicos e mudanças no meio local, influenciando a composição e a arquitetura do osso circundante ^7,8. Além disso, eles também desencadeiam uma resposta inflamatória em nível celular, embora não haja patógenos presentes. Essa resposta inflamatória desempenha um papel no aumento da renovação do tecido ósseo⁹.

Vários modelos animais, incluindo camundongos, ratos, coelhos, cães e macacos, têm sido utilizados em estudos experimentais de OTM ^7,8,10. Dentre estes, os roedores, particularmente os camundongos, são favorecidos para investigar as fases iniciais da movimentação dentária e da remodelação óssea⁶. Pesquisas anteriores enfatizaram as vantagens do uso de modelos de camundongos em relação aos modelos de ratos, principalmente devido à ampla disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, permitindo a exploração detalhada das influências genéticas na OTM ^7,11. Atualmente, dois modelos principais são empregados para induzir a movimentação dentária em camundongos. O primeiro método consiste na inserção de uma mola helicoidal de níquel-titânio (NiTi) entre o primeiro molar superior e os incisivos superiores ^4,12. A segunda abordagem envolve a colocação de uma faixa elástica dentro do espaço interdental entre o primeiro e o segundo molares superiores¹³. Os desfechos primários analisados geralmente incluem a magnitude da movimentação dentária e a microarquitetura óssea, preferencialmente avaliada por meio de microtomografia computadorizada (micro-CT)¹⁴. Idealmente, avaliar a integridade das raízes dentárias é importante para garantir que as forças apropriadas sejam empregadas para produzir OT^M4.

Embora a micro-CT seja amplamente reconhecida como o padrão-ouro para avaliar a microarquitetura de tecidos mineralizados¹⁴, a ausência de metodologias e protocolos padronizados para escaneamento, análise e relatório de dados muitas vezes apresenta desafios para discernir os procedimentos precisos empregados, interpretar os resultados e facilitar comparações entre diferentes modelos OTM ^14,15.

Aqui, apresentamos um guia passo a passo para o modelo de camundongo OTM, incluindo aquisição de micro-CT e análise de OTM, microestrutura óssea e raízes dentárias. Este método envolve a aplicação de força mecânica controlada ao primeiro molar para induzir o movimento dentro do maxilar. A seleção desse método decorre de vários fatores, incluindo viabilidade, relevância e precisão. Essa abordagem permite uma análise quantitativa detalhada, fornecendo informações valiosas sobre os processos biológicos subjacentes ao movimento dentário ortodôntico e facilitando o desenvolvimento de estratégias de tratamento ortodôntico aprimoradas no futuro.

Protocolo

Todos os procedimentos seguiram rigorosamente os padrões éticos estabelecidos pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Minas Gerais (nº 166/2022). Antes de cada experimento, um cálculo do tamanho da amostra é obrigatório. Use camundongos C57BL6 / J machos de 8 a 10 semanas de idade, pesando aproximadamente 20 a 30 g. Os ratinhos devem ser alojados numa gaiola dentro de uma sala mantida a 25 °C, respeitando um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuridão. Após a fixação da bobina, o animal deve ser alimentado com uma dieta leve. O monitoramento diário deve incluir avaliações do peso corporal e da saúde geral.

1. Remodelação óssea alveolar induzida mecanicamente

1. Usando um alicate de corte distal, corte a mola helicoidal aberta de NiTi de 0,25 x 0,76 polegadas nas seguintes dimensões de seis voltas e duas extremidades em forma de laço posicionadas perpendicularmente à mola usando um alicate Weingart ortodôntico.
2. Molde o fio redondo de cromo-níquel (CrNi) de 0,20 mm de diâmetro na configuração desejada com extremidades em forma de laço usando uma pinça Mathieu e um instrumento redondo como referência de tamanho.
3. Junte as extremidades em forma de laço da bobina e o fio CrNi redondo de 0,20 mm.
4. Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de 0,2 mL de solução contendo xilazina (10 mg/Kg) e cetamina (100 mg/Kg). Antes de iniciar o procedimento, avalie a profundidade da anestesia usando o reflexo pedal. Aperte cuidadosamente um dos dedos do animal com uma pinça. A ausência de reflexo indica um plano adequado de anestesia geral. Para evitar lesões na córnea e dor pós-operatória, aplique um lubrificante ocular após a anestesia do animal.
5. Posicione o animal em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica, imobilizando seus membros para restringir o movimento e permitir o acesso intraoral.
6. Utilize um abridor de boca, feito de fio de 0,50 mm de diâmetro e preso com um fio de 0,08 mm, para facilitar a visualização completa e evitar o movimento da cabeça. Use o lado direito como lado experimental (lado OTM) e o lado esquerdo como controle sem bobina ortodôntica (lado controle).
   NOTA: A visualização aprimorada das estruturas intraorais deve ser obtida usando um estereomicroscópio e um sistema óptico de luz.
7. Limpe e condicione as superfícies do primeiro molar e incisivo direito usando acetona e um primer autocondicionante, respectivamente. O sistema é autocondicionante, o que significa que não requer condicionamento ácido prévio.
   1. Aplique o primer em uma única etapa, que também funciona simultaneamente como ácido e adesivo. Usando um microbrush, colete uma pequena quantidade de primer autocondicionante e aplique-o na superfície oclusal do primeiro molar superior e dos incisivos. Deve-se ter cuidado nesta etapa para garantir que o primer autocondicionante não atinja a superfície proximal entre o primeiro e o segundo molares, pois isso pode fazer com que os elementos dentários grudem, impedindo a movimentação dentária. Fotopolimerize o primer na superfície oclusal dos molares e incisivos por 30 s.
8. Cole a extremidade distal de uma mola helicoidal aberta de NiTi de seis alças à superfície oclusal do primeiro molar maxilar direito com resina fotopolimerizável e fotopolimerizável por 30 s. Adicione mais incremento de resina na borda do fio para evitar danos aos camundongos e fotopolimerize por 30 s.
9. Ative a bobina usando um aparelho especificamente projetado que consiste em um mecanismo de trilho e manivela preso à mesa cirúrgica. Isso permite que o movimento longitudinal deslize para frente e para trás.
10. Conecte a extremidade livre em forma de laço do fio redondo de 0.20 mm ao gancho do medidor de tensão.
11. Ao acionar a manivela, mova a mesa cirúrgica ao longo do trilho até que o dinamômetro registre uma força de 0,35 N.
12. Cole o fio redondo de 0.20 mm em ambos os incisivos superiores para ancorar a bobina. Nenhuma reativação adicional é realizada durante o período experimental. Corte o fio para separar o animal do dinamômetro.  Adicione outro incremento de resina para que a borda de metal do dispositivo não fique exposta e não machuque o animal. Fotopolimerização por 30 s. Desmonte o animal da mesa.
13. O primeiro molar superior direito com um dispositivo que impõe uma força de 0,35 N na direção mesial consiste no lado experimental. Use o lado esquerdo da maxila (sem aparelho ortodôntico) como controle ^4,16.
14. Faça a manutenção deste dispositivo por um período de 12 dias sem necessidade de ativação. Não use nenhum medicamento para controle da dor. O movimento ortodôntico ocorre por meio de um processo inflamatório, e a medicação para aliviar a dor pode afetar negativamente a cascata do ácido araquidônico, impactando a taxa de remodelação óssea e potencialmente invalidando os resultados.
15. Após o término da cirurgia, trate os animais com uma injeção subcutânea de soro fisiológico para evitar a desidratação durante o período de adaptação com o dispositivo. Mantenha o animal em gaiola individual com aquecimento até que esteja totalmente recuperado e somente após esse período coloque o animal em gaiolas coletivas.
16. Eutanasiar o camundongo no^12º dia realizado por sedação com injeção intraperitoneal de uma solução de 0,2 mL contendo xilazina (10 mg/Kg) e cetamina (100 mg/Kg) seguida de decapitação com tesoura afiada.

2. Medições de micro-CT

1. Colha o osso maxilar com tesoura afiada cortando todo o tecido mole, o osso zigomático no plano sagital e a sutura frontonasal e a sincondrose esfeno-occipital no plano coronal. Mergulhe o osso maxilar em formalina tamponada neutra a 10% (pH = 7,4) por um período de fixação de 48 h. Após este período, troque a solução de formaldeído para álcool 70%.
2. Realize a microtomografia computadorizada do osso maxilar com os seguintes parâmetros para exames de alta resolução: tamanho de voxel isotrópico de 9 a 18 μm, configurações de raios-X de 50 kV, filtro de alumínio de 0,5 mm e ângulo de rotação de 0,5°. Mais de uma mandíbula pode ser ajustada durante a microtomografia computadorizada.
3. Reconstruir as imagens adquiridas utilizando o programa de reconstrução por microtomografia indicado pelo fabricante da microtomografia computadorizada (microCT) utilizada¹⁷.
4. Posicione as imagens reconstruídas usando o programa de inspeção 3D indicado pelo fabricante da microtomografia utilizada.
5. Quantifique a OTM medindo a diferença na distância linear entre a junção cimento-esmalte (CEJ) do primeiro e segundo molares da hemimaxila direita (lado OTM) em relação à hemimaxila esquerda (lado controle). Utilize o software analisador microCT adequado com a ferramenta de linha para esta medição 17,18,19,20.
6. Verifique as amostras quanto à presença de reabsorção radicular inflamatória induzida por ortodontia (OIIRR). Selecione a região de interesse (ROI) da raiz disto-vestibular do primeiro molar superior usando um método de contorno de região de interesse anatômica irregular desenhada manualmente. Meça os seguintes parâmetros: densidade mineral radicular (RMD; g/cm³) e porcentagem do volume radicular por volume total (VR/VC; %). Utilize o software analisador microCT adequado com a ferramenta volumétrica 3D para esta medição^16,21.
7. Realizar a reconstrução do primeiro molar superior usando o software Mimics e analisar os dados obtidos para tirar conclusões sobre OTM e OIIRR no modelo experimental^16,21.

Resultados

Este protocolo permite a investigação de um modelo de camundongo OTM usando uma mola helicoidal de NiTi. Com uma força de 0,35 N aplicada, a distância média da CEJ no lado controle entre o primeiro e o segundo molares foi de 243,69 μm (Figura 1A, linha A), enquanto no lado OTM foi medida em 284,66 μm (Figura 1A, linha B). A diferença entre os lados OTM e controle foi de 40,97 μm (Figura 1B). A distância li...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo padronizado projetado para elucidar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à remodelação óssea durante a OTM. Uma compreensão completa desses mecanismos em camundongos requer um protocolo meticulosamente planejado para garantir precisão e confiabilidade ^7,11. Estudos conduzidos por nosso grupo de pesquisa mostraram que este protocolo reduz efetivamente a variabilidade do operador ao incorporar um medidor de tensão ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A