생쥐의 치아 교정 운동 연구

요약

여기에서는 뼈 적응, 뿌리 흡수 및 기계적 자극에 대한 뼈 세포의 반응 메커니즘을 조사하는 데 적합한 모델 역할을 하는 치아 교정 운동(OTM)을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 포괄적인 가이드는 OTM 모델, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 획득 및 후속 분석에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

초록

치아 교정 운동(OTM)은 치조골이 압박 부위에서 흡수되고 긴장 부위에서 침착을 겪는 역동적인 과정을 나타내며, 각각 파골세포와 조골세포에 의해 조정됩니다. 이 메커니즘은 뿌리 흡수 및 기계적 힘 자극에 대한 세포 반응을 포함하여 뼈 적응의 다양한 측면을 연구하는 데 유용한 모델 역할을 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 OTM을 조사하기 위한 간단한 접근 방식을 제공하여 니켈-티타늄(NiTi) 코일 스프링을 사용하는 마우스 모델에서 0.35N을 최적의 힘으로 설정합니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석을 활용하여 시멘트-에나멜 접합부에서 선형 거리의 차이를 평가하여 OTM을 정량화했습니다. 이 평가에는 또한 교정 유도 염증성 뿌리 흡수에 대한 분석이 포함되었으며, 뿌리 미네랄 밀도 및 총 부피당 뿌리 부피의 백분율과 같은 매개변수를 평가했습니다. 이 포괄적인 프로토콜은 뼈 리모델링 과정에 대한 이해를 높이고 효과적인 교정 치료 전략을 개발할 수 있는 능력을 향상시키는 데 기여합니다.

서문

뼈 리모델링은 파골세포, 조골세포, 골내막 세포 및 골세포에 의해 조율되는 지속적인 과정으로, 성인 골격의 무결성을 유지하는 데 필수적입니다 ^1,2. 주로 파골세포(osteoclast)와 조골세포(osteoblast)의 분화와 활동에 의해 주도되는 이 역동적인 과정은 기계적 응력과 하중에 의해 유발되는 뼈의 흡수 및 침착을 포함한다 ^3,4,5.

동물 실험은 치아 교정 운동(OTM^)을 뒷받침하는 복잡한 생물학적, 세포 메커니즘을 밝히는 데 중추적인 역할을 합니다^6,7. 이 과정에는 조골세포, 파골세포, 골세포, 섬유아세포와 같은 다양한 세포 유형과 대식세포 및 T 세포와 같은 면역 세포가 포함되며 턱뼈 및 치주 인대 내에 위치합니다 ^7,8. 이 세포는 기계적 자극과 국소 환경의 변화에 동적으로 반응하여 주변 뼈의 구성 및 구조에 영향을 미칩니다 ^7,8. 또한, 병원체가 존재하지 않더라도 세포 수준에서 염증 반응을 유발합니다. 이 염증 반응은 뼈 조직의 회전율을 증가시키는 역할을 한다⁹.

생쥐, 쥐, 토끼, 개 및 원숭이를 포함한 다양한 동물 모델이 OTM ^7,8,10의 실험 연구에 활용되었습니다. 이 중 설치류, 특히 생쥐는 치아 운동과 뼈 리모델링의 초기 단계를 조사하는 데 선호된다⁶. 이전 연구에서는 주로 유전자 변형 균주의 광범위한 가용성으로 인해 쥐 모델보다 마우스 모델을 사용하는 것이 이점이 있음을 강조하여 OTM ^7,11에서 유전적 영향에 대한 자세한 탐구를 가능하게 했습니다. 현재 마우스의 치아 움직임을 유도하기 위해 두 가지 주요 모델이 사용됩니다. 첫 번째 방법은 첫 번째 상부 어금니와 상부 앞니 ^4,12 사이에 니켈-티타늄(NiTi) 코일 스프링을 삽입하는 것을 수반합니다. 두 번째 접근법은 제1 및 제2 상부 어금니(¹³) 사이의 치간 공간 내에 탄성 밴드를 배치하는 것을 포함한다. 분석되는 주요 결과에는 일반적으로 치아 움직임의 크기와 뼈 미세구조가 포함되며, 가급적이면 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)을 사용하여 평가하는 것이 좋습니다¹⁴. 이상적으로, OT^M4를 생산하기 위해 적절한 힘이 사용되도록 보장하기 위해 치근의 무결성을 평가하는 것이 중요합니다.

마이크로 CT는 광물화된 조직(¹⁴)의 미세구조를 평가하기 위한 황금 표준으로 널리 인정받고 있지만, 데이터를 스캔, 분석 및 보고하기 위한 표준화된 방법론 및 프로토콜이 없기 때문에 사용된 정확한 절차를 식별하고, 결과를 해석하고, 서로 다른 OTM 모델 간의 비교를 용이하게 하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다^14,15.

여기에서는 OTM, 뼈 미세 구조 및 치근의 마이크로 CT 획득 및 분석을 포함하여 OTM 마우스 모델에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 방법은 턱뼈 내의 움직임을 유도하기 위해 첫 번째 어금니에 제어된 기계적 힘을 가하는 것을 수반합니다. 이 방법의 선택은 실현 가능성, 관련성 및 정밀도를 포함한 여러 요인에서 비롯됩니다. 이러한 접근 방식은 상세한 정량 분석을 가능하게 하여 교정 치아 운동의 기저에 있는 생물학적 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 향후 개선된 교정 치료 전략의 개발을 촉진합니다.

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프로토콜

모든 절차는 Universidade Federal de Minas Gerais 윤리 위원회(No. 166/2022)에서 정한 윤리 기준을 엄격하게 준수합니다. 각 실험 전에 표본 크기 계산은 필수입니다. 약 20-30g의 8-10주 된 수컷 C57BL6/J 야생형 마우스를 사용하십시오. 마우스는 12시간 밝음/12시간 어둡기 주기를 준수하여 25°C로 유지되는 방 내의 케이지에 수용해야 합니다. 코일을 부착한 후에는 동물에게 부드러운 식단을 먹여야 합니다. 일일 모니터링에는 체중 및 전반적인 건강 평가가 포함되어야 합니다.

1. 기계적으로 유도된 치조골 리모델링

1. 말단 절단 플라이어를 사용하여 0.25 x 0.76인치 NiTi 오픈 코일 스프링을 교정용 Weingart 플라이어를 사용하여 스프링에 수직으로 위치한 6개의 루프와 2개의 루프 모양의 끝으로 다음 치수로 자릅니다.
2. Mathieu 핀셋과 원형 기구를 크기 참조로 사용하여 고리 모양의 끝단을 사용하여 0.20mm 직경의 원형 크롬-니켈(CrNi) 와이어를 원하는 구성으로 성형합니다.
3. 코일의 고리 모양 끝과 0.20mm 원형 CrNi 와이어를 결합합니다.
4. 자일라진(10mg/Kg)과 케타민(100mg/Kg)을 함유한 용액 0.2mL의 복강내 주사로 동물을 마취합니다. 절차를 시작하기 전에 페달 반사를 사용하여 마취 깊이를 평가하십시오. 핀셋을 사용하여 동물의 발가락 중 하나를 조심스럽게 꼬집습니다. 반사가 없다는 것은 전신 마취가 적절하다는 것을 나타냅니다. 각막 손상과 수술 후 통증을 피하려면 동물을 마취한 후 안구 윤활제를 바르십시오.
5. 등쪽 욕창 상태에 있는 동물을 수술 테이블에 놓고 팔다리를 움직이지 못하게 하여 움직임을 제한하고 구강 내 접근을 가능하게 합니다.
6. 0.50mm 직경의 와이어로 제작되고 0.08mm 와이어로 고정된 입 오프너를 사용하여 머리의 움직임을 방지하면서 완전한 시각화를 용이하게 합니다. 오른쪽은 실험면(OTM 측)으로, 왼쪽은 교정 코일이 없는 대조군(대조군)으로 사용합니다.
   참고: 구강 내 구조의 향상된 시각화는 실체현미경과 광학 광 시스템을 사용하여 달성해야 합니다.
7. 오른쪽 첫 번째 어금니와 앞니 표면을 각각 아세톤과 자가 에칭 프라이머를 사용하여 청소하고 에칭합니다. 이 시스템은 자체 에칭 방식이므로 사전 산성 컨디셔닝이 필요하지 않습니다.
   1. 프라이머를 한 번에 도포하면 산과 접착제로 동시에 기능합니다. 마이크로브러시를 사용하여 소량의 자가 에칭 프라이머를 채취하여 위쪽 첫 번째 어금니와 앞니의 교합면에 바릅니다. 이 단계에서는 자가 에칭 프라이머가 첫 번째 어금니와 두 번째 어금니 사이의 근위 표면에 도달하지 않도록 주의해야 하며, 이로 인해 치아 요소가 서로 달라붙어 치아의 움직임을 방해할 수 있습니다. 어금니와 앞니의 교합면에서 프라이머를 30초 동안 광 경화시킵니다.
8. 6루프 NiTi 오픈 코일 스프링의 말단 끝을 광경화 레진과 광경화로 오른쪽 첫 번째 상악 어금니의 교합면에 접착합니다. 30초 동안 마우스와 광 경화에 해를 끼치지 않도록 와이어 가장자리에 추가 수지 증가를 추가합니다.
9. 수술 테이블에 부착된 레일과 크랭크 메커니즘으로 구성된 특별히 설계된 장치를 사용하여 코일을 활성화합니다. 이를 통해 종방향 이동이 앞뒤로 미끄러질 수 있습니다.
10. 0.20mm 원형 와이어의 자유 고리 모양 끝을 장력 게이지의 후크에 연결합니다.
11. 크랭크가 활성화되면 동력계가 0.35N의 힘을 등록할 때까지 레일을 따라 수술 테이블을 움직입니다.
12. 0.20mm 원형 와이어를 양쪽 앞니에 접착하여 코일을 고정합니다. 실험 기간 동안에는 더 이상의 재활성화가 수행되지 않습니다. 와이어를 절단하여 동력계에서 동물을 분리합니다.  장치의 금속 가장자리가 노출되지 않고 동물이 다치지 않도록 수지를 더 추가하십시오. 30초 동안 광 경화. 테이블에서 동물을 분해하십시오.
13. mesial 방향으로 0.35N의 힘을 가하는 장치가 있는 오른쪽 상단의 첫 번째 어금니는 실험면으로 구성됩니다. 상악의 왼쪽(교정 장치 없음)을 대조군 ^4,16으로 사용합니다.
14. 활성화할 필요 없이 12일 동안 이 장치를 유지 관리하십시오. 진통제를 사용하지 마십시오. 교정 운동은 염증 과정을 통해 발생하며 통증 완화 약물은 아라키돈산 캐스케이드에 부정적인 영향을 미쳐 뼈 리모델링 속도에 영향을 미치고 잠재적으로 결과를 무효화할 수 있습니다.
15. 수술이 끝난 후에는 장치에 적응하는 기간 동안 탈수를 피하기 위해 식염수 피하 주사로 동물을 치료하십시오. 완전히 회복될 때까지 동물을 가열하여 개별 케이지에 보관하고 이 기간이 지난 후에만 동물을 집단 케이지에 넣으십시오.
16. 12^일째 되는 날에 자일라진(10mg/Kg)과 케타민(100mg/Kg)이 함유된 0.2mL 용액을 복강내 주사로 진정시킨 후 날카로운 가위로 목을 베는 방식으로 생쥐를 안락사시켰다.

2. Micro-CT 측정

1. 날카로운 가위로 상악골을 채취하여 모든 연조직, 시상면의 접합골, 관상면의 전두골 봉합사와 접두-후두부 싱크로시스를 채취합니다. 상악골을 10% 중성 완충 포르말린(pH=7.4)에 48시간의 고정 기간 동안 담그십시오. 이 기간이 지나면 포름알데히드 용액을 70% 알코올로 변경하십시오.
2. 고해상도 스캔을 위해 9 - 18 μm의 등방성 복셀 크기, 50 kV의 X선 설정, 0.5 mm 알루미늄 필터 및 0.5°의 회전 각도를 사용하여 상악골의 micro-CT 스캔을 수행합니다. microCT 스캔 중에 하나 이상의 턱이 들어갈 수 있습니다.
3. 사용된 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(microCT)의 제조업체가 지시한 마이크로단층 촬영 재구성 프로그램을 사용하여 획득한 이미지를 재구성¹⁷.
4. 사용된 마이크로단층 촬영 제조업체에서 지정한 3D 검사 프로그램을 사용하여 복원된 이미지를 배치합니다.
5. 좌측 반악골(대조측)에 대한 우측 반상악골(OTM 측)의 첫 번째 및 제2 대구치의 시멘트-법랑질 접합부(CEJ) 사이의 선형 거리 차이를 측정하여 OTM을 정량화합니다. 이 측정 17,18,19,20을 위한 라인 도구와 함께 적절한 microCT 분석기 소프트웨어를 활용하십시오.
6. 교정 유도 염증성 뿌리 흡수(OIIRR)의 존재 여부를 검체에서 확인하십시오. 수동으로 그려진 불규칙한 해부학적 관심 영역을 사용하여 첫 번째 상악 어금니의 원위-전정근의 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 다음 매개변수를 측정합니다: 뿌리 미네랄 밀도(RMD; g/cm³) 및 총 부피당 뿌리 부피의 백분율(RV/TV; %). 이 측정을 위해 3D 체적 도구와 함께 적절한 microCT 분석기 소프트웨어를 사용하십시오^16,21.
7. Mimics 소프트웨어를 사용하여 첫 번째 상악 어금니의 재건을 수행하고 얻은 데이터를 분석하여 실험 모델^16,21에서 OTM 및 OIIRR에 대한 결론을 도출합니다.

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결과

이 프로토콜을 사용하면 NiTi 코일 스프링을 사용하여 OTM 마우스 모델을 조사할 수 있습니다. 0.35N의 힘이 가해졌을 때, 첫 번째와 두 번째 어금니 사이의 대조군 측의 평균 CEJ 거리는 243.69 μm(그림 1A, 라인 A)인 반면, OTM 측에서는 284.66 μm(그림 1A, 라인 B)로 측정되었습니다. OTM과 대조군의 차이는 40.97μm였습니다 (그림 1B).

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토론

여기에서는 OTM 중 뼈 리모델링의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 설명하기 위해 고안된 표준화된 프로토콜에 대해 설명합니다. 생쥐에서 이러한 메커니즘을 철저히 이해하려면 정확성과 신뢰성을 보장하기 위해 꼼꼼하게 계획된 프로토콜이 필요합니다 ^7,11. 우리 연구 그룹에서 수행한 연구에 따르면 이 프로토콜은 장력 게이지와 특별히 설계된 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A