Изучение ортодонтического движения зубов у мышей

Резюме

В данной работе мы представляем протокол изучения ортодонтического движения зубов (ОТМ), служащий подходящей моделью для исследования механизмов адаптации кости, резорбции корней и реакции костных клеток на механические раздражители. В этом всеобъемлющем руководстве содержится подробная информация о модели OTM, получении данных микрокомпьютерной томографии и последующем анализе.

Аннотация

Ортодонтическое движение зубов (ОТМ) представляет собой динамический процесс, при котором альвеолярная кость подвергается резорбции в местах компрессии и отложению в местах натяжения, управляемой остеокластами и остеобластами соответственно. Этот механизм служит ценной моделью для изучения различных аспектов костной адаптации, включая резорбцию корней и клеточную реакцию на механические силовые стимулы. Описанный здесь протокол предлагает простой подход к исследованию OTM, устанавливая 0,35 Н в качестве оптимальной силы в модели мыши, использующей никель-титановую (NiTi) винтовую пружину. Используя микрокомпьютерный томографический анализ, мы количественно оценили OTM, оценив расхождение в линейном расстоянии на стыке цемент-эмаль. Оценка также включала анализ ортодонтической воспалительной резорбции корня, оценку таких параметров, как минеральная плотность корня и процент объема корня к общему объему. Этот комплексный протокол способствует углублению нашего понимания процессов ремоделирования костей и расширению возможностей разработки эффективных стратегий ортодонтического лечения.

Введение

Ремоделирование кости — это непрерывный процесс, управляемый остеокластами, остеобластами, клетками костной выстилки и остеоцитами, необходимый для поддержания целостности скелета взрослого человека ^1,2. В первую очередь обусловленный дифференцировкой и активностью остеокластов и остеобластов, этот динамический процесс включает резорбцию и отложение кости, вызванное механическим напряжением и нагрузкой ^3,4,5.

Эксперименты на животных играют ключевую роль в выяснении сложных биологических и клеточных механизмов, лежащих в основе ортодонтического движения зубов (ОТМ)^6,7. Этот процесс включает в себя различные типы клеток, такие как остеобласты, остеокласты, остеоциты, фибробласты и иммунные клетки, такие как макрофаги и Т-клетки, расположенные в челюстной кости и периодонтальной связке ^7,8. Эти клетки динамически реагируют на механические раздражители и изменения в местной среде, влияя на состав и архитектуру окружающей кости ^7,8. Более того, они также вызывают воспалительную реакцию на клеточном уровне, даже если патогены отсутствуют. Эта воспалительная реакция играет роль в увеличении обновления костной ткани⁹.

Различные животные модели, включая мышей, крыс, кроликов, собак и обезьян, были использованы в экспериментальных исследованиях OTM ^7,8,10. Среди них грызуны, особенно мыши, предпочитают исследовать начальные фазы движения зубов и ремоделирования костей⁶. В предыдущих исследованиях подчеркивались преимущества использования мышиных моделей по сравнению с крысиными моделями, в первую очередь из-за широкой доступности генетически модифицированных штаммов, что позволяет детально изучить генетические влияния в OTM ^7,11. В настоящее время используются две основные модели для стимуляции движения зубов у мышей. Первый способ заключается во введении никель-титановой (NiTi) винтовой пружины между первым верхним моляром и верхними резцами ^4,12. Второй подход заключается в размещении эластичной ленты в межзубном пространстве между первым и вторым верхними молярами¹³. К основным анализируемым исходам обычно относятся величина движения зуба и микроархитектура кости, предпочтительно оцениваемые с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ)¹⁴. В идеале оценка целостности корней зубов важна для обеспечения того, чтобы для производства OT^M4 были приложены соответствующие усилия.

В то время как микро-КТ широко признана в качестве золотого стандарта для оценки микроархитектуры минерализованных тканей¹⁴, отсутствие стандартизированных методологий и протоколов для сканирования, анализа и представления данных часто создает проблемы в определении точных используемых процедур, интерпретации результатов и облегчении сравнения между различными моделями OTM^14,15.

Здесь мы представляем пошаговое руководство по мышиной модели OTM, включая получение микрокомпьютерной томографии и анализ OTM, микроструктуры кости и корней зубов. Этот метод включает в себя приложение контролируемой механической силы к первому коренному зубу, чтобы вызвать движение внутри челюстной кости. Выбор этого метода обусловлен несколькими факторами, включая осуществимость, актуальность и точность. Такой подход позволяет проводить детальный количественный анализ, предоставляя ценную информацию о биологических процессах, лежащих в основе ортодонтического движения зубов, и способствуя разработке улучшенных стратегий ортодонтического лечения в будущем.

протокол

Все процедуры строго соблюдались в соответствии с этическими нормами, установленными Комитетом по этике Федерального университета штата Минас-Жерайс (No 166/2022). Перед каждым экспериментом в обязательном порядке проводится расчет размера выборки. Используйте 8-10-недельных самцов мышей дикого типа C57BL6/J весом примерно 20-30 г. Мыши должны содержаться в клетке в помещении, где поддерживается температура 25 °C, с соблюдением цикла 12 часов света / 12 часов в темноте. После прикрепления катушки животное следует кормить щадящим кормом. Ежедневный мониторинг должен включать оценку массы тела и общего состояния здоровья.

1. Механически индуцированное ремоделирование альвеолярной кости

1. Используя плоскогубцы для дистального среза, отрежьте пружину NiTi размером 0,25 x 0,76 дюйма до следующих размеров: шесть петель и два петлевых конца, расположенных перпендикулярно пружине, с помощью ортодонтических плоскогубцев Вайнгарта.
2. Придайте желаемую форму круглой хромоникелевой (CrNi) проволоке диаметром 0,20 мм с петлеобразными концами с помощью пинцета Матье и круглого инструмента в качестве эталонного размера.
3. Соедините петлеобразные концы катушки и круглую проволоку CrNi диаметром 0,20 мм.
4. Обезболите животное путем внутрибрюшинной инъекции 0,2 мл раствора, содержащего ксилазин (10 мг/кг) и кетамин (100 мг/кг). Перед началом процедуры оцените глубину анестезии с помощью педального рефлекса. Осторожно зажмите один из пальцев ноги животного с помощью пинцета. Отсутствие рефлекса свидетельствует об адекватной плоскости общего наркоза. Чтобы избежать травм роговицы и послеоперационных болей, наносите глазную смазку после того, как животное будет обезболито.
5. Расположите животное в положении спинного пролежня на операционном столе, обездвижив его конечности, чтобы ограничить движения и обеспечить внутриротовой доступ.
6. Используйте открыватель для рта, изготовленный из проволоки диаметром 0,50 мм и закрепленный проволокой 0,08 мм, чтобы обеспечить полную визуализацию и предотвратить движение головы. Используйте правую сторону в качестве экспериментальной стороны (сторона OTM) и левую сторону в качестве контрольной без ортодонтической катушки (контрольная сторона).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Улучшенная визуализация внутриротовых структур должна быть достигнута с помощью стереомикроскопа и оптической световой системы.
7. Очистите и протравите правые поверхности первого моляра и резцов с помощью ацетона и самопротравливающей грунтовки соответственно. Система является самопротравливающейся, то есть не требует предварительного кислотного кондиционирования.
   1. Нанесите грунтовку за один этап, которая также действует одновременно как кислота и адгезив. С помощью микрощетки соберите небольшое количество самопротравливающего праймера и нанесите его на окклюзионную поверхность верхнего первого моляра и резцы. На этом этапе необходимо соблюдать осторожность, чтобы самопротравливающийся праймер не достигал проксимальной поверхности между первым и вторым молярами, так как это может привести к слипанию зубных элементов, препятствуя смещению зубов. Световое отверждение праймера на окклюзионной поверхности коренных зубов и резцов в течение 30 с.
8. Приклейте дистальный конец шестипетлевой никель-ниевой пружины с открытой спиралью к окклюзионной поверхности правого первого верхнечелюстного коренного зуба светоотверждаемой смолой и легким отверждением в течение 30 с. Добавьте дополнительный прирост смолы на край проволоки, чтобы избежать вреда для мышей и отверждение светом в течение 30 с.
9. Активируйте катушку с помощью специально разработанного аппарата, состоящего из рельса и кривошипного механизма, прикрепленного к операционному столу. Это позволяет продольному движению скользить вперед и назад.
10. Подсоедините свободный петлеобразный конец круглого провода диаметром 0,20 мм к крючку натяжного манометра.
11. После активации кривошипа перемещайте хирургический стол вдоль рельса до тех пор, пока динамометр не зарегистрирует усилие 0,35 Н.
12. Прикрепите круглую проволоку 0,20 мм к обоим верхним резцам, чтобы закрепить катушку. В течение экспериментального периода дальнейшая реактивация не производится. Перережьте проволоку, чтобы отсоединить животное от динамометра.  Добавьте еще немного смолы, чтобы металлическая кромка устройства не оголялась и не причиняла вреда животному. Легкое отверждение за 30 с. Разберите животное со стола.
13. Верхний правый первый моляр с устройством, накладывающим усилие 0,35 Н в мезиальном направлении, состоит из экспериментальной стороны. Используйте левую сторону верхней челюсти (без ортодонтического аппарата) в качестве контрольной ^4,16.
14. Обслуживайте это устройство в течение 12 дней без необходимости активации. Не используйте обезболивающие препараты. Ортодонтическое движение происходит в результате воспалительного процесса, и обезболивающие препараты могут негативно повлиять на каскад арахидоновой кислоты, влияя на скорость ремоделирования кости и потенциально сводя на нет результаты.
15. После окончания операции обработайте животных подкожной инъекцией физиологического раствора, чтобы избежать обезвоживания в период адаптации к устройству. Содержат животное в индивидуальной клетке с подогревом до полного выздоровления и только по истечении этого срока помещают животное в коллективные клетки.
16. Усыпить мышь на^12-е сутки путем введения седативного эффекта с внутрибрюшинным введением раствора в дозе 0,2 мл, содержащего ксилазин (10 мг/кг) и кетамин (100 мг/кг), с последующей обезглавливанием острыми ножницами.

2. Микрокомпьютерная томография

1. Острыми ножницами забирают верхнечелюстную кость, разрезая все мягкие ткани, скуловую кость в сагиттальной плоскости, лобно-мозговой шов и сфено-затылочный синхондроз в корональной плоскости. Погрузите верхнечелюстную кость в 10% нейтральный буферный формалин (pH=7,4) на период фиксации 48 ч. По истечении этого срока смените раствор формальдегида на 70% спирт.
2. Для сканирования высокого разрешения выполняют микрокомпьютерную томографию верхнечелюстной кости со следующими параметрами: размер изотропных вокселей от 9 до 18 мкм, настройки рентгеновского излучения 50 кВ, алюминиевый фильтр 0,5 мм, угол поворота 0,5°. Во время микрокомпьютерной томографии может быть установлено более одной челюсти.
3. Реконструировать полученные изображения с помощью программы микротомографии, указанной производителем используемого микрокомпьютерного томографа (микрокомпьютерной томографии)¹⁷.
4. Расположите восстановленные изображения с помощью программы 3D Inspection, указанной производителем используемого микротомографа.
5. Количественно оцените OTM путем измерения разницы в линейном расстоянии между цементно-эмалевым соединением (CEJ) первого и второго моляров правой геми-верхней челюсти (сторона OTM) относительно левой геми-верхней челюсти (контрольная сторона). Используйте подходящее программное обеспечение для анализа микрокомпьютерной томографии с линейным инструментом для этого измерения 17,18,19,20.
6. Проверьте образцы на наличие ортодонтической воспалительной резорбции корней (OIIRR). Выберите область интереса (ROI) дисто-вестибулярного корешка первого верхнечелюстного моляра с помощью неправильной анатомической области интереса, нарисованной вручную методом контурной пластики. Измерьте следующие параметры: минеральную плотность корней (RMD; г/^см3) и процентное соотношение объема корня к общему объему (RV/TV; %). Используйте подходящее программное обеспечение для анализа микрокомпьютерной томографии с 3D-инструментом для измерения^16,21.
7. Провести реконструкцию первого верхнечелюстного моляра с помощью программного обеспечения Mimics и проанализировать полученные данные для того, чтобы сделать выводы относительно OTM и OIIRR в экспериментальной модели^16,21.

Результаты

Этот протокол позволяет исследовать модель мыши OTM с помощью винтовой пружины NiTi. При приложении силы 0,35 Н среднее расстояние CEJ на контрольной стороне между первым и вторым молярами составило 243,69 мкм (рис. 1A, линия A), тогда как на стороне OTM оно было измерено на уровне 284,66 ...

Обсуждение

В этой статье мы описываем стандартизированный протокол, разработанный для выяснения клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе ремоделирования кости во время ОТМ. Глубокое понимание этих механизмов у мышей требует тщательно спланированного протокола для обеспечения точ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A