量化 黑腹果蝇 眼睛表型：一种整合 ilastik 和 Flynotyper 的计算方法

Summary

果蝇眼系统是研究各种生物过程的有用工具，尤其是人类神经退行性疾病。然而，粗眼表型的手动定量可能存在偏差且不可靠。在这里，我们描述了一种使用 ilastik 和 Flynotyper 以无偏倚的方式量化眼睛表型的方法。

Abstract

黑腹果蝇复眼是一个结构良好且全面的阵列，由大约 800 个 ommatidia 组成，呈现出对称的六边形图案。这种规律性和易于观察性使果蝇眼系统成为模拟各种人类神经退行性疾病的有力工具。然而，量化异常表型的方法，例如对眼睛严重程度评分进行手动排序，具有局限性，尤其是在对眼睛形态的微弱改变进行排名时。为了克服这些限制，已经开发了计算方法，例如 Flynotyper。使用环形灯可以获得更好的定性图像，从而获得单个 omatidia 的完整性。但是，由于环形光引入的 ommatidia 上的阴影，Flynotyper 无法直接分析这些图像。在这里，我们描述了一种无偏的方法，通过结合 ilastik 和 Flynotyper 两种软件来量化在果蝇疾病模型中观察到的粗糙眼睛表型。通过使用 ilastik 预处理图像，可以使用 Flynotyper 成功量化粗糙的眼睛表型。

Introduction

黑腹果蝇基因组包含 ~75% 的人类疾病相关基因直系同源物。此外，在果蝇眼睛发育过程中，基因组中大约三分之二的基因被表达，使果蝇眼睛成为研究各种分子和细胞功能、发育和疾病模型的出色遗传系统 ^1,2。因此，果蝇眼系统是研究各种生物过程的有用实验工具。

果蝇复眼是一个结构良好且全面的 ~800 个 ommatidia 阵列，呈现对称的六边形图案³。这种六边形模式的规律性可用于估计在眼睛形态中引入突变和基因表达变化的影响⁴。以前需要评估眼睛形态的研究严重依赖肉眼检测到的眼睛表型严重程度的人工排序。为了对眼睛表型进行排名，通过立体显微镜拍摄外部眼睛形态图像 ^5,6。通过将外眼分成四个区域并计算每个区域的变性比例来评估每组的眼睛表型 ^5,6。然后，这些值用于计算平均值，这些平均值与从对照苍....

Protocol

1. 准备定量

1. 下载并安装 ilastik¹¹、ImageJ 和 ImageJ 插件 Flynotyper¹。有关安装的网站链接，请参阅 材料表 。根据计算机操作系统（Mac、Windows、Linux 等）下载相应的软件包。完全按照说明进行操作。
   注意：必须严格按照提供的链接中的说明进行操作。使用的计算机需要 64 位操作系统;否则，没有其他必需的规范。有关用于此协议的系统的计算机规格，请参阅 材料表 。
2. 使用标准图像训练机器学习模型。使用带有环形光的光学显微镜（例如 w1118 x GMR-GAL4）拍摄健康苍蝇眼的图像，以眼睛中心为焦点。分别分析雄性和雌性;因此，请获取男性和女性的标准图像。
   注意：根据显微镜和相机的不同，设置会有很大差异。有关苍蝇制备和图像采集的更多一般信息，请参阅讨论中的第二段。
3. 使用与标准图像采集相同的设置拍摄实验苍蝇眼的图像。
   注：良好的方向对于准确定量至关重要。参见 图 4 作为正确方向的示例。

2. 使用 ilastik ....

Discussion

果蝇的 ommatidia 构成了研究各种生物学功能和遗传疾病的有用系统。ommatidia 的规律性是检查基因突变影响的良好衡量标准⁴。尽管存在几种计算 ommatidial 规律性的方法，例如手动排序，但这些方法可能会有很大偏差。为了克服这种偏颇的方法，已经开发了半自动工具 ^1,11。

为了准确?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.