量化 黑腹果蝇 眼睛表型：一种整合 ilastik 和 Flynotyper 的计算方法

摘要

果蝇眼系统是研究各种生物过程的有用工具，尤其是人类神经退行性疾病。然而，粗眼表型的手动定量可能存在偏差且不可靠。在这里，我们描述了一种使用 ilastik 和 Flynotyper 以无偏倚的方式量化眼睛表型的方法。

摘要

黑腹果蝇复眼是一个结构良好且全面的阵列，由大约 800 个 ommatidia 组成，呈现出对称的六边形图案。这种规律性和易于观察性使果蝇眼系统成为模拟各种人类神经退行性疾病的有力工具。然而，量化异常表型的方法，例如对眼睛严重程度评分进行手动排序，具有局限性，尤其是在对眼睛形态的微弱改变进行排名时。为了克服这些限制，已经开发了计算方法，例如 Flynotyper。使用环形灯可以获得更好的定性图像，从而获得单个 omatidia 的完整性。但是，由于环形光引入的 ommatidia 上的阴影，Flynotyper 无法直接分析这些图像。在这里，我们描述了一种无偏的方法，通过结合 ilastik 和 Flynotyper 两种软件来量化在果蝇疾病模型中观察到的粗糙眼睛表型。通过使用 ilastik 预处理图像，可以使用 Flynotyper 成功量化粗糙的眼睛表型。

引言

黑腹果蝇基因组包含 ~75% 的人类疾病相关基因直系同源物。此外，在果蝇眼睛发育过程中，基因组中大约三分之二的基因被表达，使果蝇眼睛成为研究各种分子和细胞功能、发育和疾病模型的出色遗传系统 ^1,2。因此，果蝇眼系统是研究各种生物过程的有用实验工具。

果蝇复眼是一个结构良好且全面的 ~800 个 ommatidia 阵列，呈现对称的六边形图案³。这种六边形模式的规律性可用于估计在眼睛形态中引入突变和基因表达变化的影响⁴。以前需要评估眼睛形态的研究严重依赖肉眼检测到的眼睛表型严重程度的人工排序。为了对眼睛表型进行排名，通过立体显微镜拍摄外部眼睛形态图像 ^5,6。通过将外眼分成四个区域并计算每个区域的变性比例来评估每组的眼睛表型 ^5,6。然后，这些值用于计算平均值，这些平均值与从对照苍蝇⁷ 获得的值进行比较。评分基于融合程度、钌毛丢失和刷毛组织 ^7,8。用立体显微镜拍摄的苍蝇眼照片由一名研究人员获取，眼睛表型分析由另一名研究人员使用三重验证集进行 ^7,8。

在用肉眼对眼睛形态的微弱变化进行排名时，有局限性⁴.为了克服这些限制，已经开发了 FLEYE 和 Flynotyper 等计算方法 ^1,9。Flynotyper 是一种用于定量估计果蝇眼系统形态变化的新型计算方法¹。它会自动检测果蝇的眼睛和单个 ommatidium，根据眼睛的不规则性计算表型评分 （P 分数） ¹。较高的 P 分数表明苍蝇眼更退化。该软件已成功用于量化果蝇眼睛的异常¹⁰。尽管 Flynotyper 确保了自动化过程，但它仍然无法成功应用于通过各种光学显微镜方法拍摄的某些眼睛图像。

从定性上讲，与单点光源相比，我们更喜欢环形光源，因为它可以更准确地表示每个 ommatidium。然而，当使用环形灯时，由于 ommatidium 的半球形形状，它会在每个 ommatidium 的顶部产生一个环形阴影。这个环形阴影会抑制 Flynotyper 的准确 ommatidial 检测，从而导致 P 分数的计算错误。

为了克服这些问题，我们实施了 ilastik，这是一种基于机器学习的工具，用于各种分析，用于对苍蝇眼图像中的 ommatidia 进行分类¹¹。然后，我们将 ilastik 生成的图像馈送到 Flynotyper 中以计算 P 分数。这使我们能够无偏倚地量化 果蝇 眼睛的形态缺陷¹.

研究方案

1. 准备定量

1. 下载并安装 ilastik¹¹、ImageJ 和 ImageJ 插件 Flynotyper¹。有关安装的网站链接，请参阅 材料表 。根据计算机操作系统（Mac、Windows、Linux 等）下载相应的软件包。完全按照说明进行操作。
   注意：必须严格按照提供的链接中的说明进行操作。使用的计算机需要 64 位操作系统;否则，没有其他必需的规范。有关用于此协议的系统的计算机规格，请参阅 材料表 。
2. 使用标准图像训练机器学习模型。使用带有环形光的光学显微镜（例如 w1118 x GMR-GAL4）拍摄健康苍蝇眼的图像，以眼睛中心为焦点。分别分析雄性和雌性;因此，请获取男性和女性的标准图像。
   注意：根据显微镜和相机的不同，设置会有很大差异。有关苍蝇制备和图像采集的更多一般信息，请参阅讨论中的第二段。
3. 使用与标准图像采集相同的设置拍摄实验苍蝇眼的图像。
   注：良好的方向对于准确定量至关重要。参见 图 4 作为正确方向的示例。

2. 使用 ilastik 从苍蝇眼图像中检测 ommatidia

1. 在开始分析之前，请确保所有实验组（无论实验条件如何）都在同一个文件夹中，以简化以下过程。确保文件命名正确，以识别实验组并区分男性和女性。
   注意：我们建议打印出协议并使用计算机放大图表，因为该协议最容易在视觉上遵循。
2. 打开软件。
   注意： 建议在运行软件时不要打开其他应用程序;否则，计算机可能会运行得非常慢，尤其是在较旧或不太可靠的系统中。
3. 单击 Create New Project |其他工作流程，选择 细胞密度计数，然后选择保存项目文件的位置（图 1A）。
4. 点击 1。输入数据 |新增 |添加单独的图像。选择标准图像（图 1B）。
5. 点击 2.Feature Selection 并选择要使用的功能。选择 图 1C 中所示的功能;选择更多的 Sigma 值以提高灵敏度（即 10、15、20 等）。
   注意：如果选中的框过多，程序可能会运行很长时间。
6. 点击 3.计数 ，然后将 Foreground sigma 值设置为 5.00。使用 “前景 ”工具在标准图像上标记 50 个或更多单独的 ommatidium。
   注意：50 个标记通常足以进行分析;然而，标记的 ommatidia 越多，结果就越准确（图 1D）。
7. 点击 3.计数 并使用 背景 工具标记 ommatidia 的外部（图 1E）。在 ommatidia 周围画出格子形状的绿线。
   注意：与 ommatidia 上的标记更多类似，绘制的绿线越多，结果就越准确。
8. 点击 4。密度导出 |选择 Export Image Settings （导出图像设置 ） 以设置图像设置（图 1F）。单击 Output File Info | 选择 Format 和 tif 以在 Flynotyper 中进行进一步分析。
9. 点击 5。批处理 |选择原始数据文件 并选择要分析的所有实验苍蝇照片（图 1G）。要分析的导入图像列表在 “选择原始数据文件 ”下看到（图 1H）。点击 处理所有文件 在 底部 5.Batch Processing 部分。
   注意：提醒一下，雄性和雌性分析应分别进行。根据所使用的计算机，此步骤可能需要 10 分钟或更长时间，尤其是在导入许多图像时。
10. 软件完成后，检查包含实验蝇眼图像的相同文件夹;将有名为 “YourSampleName_Probabilities” 的黑色图像（图 1I）。

3. 使用 ImageJ 为 Flynotyper 准备照片

1. 在 ImageJ 中打开 ilastik 生成的 .tif 文件（黑框）。
   注意：每个 ilastik 生成的 .tif 文件都需要单独处理。
2. 使用 矩形选择 工具在眼睛周围创建一个矩形。绘制矩形后，通过选择 Ctrl + X 或 Ctrl + C 裁剪区域（图 2A）。等待矩形轮廓形状的黑框出现。
   注意： 计算机操作系统将决定是使用 'Ctrl + X' 还是 'Ctrl + C'。通常，“Ctrl + X”适用于 Windows，“Ctrl + C”用于 Mac。
3. 使用 ImageJ 打开现在切割的苍蝇眼;点击 文件 |新品 |内部剪贴板 （图 2B）。
4. 通过单击文件 |另存为 |Jpeg 格式。剪切的图像现在与原始实验图像位于同一文件夹中。
   注意：为了简化下一步，建议创建一个名为 'cut' 的新文件夹，并将所有剪切的图像放入该文件夹中。

4. 使用 Flynotyper 计算表型评分

1. 通过单击 插件 |Flynotyper.
2. 选择 Add Genotypes 并打开包含剪切的 fly eye 图像的文件夹（剪切文件夹）。文件夹名称将出现在 基因型 下（图 2C）。
3. 选中 Light microscope 和 Vertically 框，但根据需要进行相应调整。检查 Rank Ommatidia 下的 Stability 和 Distance to the Center 框：（图 2C）。
4. 对于 Number of ranked ommatidia considered （考虑的排名 ommatidia 数量），输入 200。
   注意：一般来说，200 是一个不错的数字，但请根据偏好进行相应调整。
5. 单击 Run 并等待分析结果出现（图 2D）。
   注意：此步骤可能需要 5 分钟或更长时间（或更短），具体取决于所用计算机的处理能力。
6. 将 样品文件 和 P 分数 复制并粘贴到统计软件中，以便进一步分析。

结果

在之前的一项研究中，我们使用该方案来确定与肌萎缩侧索硬化症伴额颞叶痴呆 （ALS-FTD） 相关的突变 VCP 蛋白的遗传修饰物¹²。此外，该方法还在另一篇论文中用于评估 CHCHD10^S59L 介导的 ALS-FTD 的毒性，即使使用较旧的立体显微镜¹³。为了进一步验证这些结果，我们在与 Baek 等人相同的 ALS-FTD 疾病突变中使用了 ilastik 和

讨论

果蝇的 ommatidia 构成了研究各种生物学功能和遗传疾病的有用系统。ommatidia 的规律性是检查基因突变影响的良好衡量标准⁴。尽管存在几种计算 ommatidial 规律性的方法，例如手动排序，但这些方法可能会有很大偏差。为了克服这种偏颇的方法，已经开发了半自动工具 ^1,11。

为了准确?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.