Drosophila melanogaster 눈 표현형 정량화: ilastik과 Flynotyper를 통합하는 계산적 접근 방식

요약

초파리 안구 시스템은 다양한 생물학적 과정, 특히 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 거친 눈 표현형의 수동 정량화는 편향되어 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 여기에서는 ilastik과 Flynotyper를 사용하여 편견 없는 방식으로 눈 표현형을 정량화하는 방법을 설명합니다.

초록

Drosophila melanogaster compound eye는 대칭 및 육각형 패턴을 나타내는 약 800개의 ommatidia로 구성된 잘 구조화되고 포괄적인 배열입니다. 이러한 규칙성과 관찰의 용이성으로 인해 Drosophila eye system은 다양한 인간 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 강력한 도구입니다. 그러나 눈 심각도 점수의 수동 순위와 같은 비정상적인 표현형을 정량화하는 방법은 특히 눈 형태학의 약한 변화를 순위를 매길 때 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 Flynotyper와 같은 계산 접근 방식이 개발되었습니다. 링 라이트를 사용하면 개별 옴마티디아의 온전함에 접근하는 더 나은 질적 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 이미지는 링 라이트에 의해 도입된 옴마티디아의 그림자로 인해 Flynotyper에서 직접 분석할 수 없습니다. 여기에서는 ilastik과 Flynotyper라는 두 가지 소프트웨어를 결합하여 초파리 질병 모델에서 관찰된 거친 눈 표현형을 편향되지 않게 정량화하는 방법을 설명합니다. ilastik으로 이미지를 전처리하면 Flynotyper로 거친 눈 표현형을 성공적으로 정량화할 수 있습니다.

서문

Drosophila melanogaster 게놈은 인간 질병 관련 유전자 orthologs의 ~ 75 %를 포함합니다. 또한 초파리 눈 발달 중에는 게놈 유전자의 약 2/3가 발현되어 초파리 눈은 다양한 분자 및 세포 기능, 발달 및 질병 모델을 조사하는 뛰어난 유전 시스템입니다 ^1,2. 따라서 초파리의 눈 시스템은 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 유용한 실험 도구입니다.

Drosophila 겹눈은 대칭적이고 육각형 패턴을 나타내는 ~ 800 개의 옴 마티 디아 (ommatidia)의 잘 구조화되고 포괄적 인 배열입니다³. 이 육각형 패턴의 규칙성은 눈 형태에서 돌연변이 및 유전자 발현 변화의 영향을 추정하는 데 사용될 수 있다⁴. 눈 형태 평가가 필요한 이전 연구는 육안으로 감지된 눈 표현형의 중증도에 대한 수동 순위에 크게 의존했습니다. 눈 표현형의 순위를 매기기 위해, 외부 눈 형태학 이미지는 실체현미경

프로토콜

1. 정량화 준비

1. ilastik¹¹, ImageJ 및 ImageJ 플러그인 Flynotyper¹을 다운로드하여 설치합니다. 설치에 대한 웹 사이트 링크에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 컴퓨터 운영 체제(Mac, Windows, Linux 등)에 따라 적절한 패키지를 다운로드합니다. 명시된 대로 설치 지침을 정확히 따르십시오.
   알림: 제공된 링크에 명시된 대로 지침을 정확히 따르는 것이 중요합니다. 사용하는 컴퓨터에는 64비트 운영 체제가 필요합니다. 그렇지 않으면 다른 필수 사양이 없습니다. 이 프로토콜에 사용되는 시스템의 컴퓨터 사양에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
2. 표준 이미지를 사용하여 기계 학습 모델을 학습시킵니다. 눈의 중심을 초점으로 사용하여 링 라이트가 있는 광학 현미경(예: w1118 x GMR-GAL4)을 사용하여 건강한 파리 눈의 이미지를 촬영합니다. 남성과 여성을 별도로 분석하십시오. 따라서 남성과 여성에 대한 표준 이미지를 획득하십시오.
   알림: 설정은 현미경과 카메라에 따라 크게 다릅니....

토론

초파리의 옴마티디아는 다양한 생물학적 기능과 유전 질환을 연구하는 데 유용한 시스템으로 구성됩니다. 옴마티디아의 규칙성은 유전적 돌연변이의 영향을 조사하기 위한 좋은 척도이다⁴. 수동 순위와 같이 ommatidial 규칙성을 계산하는 몇 가지 방법이 존재하지만 이러한 방법은 심하게 편향될 수 있습니다. 이러한 편향된 접근 방식을 극복하기 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.