Quantificazione dei fenotipi oculari di Drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e Flynotyper

Riepilogo

Il sistema oculare Drosophila è uno strumento utile per studiare vari processi biologici, in particolare le malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, la quantificazione manuale dei fenotipi dell'occhio ruvido può essere distorta e inaffidabile. Qui descriviamo un metodo con cui ilastik e Flynotyper vengono utilizzati per quantificare il fenotipo dell'occhio in modo imparziale.

Abstract

L'occhio composto di Drosophila melanogaster è una schiera ben strutturata e completa di circa 800 ommatidi, che presentano un andamento simmetrico ed esagonale. Questa regolarità e facilità di osservazione rendono il sistema oculare di Drosophila un potente strumento per modellare varie malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, i modi per quantificare i fenotipi anormali, come la classificazione manuale dei punteggi di gravità degli occhi, hanno dei limiti, specialmente quando si classificano le alterazioni deboli nella morfologia dell'occhio. Per superare queste limitazioni, sono stati sviluppati approcci computazionali come Flynotyper. L'uso di una luce anulare consente di ottenere immagini di migliore qualità che accedono all'integrità dei singoli ommatidi. Tuttavia, queste immagini non possono essere analizzate direttamente da Flynotyper a causa delle ombre sugli ommatidi introdotte dalla luce anulare. Qui, descriviamo un modo imparziale per quantificare i fenotipi dell'occhio ruvido osservati nei modelli di malattia di Drosophila combinando due software, ilastik e Flynotyper. Pre-elaborando le immagini con ilastik, è possibile ottenere una quantificazione di successo del fenotipo dell'occhio ruvido con Flynotyper.

Introduzione

Il genoma di Drosophila melanogaster contiene ~75% di ortologhi genici umani correlati alla malattia. Inoltre, durante lo sviluppo dell'occhio di Drosophila, vengono espressi circa due terzi dei geni nel genoma, rendendo l'occhio di Drosophila un sistema genetico eccezionale per studiare varie funzioni molecolari e cellulari, lo sviluppo e i modelli di malattia ^1,2. Pertanto, il sistema oculare di Drosophila è un utile strumento sperimentale per studiare vari processi biologici.

L'occhio composto di Drosophila....

Protocollo

1. Preparazione alla quantificazione

1. Scarica e installa ilastik¹¹, ImageJ e il plug-in ImageJ Flynotyper¹. Vedere la Tabella dei materiali per i collegamenti ai siti Web all'installazione. Scarica i pacchetti appropriati in base al sistema operativo del computer (Mac, Windows, Linux, ecc.). Seguire le istruzioni di installazione esattamente come indicato.
   NOTA: È indispensabile seguire le indicazioni esattamente come indicato nei link forniti. Il computer utilizzato necessita di un sistema operativo a 64 bit; In caso contrario, non ci sono a....

Discussione

Gli ommatidi di Drosophila costituiscono un sistema utile per lo studio di varie funzioni biologiche e malattie genetiche. La regolarità degli ommatidi è una buona misura per esaminare l'effetto delle mutazioni genetiche⁴. Anche se esistono diversi metodi per calcolare la regolarità ommatidiale, come la classificazione manuale, questi metodi possono essere fortemente distorti. Per superare questo approccio distorto, sono stati sviluppati strumenti semi.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.