Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Özet

Drosophila göz sistemi, özellikle insan nörodejeneratif hastalıkları olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, kaba göz fenotiplerinin manuel olarak ölçülmesi önyargılı ve güvenilmez olabilir. Burada, göz fenotipini tarafsız bir şekilde ölçmek için ilastik ve Flynotyper'ın kullanıldığı bir yöntemi açıklıyoruz.

Özet

Drosophila melanogaster bileşik göz, simetrik ve altıgen bir desen sergileyen, yaklaşık 800 ommatidiadan oluşan iyi yapılandırılmış ve kapsamlı bir dizidir. Bu düzenlilik ve gözlem kolaylığı, Drosophila göz sistemini çeşitli insan nörodejeneratif hastalıklarını modellemek için güçlü bir araç haline getirir. Bununla birlikte, göz şiddeti skorlarının manuel olarak sıralanması gibi anormal fenotipleri ölçme yollarının, özellikle göz morfolojisindeki zayıf değişiklikleri sıralarken sınırlamaları vardır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için Flynotyper gibi hesaplamalı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bir halka ışığının kullanılması, bireysel ommatidia'nın sağlamlığına erişen daha iyi kalitatif görüntüler sağlar. Bununla birlikte, bu görüntüler, halka ışığının neden olduğu ommatidia üzerindeki gölgeler nedeniyle doğrudan Flynotyper tarafından analiz edilemez. Burada, Drosophila hastalık modellerinde gözlenen pürüzlü göz fenotiplerini ölçmek için iki yazılımı, ilastik ve Flynotyper'ı birleştirerek tarafsız bir yol açıklıyoruz. Görüntülerin ilastik ile ön işlenmesiyle, Flynotyper ile kaba göz fenotipinin başarılı bir şekilde ölçülmesi sağlanabilir.

Giriş

Drosophila melanogaster genomu, insan hastalıklarıyla ilgili gen ortologlarının ~%75'ini içerir. Ek olarak, Drosophila göz gelişimi sırasında, genomdaki genlerin yaklaşık üçte ikisi eksprese edilir, bu da Drosophila gözünü çeşitli moleküler ve hücresel fonksiyonları, gelişimi ve hastalık modellerini araştırmak için olağanüstü bir genetik sistem haline getirir ^1,2. Bu nedenle, Drosophila göz sistemi, çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir deneysel araçtır.

Drosophila bileşik gözü, simetrik ve altıgen bir desen^sergileyen iyi yapılandırılmış ve kapsamlı bir ~ 800 ommatidia dizisidir 3. Bu altıgen desenin düzenliliği, göz morfolojisinde ortaya çıkan mutasyonların ve gen ekspresyon değişikliklerinin etkisini tahmin etmek için kullanılabilir⁴. Göz morfolojisinin değerlendirilmesini gerektiren önceki çalışmalar, çıplak gözle tespit edilen göz fenotiplerinin ciddiyetinin manuel sıralamasına büyük ölçüde dayanıyordu. Göz fenotiplerini sıralamak için dış göz morfolojisi görüntüleri stereomikroskop^{ile alınır 5,6}. Her grubun göz fenotipi, dış gözün dört alana bölünmesi ve her alandaki dejenerasyon oranının^{hesaplanması 5,6} ile değerlendirilir. Daha sonra değerler, kontrol sineklerinden⁷ elde edilen değerlerle karşılaştırılan ortalamaları hesaplamak için kullanılır. Puanlama, füzyon derecesine, ommatidia kaybına ve kıl organizasyonuna^{dayanmaktadır 7,8}. Stereomikroskop ile çekilen sinek gözü fotoğrafları bir araştırmacı tarafından elde edilir ve göz fenotip analizi başka bir araştırmacı tarafından üçlü validasyon setleri ^7,8 ile gerçekleştirilir.

Çıplak gözle göz morfolojisindeki zayıf değişikliklerin sıralanması söz konusu olduğunda, sınırlamalar vardır⁴. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için FLEYE ve Flynotyper gibi hesaplama yaklaşımları geliştirilmiştir ^1,9. Flynotyper, Drosophila göz sistemindeki morfolojik değişiklikleri kantitatif olarak tahmin etmek için yeni bir hesaplama yöntemidir¹. Gözün düzensizliğine göre Fenotipik Skorları (P-Skorları) hesaplayarak Drosophila gözünü ve bireysel ommatidyumu otomatik olarak algılar ¹. Daha yüksek bir P-Skoru, sinek gözünün daha dejenere olduğunu gösterir. Bu yazılım, Drosophila gözlerinin¹⁰ anormalliğini ölçmede başarıyla kullanıldı. Flynotyper otomatik bir işlem sağlamasına rağmen, çeşitli ışık mikroskobu yöntemleri ile çekilen bazı göz görüntülerine hala başarılı bir şekilde uygulanamamaktadır.

Niteliksel olarak, her bir ommatidyumun daha doğru bir temsilini sunduğu için tek noktalı bir ışık kaynağına kıyasla bir halka ışık kaynağını tercih ediyoruz. Bununla birlikte, halka ışık kullanıldığında, ommatidyumun yarım küre şeklindeki şekli nedeniyle her ommatidiumun tepesinde halka şeklinde bir gölge oluşturur. Bu halka şeklindeki gölge, Flynotyper tarafından doğru ommatidial algılamayı engelleyerek P-Skorlarının yanlış hesaplanmasına yol açar.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, sinek gözü görüntülerinde ommatidia'yı sınıflandırmak için çeşitli analizler için makine öğrenimi tabanlı bir araç olan ilastik'i uyguladık¹¹. Daha sonra P-Skorlarını hesaplamak için ilastik tarafından oluşturulan görüntüleri Flynotyper'a besledik. Bu, Drosophila göz morfolojik kusurlarını tarafsız bir şekilde ölçmemizi sağlar¹.

Protokol

1. Miktar tayini için hazırlanıyor

1. ilastik¹¹, ImageJ ve ImageJ eklentisi Flynotyper^1'i indirin ve yükleyin. Kurulumla ilgili web sitesi bağlantıları için Malzeme Tablosuna bakın. Bilgisayarın işletim sistemine (Mac, Windows, Linux vb.) göre uygun paketleri indirin. Kurulum talimatlarını tam olarak belirtildiği gibi izleyin.
   NOT: Verilen bağlantılarda belirtildiği gibi talimatlara tam olarak uyulması zorunludur. Kullanılan bilgisayarın 64 bit işletim sistemine ihtiyacı vardır; Aksi takdirde, başka gerekli özellikler yoktur. Bu protokol için kullanılan sistemin bilgisayar belirtimleri için Malzeme Tablosu'na bakın.
2. Makine öğrenmesi modelini eğitmek için standart bir görüntü kullanın. Gözün merkezini odak noktası olarak kullanarak, halka ışıklı (w1118 x GMR-GAL4 gibi) bir ışık mikroskobu kullanarak sağlıklı bir sinek gözünün görüntüsünü çekin. Erkekleri ve kadınları ayrı ayrı analiz edin; Bu nedenle, erkekler ve kadınlar için standart bir görüntü elde edin.
   NOT: Ayarlar, mikroskoba ve kameraya bağlı olarak büyük ölçüde değişecektir. Sinek hazırlığı ve görüntü elde etme hakkında daha genel bilgi için tartışmadaki ikinci paragrafa bakın.
3. Standart görüntü alımı için kullanılan ayarların aynısını kullanarak deneysel sinek gözlerinin görüntülerini çekin.
   NOT: Doğru niceleme için iyi yönlendirme çok önemlidir. Doğru yönlendirme için örnek olarak Şekil 4'e bakın.

2. Sinek gözü görüntülerinden ommatidia'yı tespit etmek için ilastik kullanma

1. Analize başlamadan önce, aşağıdaki işlemleri kolaylaştırmak için deney koşulundan bağımsız olarak tüm deney gruplarının aynı dosya klasöründe olduğundan emin olun. Deney gruplarını tanımlamak ve erkeklerle kadınları ayırt etmek için dosyaların uygun şekilde adlandırıldığından emin olun.
   NOT: Protokolü yazdırmanızı ve şekilleri yakınlaştırmak için bilgisayarı kullanmanızı öneririz, çünkü bu protokol görsel olarak en kolay şekilde takip edilir.
2. Yazılımı açın.
   NOT: Yazılımı çalıştırırken başka uygulamaların açık olmaması önerilir; Aksi takdirde, bilgisayar özellikle eski veya daha az sağlam sistemlerde çok yavaş çalışabilir.
3. Yeni Proje Oluştur'a tıklayın | Diğer İş Akışları, Hücre Yoğunluğu Sayımı'nı seçin ve proje dosyasını kaydetmek için bir konum seçin (Şekil 1A).
4. 1'e tıklayın. Giriş Verileri | Yeni Ekle | Ayrı resim(ler) ekleyin. Standart görüntüyü seçin (Şekil 1B).
5. 2'ye tıklayın. Özellik Seçimi ve kullanılacak özellikleri seçin. Şekil 1C'de gösterilen özellikleri seçin; Hassasiyeti artırmak için daha fazla sigma değeri seçin (yani, 10, 15, 20, vb.).
   NOT: Çok fazla kutu işaretlenirse, program uzun süre çalışabilir.
6. 3'e tıklayın. Sayma ve Ön Plan sigma değerini 5.00 olarak ayarlayın. Standart görüntüde Ön Plan aracını kullanarak 50 veya daha fazla bireysel ommatidiumu işaretleyin.
   NOT: Analiz için tipik olarak elli işaret yeterlidir; bununla birlikte, ommatidia ne kadar çok işaretlenirse, sonuçlar o kadar doğru olacaktır (Şekil 1D).
7. 3'e tıklayın. Ommatidia'nın dışını işaretlemek için Sayma ve Arka Plan aracını kullanın (Şekil 1E). Ommatidia'nın etrafına kafes şeklinde yeşil çizgiler çizin.
   NOT: Ommatidia üzerindeki daha fazla işarete benzer şekilde, ne kadar çok yeşil çizgi çizilirse, sonuçlar o kadar doğru olacaktır.
8. 4'e tıklayın. Yoğunluk Dışa Aktarma | Görüntü ayarlarını yapmak için Görüntü Ayarlarını Dışa Aktar'ı seçin (Şekil 1F). Çıktı Dosyası Bilgisi'ne tıklayın | Flynotyper'da daha fazla analiz için Format ve tif'i seçin.
9. 5'e tıklayın. Toplu İşleme | Ham Veri Dosyaları'nı seçin ve analiz edilecek tüm deneysel sinek fotoğraflarını seçin (Şekil 1G). Analiz edilecek içe aktarılan görüntülerin listesi, Ham Veri Dosyalarını Seç altında görülür (Şekil 1H). 5'in altındaki Tüm Dosyaları İşle'yi tıklayın. Toplu İşleme bölümü.
   NOT: Hatırlatmak gerekirse, erkek ve kadın analizleri ayrı ayrı yapılmalıdır. Kullanılan bilgisayara bağlı olarak, özellikle çok sayıda içe aktarılan görüntü varsa, bu adım 10 dakika veya daha uzun sürebilir.
10. Yazılım tamamlandıktan sonra, deneysel sinek gözü görüntülerini içeren aynı dosya klasörünü kontrol edin; "YourSampleName_Probabilities" adlı siyah görüntüler olacaktır (Şekil 1I).

3. Flynotyper için fotoğraf hazırlamak için ImageJ'yi kullanma

1. ilastik tarafından oluşturulan .tif dosyasını (kara kutular) ImageJ'de açın.
   NOT: ilastik tarafından oluşturulan her .tif dosyasının ayrı ayrı ele alınması gerekir.
2. Yalnızca gözün etrafında bir dikdörtgen oluşturmak için Dikdörtgen Seçimi aracını kullanın. Dikdörtgen çizildikten sonra, Ctrl + X veya Ctrl + C tuşlarını seçerek alanı kırpın (Şekil 2A). Dikdörtgen anahat şeklinde bir kara kutunun görünmesini bekleyin.
   NOT: Bilgisayarın işletim sistemi 'Ctrl + X' veya 'Ctrl + C' kullanılıp kullanılmayacağını belirleyecektir. Genellikle, 'Ctrl + X' Windows içindir ve 'Ctrl + C' Mac için kullanılır.
3. ImageJ kullanarak şimdi kesilmiş sinek gözünü açın; Dosya | Yeni | Dahili Pano (Şekil 2B).
4. Dosya | Farklı Kaydet | jpeg dosyasını açın. Kesilen görüntüler artık orijinal deneysel görüntülerle aynı dosya klasöründedir.
   NOT: Bir sonraki adımı kolaylaştırmak için, 'kes' adlı yeni bir dosya klasörü oluşturmanız ve kesilen tüm görüntüleri bu klasöre koymanız önerilir.

4. Fenotipik puanları hesaplamak için Flynotyper'ı kullanma

1. Eklentiler'e tıklayarak Flynotyper'ı bir ImageJ eklentisi olarak açın | Uçan çentik.
2. Genotip Ekle'yi seçin ve kesilmiş sinek gözü görüntülerini içeren klasörü açın (dosya klasörünü kes). Klasör adı Genotipler altında görünecektir (Şekil 2C).
3. Işık mikroskobu ve Dikey kutularını kontrol edin, ancak gerekirse buna göre ayarlayın. Rank Ommatidia altındaki Stabilite ve Merkeze Uzaklık kutularını şu şekilde kontrol edin: (Şekil 2C).
4. Dikkate alınan dereceli ommatidia sayısı için 200 girin.
   NOT: Genel olarak, 200 iyi bir sayıdır ancak tercihlere göre ayarlayın.
5. Çalıştır'a tıklayın ve analiz sonuçlarının görünmesini bekleyin (Şekil 2D).
   NOT: Bu adım, kullanılan bilgisayarın işlem gücüne bağlı olarak 5 dakika veya daha uzun (veya daha kısa) sürebilir.
6. Daha fazla analiz için Örnek Dosyayı ve P-Score'u kopyalayıp istatistiksel yazılıma yapıştırın.

Sonuçlar

Önceki bir çalışmada, frontotemporal demans (ALS-FTD) ile amyotrofik lateral skleroz ile bağlantılı mutant VCP proteininin genetik değiştiricilerini belirlemek için bu protokolü ^kullandık12. Ek olarak, bu yöntem, daha eski bir stereomikroskop¹³ kullanıldığında bile, CHCHD10^S59L aracılı ALS-FTD'nin toksisitesini değerlendirmek için başka bir makalede de kullanılmıştır. Bu sonuçları daha da doğrulamak i...

Tartışmalar

Drosophila'nın ommatidiası, çeşitli biyolojik fonksiyonları ve genetik hastalıkları incelemek için yararlı bir sistem içerir. Ommatidia'nın düzenliliği, genetik mutasyonların etkisini incelemek için iyi bir ölçümdür⁴. Ommatidiyal düzenliliği hesaplamak için manuel sıralama gibi çeşitli yöntemler mevcut olsa da, bu yöntemler büyük ölçüde önyargılı olabilir. Bu önyargılı yaklaşımın üstesinden gelmek için yarı otom...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.