Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Özet

Drosophila göz sistemi, özellikle insan nörodejeneratif hastalıkları olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, kaba göz fenotiplerinin manuel olarak ölçülmesi önyargılı ve güvenilmez olabilir. Burada, göz fenotipini tarafsız bir şekilde ölçmek için ilastik ve Flynotyper'ın kullanıldığı bir yöntemi açıklıyoruz.

Özet

Drosophila melanogaster bileşik göz, simetrik ve altıgen bir desen sergileyen, yaklaşık 800 ommatidiadan oluşan iyi yapılandırılmış ve kapsamlı bir dizidir. Bu düzenlilik ve gözlem kolaylığı, Drosophila göz sistemini çeşitli insan nörodejeneratif hastalıklarını modellemek için güçlü bir araç haline getirir. Bununla birlikte, göz şiddeti skorlarının manuel olarak sıralanması gibi anormal fenotipleri ölçme yollarının, özellikle göz morfolojisindeki zayıf değişiklikleri sıralarken sınırlamaları vardır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için Flynotyper gibi hesaplamalı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bir halka ışığının kullanılması, bireysel ommatidia'nın sağlamlığına erişen daha iyi kalitatif görüntüler sağlar. Bununla birlikte, bu görüntüler, halka ışığının neden olduğu ommatidia üzerindeki gölgeler nedeniyle doğrudan Flynotyper tarafından analiz edilemez. Burada, Drosophila hastalık modellerinde gözlenen pürüzlü göz fenotiplerini ölçmek için iki yazılımı, ilastik ve Flynotyper'ı birleştirerek tarafsız bir yol açıklıyoruz. Görüntülerin ilastik ile ön işlenmesiyle, Flynotyper ile kaba göz fenotipinin başarılı bir şekilde ölçülmesi sağlanabilir.

Giriş

Drosophila melanogaster genomu, insan hastalıklarıyla ilgili gen ortologlarının ~%75'ini içerir. Ek olarak, Drosophila göz gelişimi sırasında, genomdaki genlerin yaklaşık üçte ikisi eksprese edilir, bu da Drosophila gözünü çeşitli moleküler ve hücresel fonksiyonları, gelişimi ve hastalık modellerini araştırmak için olağanüstü bir genetik sistem haline getirir ^1,2. Bu nedenle, Drosophila göz sistemi, çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir deneysel araçtır.

Drosophila bileşik gözü, simetrik ....

Protokol

1. Miktar tayini için hazırlanıyor

1. ilastik¹¹, ImageJ ve ImageJ eklentisi Flynotyper^1'i indirin ve yükleyin. Kurulumla ilgili web sitesi bağlantıları için Malzeme Tablosuna bakın. Bilgisayarın işletim sistemine (Mac, Windows, Linux vb.) göre uygun paketleri indirin. Kurulum talimatlarını tam olarak belirtildiği gibi izleyin.
   NOT: Verilen bağlantılarda belirtildiği gibi talimatlara tam olarak uyulması zorunludur. Kullanılan bilgisayarın 64 bit işletim sistemine ihtiyacı vardır; Aksi takdirde, başka gerekli özellikler yoktur. Bu protokol için k....

Tartışmalar

Drosophila'nın ommatidiası, çeşitli biyolojik fonksiyonları ve genetik hastalıkları incelemek için yararlı bir sistem içerir. Ommatidia'nın düzenliliği, genetik mutasyonların etkisini incelemek için iyi bir ölçümdür⁴. Ommatidiyal düzenliliği hesaplamak için manuel sıralama gibi çeşitli yöntemler mevcut olsa da, bu yöntemler büyük ölçüde önyargılı olabilir. Bu önyargılı yaklaşımın üstesinden gelmek için yarı otom.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.