ショウジョウバエの眼の表現型の定量化:ilastikとFlynotyperを統合した計算アプローチ

要約

ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセス、特にヒトの神経変性疾患を研究するための有用なツールです。しかし、粗眼の表現型の手動定量化は偏りがあり、信頼性に欠ける可能性があります。ここでは、ilastikとFlynotyperを使用して、偏りのない方法で眼の表現型を定量化する方法について説明します。

要約

ショウジョウバエメラノガスター複眼は、対称的で六角形のパターンを示す、約800のオマチディアのよく構造化された包括的な配列です。この規則性と観察の容易さにより、ショウジョウバエの眼系は、さまざまなヒトの神経変性疾患をモデル化するための強力なツールとなっています。ただし、眼の重症度スコアの手動ランク付けなど、異常な表現型を定量化する方法には、特に眼の形態の弱い変化をランク付けする場合に制限があります。これらの制限を克服するために、Flynotyperなどの計算アプローチが開発されました。リングライトを使用すると、個々のオマチディアの無傷の画像にアクセスする、より高品質の画像が可能になります。ただし、これらの画像は、リングライトによって導入されたommatidiaの影のため、Flynotyperで直接分析することはできません。ここでは、ilastikとFlynotyperの2つのソフトウェアを組み合わせて、ショウジョウバエの疾患モデルで観察される粗眼の表現型を定量化する偏りのない方法について説明します。ilastikで画像を前処理することにより、Flynotyperで粗い目の表現型の定量化を成功させることができます。

概要

Drosophila melanogasterのゲノムには、ヒトの疾患関連遺伝子オルソログが~75%含まれています。さらに、ショウジョウバエの眼の発生中に、ゲノムの遺伝子の約3分の2が発現するため、ショウジョウバエの眼は、さまざまな分子および細胞機能、発生、および疾患モデルを調査するための優れた遺伝システムとなっています^1,2。したがって、ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセスを研究するための有用な実験ツールです。

ショウジョウバエの複眼は、対称的で六角形のパターン³を示す~800 ommatidiaのよく構造化された包括的な配列です。この六角形のパターンの規則性は、^眼の形態における突然変異の導入および遺伝子発現変化の影響を推定するために用いることができる4。眼の形態の評価を必要とする以前の研究では、肉眼で検出される眼の表現型の重症度の手動によるランク付けに大きく依存していました。眼の表現型をランク付けするために、外部の眼の形態像を実体顕微鏡

プロトコル

1. 定量化の準備

1. ilastik¹¹、ImageJ、およびImageJプラグインFlynotyper¹をダウンロードしてインストールします。インストールへのWebサイトリンクについては 、資料の表 を参照してください。コンピューターのオペレーティングシステム(Mac、Windows、Linuxなど)に応じて適切なパッケージをダウンロードします。記載されているとおりに、インストール手順に従ってください。
   注:提供されたリンクに記載されている指示に正確に従うことが不可欠です。使用するコンピューターには 64 ビットのオペレーティング システムが必要です。それ以外の場合、他の必要な仕様はありません。このプロトコルに使用されるシステムのコンピュータ仕様については、 資料表 を参照してください。
2. 標準画像を使用して機械学習モデルをトレーニングします。リングライト付きの光学顕微鏡(w1118 x GMR-GAL4など)を使用して、目の中心を焦点として健康なハエの眼を撮影します。男性と女性を別々に分析します。したがって、男性用と女性用の標準的な画像を取得します。
   注意: 設定は顕微鏡とカメラによって大きく異なります。フライの準備と....

ディスカッション

ショウジョウバエの腫瘍は、さまざまな生物学的機能や遺伝性疾患を研究するための有用なシステムです。ommatidiaの規則性は、遺伝子突然変異の影響を調べるのに適した測定値です⁴。手動ランキングなど、オマティディアル規則性を計算する方法がいくつかありますが、これらの方法には大きなバイアスがかかる可能性があります。この偏?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.