כימות דרוזופילה מלנוגסטר פנוטיפים בעין: גישה חישובית המשלבת אילסטיק ופלינוטיפר

Summary

מערכת העיניים דרוזופילה היא כלי שימושי לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. עם זאת, כימות ידני של פנוטיפים של עיניים גסות יכול להיות מוטה ולא אמין. כאן אנו מתארים שיטה שבה ilastik ו Flynotyper משמשים לכימות פנוטיפ העין בצורה משוחדת.

Abstract

עין התרכובת Drosophila melanogaster היא מערך בנוי היטב ומקיף של כ-800 אומטידיה, המציג תבנית סימטרית ומשושה. סדירות זו וקלות התצפית הופכות את מערכת העיניים דרוזופילה לכלי רב עוצמה למדל מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות שונות. עם זאת, לדרכים לכימות פנוטיפים חריגים, כגון דירוג ידני של ציוני חומרת העין, יש מגבלות, במיוחד כאשר מדרגים שינויים חלשים במורפולוגיה של העין. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו גישות חישוביות כגון Flynotyper. השימוש באור טבעתי מאפשר תמונות איכותיות יותר הניגשות לשלמות של אומטידיה. עם זאת, תמונות אלה לא ניתן לנתח על ידי Flynotyper ישירות בשל צללים על ommatidia הציג אור הטבעת. כאן, אנו מתארים דרך בלתי משוחדת לכמת פנוטיפים של עיניים גסות שנצפו במודלים של מחלת דרוזופילה על ידי שילוב של שתי תוכנות, ilastik ו- Flynotyper. על ידי עיבוד מראש של התמונות עם אילסטיק, ניתן לכמת בהצלחה את פנוטיפ העין המחוספסת באמצעות Flynotyper.

Introduction

הגנום Drosophila melanogaster מכיל ~75% מהאורתולוגים הגנטיים הקשורים למחלות אנושיות. בנוסף, במהלך התפתחות העיניים של דרוזופילה, כשני שלישים מהגנים בגנום באים לידי ביטוי, מה שהופך את עין הדרוזופילה למערכת גנטית יוצאת דופן לחקר תפקודים מולקולריים ותאיים שונים, התפתחות ומודלים של מחלות ^1,2. לפיכך, מערכת העיניים Drosophila היא כלי ניסיוני שימושי לחקר תהליכים ביולוגיים שונים.

העין המורכבת של דרוזופילה היא מערך בנוי היטב ומקיף של ~800 אומטידיה המציגים תבנית סימטרית ומשושה³. ניתן להשתמש ב....

Protocol

1. היערכות לכימות

1. הורד והתקן את ilastik¹¹, ImageJ ואת תוסף ImageJ Flynotyper¹. ראה טבלת חומרים לקבלת קישורים לאתר אינטרנט להתקנה. הורד את החבילות המתאימות בהתאם למערכת ההפעלה של המחשב (Mac, Windows, Linux וכו '). בצע את הוראות ההתקנה בדיוק כפי שצוין.
   הערה: ביצוע ההוראות בדיוק כפי שצוין בקישורים שסופקו הוא הכרחי. המחשב המשמש זקוק למערכת הפעלה של 64 סיביות; אחרת, אין מפרטים נדרשים אחרים. עיין בטבלת החומרים לקבלת מפרט המחשב של המערכת המשמשת לפרוטוקול זה.
2. השתמש בתמונה סטנדרטית כדי לאמן את מודל למידת המכונה. צלם תמונה ש....

תוצאות

במחקר קודם השתמשנו בפרוטוקול הזה כדי לקבוע משנים גנטיים של חלבון VCP מוטנטי הקשור לטרשת אמיוטרופית צידית עם דמנציה פרונטוטמפורלית (ALS-FTD)¹². בנוסף, שיטה זו שימשה גם במאמר אחר כדי להעריך את הרעילות של ALS-FTD בתיווך^S59L CHCHD10, אפילו בעת שימוש במיקרוסקופ סטריאוסקו.......

Discussion

האומטידיה של דרוזופילה מהווה מערכת שימושית לחקר תפקודים ביולוגיים שונים ומחלות גנטיות. הסדירות של אומטידיה היא מדידה טובה לבחינת ההשפעה של מוטציות גנטיות⁴. למרות שקיימות מספר שיטות לחישוב סדירות אומטידיאלית, כגון דירוג ידני, שיטות אלה יכולות להיות מו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.