כימות דרוזופילה מלנוגסטר פנוטיפים בעין: גישה חישובית המשלבת אילסטיק ופלינוטיפר

Summary

מערכת העיניים דרוזופילה היא כלי שימושי לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. עם זאת, כימות ידני של פנוטיפים של עיניים גסות יכול להיות מוטה ולא אמין. כאן אנו מתארים שיטה שבה ilastik ו Flynotyper משמשים לכימות פנוטיפ העין בצורה משוחדת.

Abstract

עין התרכובת Drosophila melanogaster היא מערך בנוי היטב ומקיף של כ-800 אומטידיה, המציג תבנית סימטרית ומשושה. סדירות זו וקלות התצפית הופכות את מערכת העיניים דרוזופילה לכלי רב עוצמה למדל מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות שונות. עם זאת, לדרכים לכימות פנוטיפים חריגים, כגון דירוג ידני של ציוני חומרת העין, יש מגבלות, במיוחד כאשר מדרגים שינויים חלשים במורפולוגיה של העין. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו גישות חישוביות כגון Flynotyper. השימוש באור טבעתי מאפשר תמונות איכותיות יותר הניגשות לשלמות של אומטידיה. עם זאת, תמונות אלה לא ניתן לנתח על ידי Flynotyper ישירות בשל צללים על ommatidia הציג אור הטבעת. כאן, אנו מתארים דרך בלתי משוחדת לכמת פנוטיפים של עיניים גסות שנצפו במודלים של מחלת דרוזופילה על ידי שילוב של שתי תוכנות, ilastik ו- Flynotyper. על ידי עיבוד מראש של התמונות עם אילסטיק, ניתן לכמת בהצלחה את פנוטיפ העין המחוספסת באמצעות Flynotyper.

Introduction

הגנום Drosophila melanogaster מכיל ~75% מהאורתולוגים הגנטיים הקשורים למחלות אנושיות. בנוסף, במהלך התפתחות העיניים של דרוזופילה, כשני שלישים מהגנים בגנום באים לידי ביטוי, מה שהופך את עין הדרוזופילה למערכת גנטית יוצאת דופן לחקר תפקודים מולקולריים ותאיים שונים, התפתחות ומודלים של מחלות ^1,2. לפיכך, מערכת העיניים Drosophila היא כלי ניסיוני שימושי לחקר תהליכים ביולוגיים שונים.

העין המורכבת של דרוזופילה היא מערך בנוי היטב ומקיף של ~800 אומטידיה המציגים תבנית סימטרית ומשושה³. ניתן להשתמש בסדירות של תבנית משושה זו כדי להעריך את ההשפעה של החדרת מוטציות ושינויים בביטוי גנים במורפולוגיית העין⁴. מחקרים קודמים הדורשים הערכה של מורפולוגיה של העין הסתמכו במידה רבה על דירוג ידני של חומרת פנוטיפים בעין בלתי. כדי לדרג את הפנוטיפים של העין, תמונות מורפולוגיות חיצוניות של העין נלקחות על ידי סטריאומיקרוסקופ ^5,6. פנוטיפ העין של כל קבוצה מוערך על ידי פיצול העין החיצונית לארבעה אזורים וחישוב שיעור הניוון בכל אזור ^5,6. לאחר מכן, הערכים משמשים לחישוב ממוצעים המושווים לערכים המתקבלים מזבובי בקרה⁷. הניקוד מבוסס על מידת האיחוי, אובדן האומטידיה, וארגון הזיפים ^7,8. תמונות עין זבוב שצולמו באמצעות סטריאומיקרוסקופ נרכשות על ידי חוקר אחד, וניתוח הפנוטיפ של העין מבוצע על ידי חוקר אחר עם ערכות אימות משולשות ^7,8.

כשמדובר בדירוג שינויים חלשים במורפולוגיה של העין בעין בלתי, יש מגבלות⁴. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו גישות חישוביות כגון FLEYE ו- Flynotyper ^1,9. Flynotyper היא שיטה חישובית חדשנית להערכה כמותית של שינויים מורפולוגיים במערכת העיניים דרוזופילה¹. הוא מזהה באופן אוטומטי את עין הדרוזופילה ואת האומטידיום הבודד, ומחשב ציונים פנוטיפיים (P-Scores) בהתבסס על אי הסדירות שלהעין¹. ציון P גבוה יותר מצביע על כך שעין הזבוב מנוונת יותר. תוכנה זו שימשה בהצלחה לכימות החריגה של עיני דרוזופילה ¹⁰. למרות Flynotyper מבטיח תהליך אוטומטי, זה עדיין לא יכול להיות מיושם בהצלחה על כמה תמונות עיניים שצולמו על ידי שיטות שונות מיקרוסקופיית אור.

מבחינה איכותית, אנו מעדיפים מקור אור טבעתי על פני מקור אור חד-נקודתי, מכיוון שהוא מציע ייצוג מדויק יותר של כל אומטידיום. עם זאת, כאשר נעשה שימוש באור הטבעת, הוא יוצר צל בצורת טבעת בחלק העליון של כל אומטידיום בשל הצורה המיספרית של האומטידיום. צל בצורת טבעת זה מעכב זיהוי אומטיאלי מדויק על ידי Flynotyper, מה שמוביל לחישוב שגוי של P-Scores.

כדי להתגבר על בעיות אלה, יישמנו את ilastik, כלי מבוסס למידת מכונה לניתוחים שונים, כדי לסווג אומטידיה בתמונות עין זבוב¹¹. לאחר מכן הזננו את התמונות שנוצרו על ידי אילסטיק לתוך Flynotyper כדי לחשב P-Scores. זה מאפשר לנו לכמת את הפגמים המורפולוגיים של עין דרוזופילה ללא משוא פנים¹.

Protocol

1. היערכות לכימות

1. הורד והתקן את ilastik¹¹, ImageJ ואת תוסף ImageJ Flynotyper¹. ראה טבלת חומרים לקבלת קישורים לאתר אינטרנט להתקנה. הורד את החבילות המתאימות בהתאם למערכת ההפעלה של המחשב (Mac, Windows, Linux וכו '). בצע את הוראות ההתקנה בדיוק כפי שצוין.
   הערה: ביצוע ההוראות בדיוק כפי שצוין בקישורים שסופקו הוא הכרחי. המחשב המשמש זקוק למערכת הפעלה של 64 סיביות; אחרת, אין מפרטים נדרשים אחרים. עיין בטבלת החומרים לקבלת מפרט המחשב של המערכת המשמשת לפרוטוקול זה.
2. השתמש בתמונה סטנדרטית כדי לאמן את מודל למידת המכונה. צלם תמונה של עין זבוב בריאה באמצעות מיקרוסקופ אור עם טבעת אור (כגון w1118 x GMR-GAL4), תוך שימוש במרכז העין כנקודת המוקד. לנתח זכרים ונקבות בנפרד; לכן, לרכוש תמונה סטנדרטית עבור זכרים ועבור נקבות.
   הערה: ההגדרות משתנות במידה רבה בהתאם למיקרוסקופ ולמצלמה. ראו את הפסקה השנייה בדיון למידע כללי יותר על הכנת זבובים ורכישת תמונות.
3. צלם תמונות של עיני הזבוב הניסיוניות באמצעות אותן הגדרות המשמשות לרכישת תמונה סטנדרטית.
   הערה: התמצאות טובה היא בעלת חשיבות עליונה לכימות מדויק. ראו איור 4 כדוגמה להתמצאות נכונה.

2. שימוש באילסטיק לזיהוי אומטידיה מתמונות עין זבוב

1. לפני תחילת הניתוח, ודא שכל קבוצות הניסוי, ללא קשר למצב הניסוי, נמצאות באותה תיקיית קבצים כדי להקל על התהליכים הבאים. ודא ששמות הקבצים מתאימים כדי לזהות קבוצות ניסוי ולהבחין בין זכרים לנקבות.
   הערה: אנו ממליצים להדפיס את הפרוטוקול ולהשתמש במחשב כדי להגדיל איורים, מכיוון שקל ביותר לעקוב אחר פרוטוקול זה באופן חזותי.
2. פתח את התוכנה.
   הערה: מומלץ לא לפתוח יישומים אחרים בעת הפעלת התוכנה; אחרת, המחשב עלול לפעול לאט מאוד, במיוחד במערכות ישנות או פחות חזקות.
3. לחץ על צור פרויקט חדש | זרימות עבודה אחרות, בחר ספירת צפיפות תאים ובחר מיקום לשמירת קובץ הפרוייקט (איור 1A).
4. לחץ על 1. נתוני קלט | הוסף חדש | הוסף תמונות נפרדות. בחרו את התמונה הסטנדרטית (איור 1B).
5. לחץ על 2. בחירת תכונות ובחר תכונות לשימוש. בחר את התכונות המוצגות באיור 1C; בחר ערכי סיגמא נוספים כדי להגביר את הרגישות (כלומר, 10, 15, 20 וכו ').
   הערה: אם תיבות רבות מדי מסומנות, התוכנית עשויה לפעול במשך זמן רב.
6. לחץ על 3. ספירה והגדרת ערך הסיגמא של הקידמה ל- 5.00. סמן 50 אומטידיום בודד או יותר באמצעות הכלי חזית בתמונה הסטנדרטית.
   הערה: חמישים סימונים מתאימים בדרך כלל לניתוח; אולם ככל שאומטידיה מסומנת יותר, כך התוצאות יהיו מדויקות יותר (איור 1D).
7. לחץ על 3. ספירה ושימוש בכלי רקע כדי לסמן את החלק החיצוני של האומטידיה (איור 1E). ציירו קווים ירוקים בצורת סריג סביב האומטידיה.
   הערה: בדומה לסימונים רבים יותר על האומטידיה, ככל ששורטטו יותר קווים ירוקים, כך התוצאות יהיו מדויקות יותר.
8. לחץ על 4. ייצוא צפיפות | בחרו 'ייצוא קביעות תמונה ' לקביעת קביעות תמונה (איור 1F). לחץ על פרטי קובץ פלט | בחר פורמט ו tif לניתוח נוסף ב Flynotyper.
9. לחץ על 5. עיבוד אצווה | בחרו Raw Data Files ובחרו את כל תצלומי הזבובים הניסיוניים לניתוח (איור 1G). רשימת התמונות המיובאות שיש לנתח מוצגת תחת Select Raw Data Files (איור 1H). לחץ על עבד את כל הקבצים בתחתית 5 . מקטע עיבוד אצווה .
   הערה: להזכירכם, ניתוחים של גברים ונשים צריכים להיעשות בנפרד. בהתאם למחשב שבו נעשה שימוש, שלב זה עשוי להימשך 10 דקות או יותר, במיוחד אם קיימות תמונות מיובאות רבות.
10. לאחר סיום התוכנה, בדוק את אותה תיקיית קבצים המכילה את תמונות עין הזבוב הניסיוניות; יהיו תמונות שחורות בשם "YourSampleName_Probabilities" (איור 1I).

3. שימוש ב-ImageJ להכנת תמונות עבור Flynotyper

1. פתח את קובץ .tif שנוצר על-ידי אילסטיק (התיבות השחורות) ב-ImageJ.
   הערה: יש לטפל בכל קובץ .tif שנוצר על ידי ilastik בנפרד.
2. השתמשו בכלי בחירת מלבן ליצירת מלבן סביב העין בלבד. לאחר ציור המלבן, חתוך את האזור על-ידי בחירה באפשרות Ctrl + X או Ctrl + C (איור 2A). המתן להופעת תיבה שחורה בצורת קו המתאר של המלבן.
   הערה: מערכת ההפעלה של המחשב תקבע אם להשתמש ב- 'Ctrl + X' או 'Ctrl + C'. בדרך כלל, 'Ctrl + X' הוא עבור Windows ו- 'Ctrl + C' משמש עבור Mac.
3. פתח את עין הזבוב החתוכה כעת באמצעות ImageJ; לחץ על קובץ | חדש | לוח פנימי (איור 2B).
4. שמור את עין הזבוב החתוכה כ- JPEG על ידי לחיצה על קובץ | שמירה בשם | יג. התמונות החתוכות נמצאות כעת באותה תיקיית קבצים כמו התמונות הניסיוניות המקוריות.
   הערה: כדי להקל על השלב הבא, מומלץ ליצור תיקיית קבצים חדשה בשם 'cut' ולהכניס את כל התמונות החתוכות לתיקייה זו.

4. שימוש ב-Flynotyper לחישוב ציונים פנוטיפיים

1. פתח את Flynotyper כתוסף ImageJ על ידי לחיצה על תוספים | פלינוטיפר.
2. בחר Add Genotypes ופתח את התיקייה הכוללת את תמונות עין הזבוב החתוכות (תיקיית הקובץ החתוך). שם התיקיה יופיע תחת גנוטיפים (איור 2C).
3. בדוק את התיבות מיקרוסקופ אור ואנכית אך התאם בהתאם במידת הצורך. בדוק את התיבות יציבות ומרחק למרכז תחת דירוג Ommatidia לפי: (איור 2C).
4. עבור מספר ommatidia מדורגת נחשב, קלט 200.
   הערה: באופן כללי, 200 הוא מספר טוב אך התאם בהתאם להעדפות.
5. לחץ על הפעל והמתן להופעת תוצאות הניתוח (איור 2D).
   הערה: שלב זה עשוי להימשך 5 דקות או יותר (או קצר יותר), בהתאם לעוצמת העיבוד של המחשב שבו נעשה שימוש.
6. העתק והדבק את הקובץ לדוגמה ואת P-Score לתוך תוכנה סטטיסטית לניתוח נוסף.

תוצאות

במחקר קודם השתמשנו בפרוטוקול הזה כדי לקבוע משנים גנטיים של חלבון VCP מוטנטי הקשור לטרשת אמיוטרופית צידית עם דמנציה פרונטוטמפורלית (ALS-FTD)¹². בנוסף, שיטה זו שימשה גם במאמר אחר כדי להעריך את הרעילות של ALS-FTD בתיווך^S59L CHCHD10, אפילו בעת שימוש במיקרוסקופ סטריאוסקו...

Discussion

האומטידיה של דרוזופילה מהווה מערכת שימושית לחקר תפקודים ביולוגיים שונים ומחלות גנטיות. הסדירות של אומטידיה היא מדידה טובה לבחינת ההשפעה של מוטציות גנטיות⁴. למרות שקיימות מספר שיטות לחישוב סדירות אומטידיאלית, כגון דירוג ידני, שיטות אלה יכולות להיות מו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.