Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

Resumo

O sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta útil para estudar vários processos biológicos, particularmente doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, a quantificação manual de fenótipos de olhos ásperos pode ser tendenciosa e não confiável. Aqui descrevemos um método pelo qual ilastik e Flynotyper são usados para quantificar o fenótipo ocular de forma imparcial.

Resumo

O olho composto de Drosophila melanogaster é uma matriz bem estruturada e abrangente de cerca de 800 omatídeos, exibindo um padrão simétrico e hexagonal. Essa regularidade e facilidade de observação tornam o sistema ocular da Drosophila uma ferramenta poderosa para modelar várias doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, as formas de quantificar fenótipos anormais, como a classificação manual dos escores de gravidade ocular, têm limitações, especialmente ao classificar alterações fracas na morfologia ocular. Para superar essas limitações, abordagens computacionais foram desenvolvidas, como o Flynotyper. O uso de um anel de luz permite melhores imagens qualitativas acessando a integridade dos omatídeos individuais. No entanto, essas imagens não podem ser analisadas diretamente pelo Flynotyper devido às sombras nos omatídeos introduzidas pelo anel de luz. Aqui, descrevemos uma maneira imparcial de quantificar os fenótipos oculares ásperos observados em modelos de doença de Drosophila , combinando dois softwares, ilastik e Flynotyper. Ao pré-processar as imagens com ilastik, a quantificação bem-sucedida do fenótipo do olho rugoso pode ser alcançada com o Flynotyper.

Introdução

O genoma de Drosophila melanogaster contém ~ 75% dos ortólogos de genes relacionados a doenças humanas. Além disso, durante o desenvolvimento do olho da Drosophila, aproximadamente dois terços dos genes do genoma são expressos, tornando o olho da Drosophila um excelente sistema genético para investigar várias funções moleculares e celulares, desenvolvimento e modelos de doenças ^1,2. Assim, o sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta experimental útil para estudar vários processos biológicos.

O olho composto de Drosophila é uma matriz bem estruturada e abrangente de ~ 800 omatídeos que exibem um padrão simétrico e hexagonal³. A regularidade desse padrão hexagonal pode ser usada para estimar o efeito da introdução de mutações e alterações na expressão gênica na morfologia do olho⁴. Estudos anteriores que requerem avaliação da morfologia ocular basearam-se fortemente na classificação manual da gravidade dos fenótipos oculares detectados a olho nu. Para classificar os fenótipos oculares, as imagens da morfologia externa do olho são obtidas por um estereomicroscópio ^5,6. O fenótipo ocular de cada grupo é avaliado dividindo o olho externo em quatro áreas e calculando a proporção de degeneração em cada área ^5,6. Em seguida, os valores são usados para calcular médias que são comparadas com os valores obtidos das moscas controle⁷. A pontuação é baseada na extensão da fusão, perda de omatídeos e organização das cerdas ^7,8. Fotos de olhos de moscas tiradas com um estereomicroscópio são adquiridas por um pesquisador, e a análise do fenótipo do olho é realizada por outro pesquisador com conjuntos de validação triplos ^7,8.

Quando se trata de classificar alterações fracas na morfologia do olho a olho nu, existem limitações⁴. Para superar essas limitações, abordagens computacionais como FLEYE e Flynotyper foram desenvolvidas ^1,9. Flynotyper é um novo método computacional para estimar quantitativamente mudanças morfológicas no sistema ocular de Drosophila¹. Ele detecta automaticamente o olho da Drosophila e o omatídio individual, calculando as pontuações fenotípicas (P-Scores) com base na irregularidade doolho¹. Um P-Score mais alto indica que o olho da mosca está mais degenerado. Este software foi usado com sucesso na quantificação da anormalidade dos olhos de Drosophila ¹⁰. Embora o Flynotyper garanta um processo automatizado, ele ainda não pode ser aplicado com sucesso a algumas imagens oculares tiradas por vários métodos de microscopia de luz.

Qualitativamente, preferimos uma fonte de luz de anel em comparação com uma fonte de luz de ponto único, pois oferece uma representação mais precisa de cada omatídio. No entanto, quando o anel de luz é usado, ele gera uma sombra em forma de anel no topo de cada omatídio devido à forma hemisférica do omatídio. Essa sombra em forma de anel inibe a detecção omatídica precisa pelo Flynotyper, levando ao cálculo incorreto dos P-Scores.

Para superar esses problemas, implementamos o ilastik, uma ferramenta baseada em aprendizado de máquina para várias análises, para classificar omatídeos em imagens de olhos de mosca¹¹. Em seguida, alimentamos as imagens geradas pelo ilastik no Flynotyper para calcular os P-Scores. Isso nos permite quantificar os defeitos morfológicos do olho da Drosophila de forma imparcial¹.

Protocolo

1. Preparação para quantificação

1. Baixe e instale o ilastik¹¹, ImageJ e o plug-in ImageJ Flynotyper¹. Consulte a Tabela de Materiais para obter links de sites para instalação. Baixe os pacotes apropriados de acordo com o sistema operacional do computador (Mac, Windows, Linux, etc). Siga as instruções de instalação exatamente como indicado.
   NOTA: Seguir as instruções exatamente como indicado nos links fornecidos é imperativo. O computador usado precisa de um sistema operacional de 64 bits; caso contrário, não há outras especificações necessárias. Consulte a Tabela de Materiais para obter as especificações do computador do sistema usado para este protocolo.
2. Use uma imagem padrão para treinar o modelo de aprendizado de máquina. Tire uma imagem de um olho de mosca saudável usando um microscópio de luz com um anel de luz (como w1118 x GMR-GAL4), usando o centro do olho como ponto focal. Analise machos e fêmeas separadamente; portanto, adquira uma imagem padrão para homens e mulheres.
   NOTA: As configurações variam muito dependendo do microscópio e da câmera. Consulte o segundo parágrafo da discussão para obter informações mais gerais sobre a preparação da mosca e aquisição de imagens.
3. Tire imagens dos olhos experimentais da mosca usando as mesmas configurações usadas para a aquisição de imagem padrão.
   NOTA: Uma boa orientação é fundamental para uma quantificação precisa. Veja a Figura 4 como um exemplo de orientação adequada.

2. Usando ilastik para detectar omatídeos de imagens de olhos de mosca

1. Antes de iniciar a análise, certifique-se de que todos os grupos experimentais, independentemente da condição experimental, estejam na mesma pasta de arquivos para facilitar os processos a seguir. Certifique-se de que os arquivos sejam nomeados adequadamente para identificar grupos experimentais e distinguir entre homens e mulheres.
   NOTA: Recomendamos imprimir o protocolo e usar o computador para ampliar as figuras, pois esse protocolo é mais facilmente seguido visualmente.
2. Abra o software.
   NOTA: É aconselhável não ter outros aplicativos abertos durante a execução do software; caso contrário, o computador pode funcionar muito lentamente, principalmente em sistemas mais antigos ou menos robustos.
3. Clique em Criar Novo Projeto | Outros fluxos de trabalho, escolha Contagem de densidade de células e selecione um local para salvar o arquivo de projeto (Figura 1A).
4. Clique em 1. Dados de entrada | Adicionar Novo | Adicione imagens separadas. Escolha a imagem padrão (Figura 1B).
5. Clique em 2. Seleção de recursos e selecione os recursos a serem usados. Selecione os recursos mostrados na Figura 1C; Escolha mais valores sigma para aumentar a sensibilidade (ou seja, 10, 15, 20, etc.).
   NOTA: Se muitas caixas estiverem marcadas, o programa poderá ser executado por um longo tempo.
6. Clique em 3. Contando e defina o valor sigma do primeiro plano como 5,00. Marque 50 ou mais omatídios individuais usando a ferramenta Primeiro plano na imagem padrão.
   NOTA: Cinquenta marcações são normalmente adequadas para análise; no entanto, quanto mais omatídeos marcados, mais precisos serão os resultados (Figura 1D).
7. Clique em 3. Contagem e use a ferramenta Plano de fundo para marcar a parte externa dos omatídeos (Figura 1E). Desenhe linhas verdes em forma de treliça ao redor do omatídio.
   NOTA: Semelhante a mais marcações nos omatídeos, quanto mais linhas verdes desenhadas, mais precisos serão os resultados.
8. Clique em 4. Densidade de exportação | Escolha Export Image Settings (Exportar configurações de imagem ) para definir as configurações de imagem (Figura 1F). Clique em Informações do arquivo de saída | selecione Formatar e tif para análise posterior no Flynotyper.
9. Clique em 5. Processamento em lote | Selecione Arquivos de dados brutos e selecione todas as fotos experimentais de moscas a serem analisadas (Figura 1G). A lista de imagens importadas a serem analisadas é vista em Selecionar arquivos de dados brutos (Figura 1H). Clique em Processar todos os arquivos na parte inferior do 5. Seção de processamento em lote .
   NOTA: Como lembrete, as análises masculinas e femininas devem ser feitas separadamente. Dependendo do computador usado, essa etapa pode levar 10 minutos ou mais, especialmente se houver muitas imagens importadas.
10. Após a conclusão do software, verifique a mesma pasta de arquivos contendo as imagens experimentais do olho da mosca; haverá imagens pretas denominadas "YourSampleName_Probabilities" (Figura 1I).

3. Usando o ImageJ para preparar fotos para o Flynotyper

1. Abra o arquivo .tif gerado pelo ilastik (as caixas pretas) no ImageJ.
   NOTA: Cada arquivo .tif gerado pelo ilastik precisa ser tratado separadamente.
2. Use a ferramenta Seleção de retângulo para criar um retângulo apenas ao redor do olho. Depois que o retângulo for desenhado, corte a área escolhendo Ctrl + X ou Ctrl + C (Figura 2A). Aguarde até que uma caixa preta na forma do contorno do retângulo apareça.
   NOTA: O sistema operacional do computador determinará se deve usar 'Ctrl + X' ou 'Ctrl + C'. Normalmente, 'Ctrl + X' é para Windows e 'Ctrl + C' é usado para Mac.
3. Abra o olho de mosca agora cortado usando ImageJ; clique em Arquivo | Novo | Área de transferência interna (Figura 2B).
4. Salve o olho de mosca cortado como JPEG clicando em Arquivo | Salvar como | Jpeg. As imagens cortadas estão agora na mesma pasta de arquivos que as imagens experimentais originais.
   NOTA: Para facilitar a próxima etapa, é recomendável criar uma nova pasta de arquivos chamada 'cortar' e colocar todas as imagens cortadas nessa pasta.

4. Usando o Flynotyper para calcular pontuações fenotípicas

1. Abra o Flynotyper como um plugin ImageJ clicando em Plugins | Flynotyper.
2. Selecione Adicionar genótipos e abra a pasta que contém as imagens do olho da mosca cortada (pasta do arquivo de corte). O nome da pasta aparecerá em Genótipos (Figura 2C).
3. Verifique as caixas Microscópio de luz e Verticalmente, mas ajuste de acordo, se necessário. Marque as caixas Estabilidade e Distância até o Centro em Classificar Ommatídios por: (Figura 2C).
4. Para Número de omatídeos classificados considerados, insira 200.
   NOTA: Em geral, 200 é um bom número, mas ajuste de acordo com as preferências.
5. Clique em Executar e aguarde até que os resultados da análise apareçam (Figura 2D).
   NOTA: Esta etapa pode levar 5 minutos ou mais (ou menos), dependendo do poder de processamento do computador usado.
6. Copie e cole o arquivo de amostra e o P-Score no software estatístico para análise posterior.

Resultados

Em um estudo anterior, usamos esse protocolo para determinar modificadores genéticos da proteína VCP mutante ligada à esclerose lateral amiotrófica com demência frontotemporal (ALS-FTD)¹². Além disso, esse método também foi usado em outro artigo para avaliar a toxicidade de CHCHD10 ALS-FTD mediada por^S59L, mesmo usando um estereomicroscópio mais antigo¹³. Para validar ainda mais esses resultados, usamos ilastik e Flynoty...

Discussão

Os omatídeos de Drosophila compreendem um sistema útil para estudar várias funções biológicas e doenças genéticas. A regularidade dos omatídeos é uma boa medida para examinar o efeito de mutações genéticas⁴. Embora existam vários métodos para calcular a regularidade omaticidial, como a classificação manual, esses métodos podem ser fortemente tendenciosos. Para superar essa abordagem tendenciosa, ferramentas semiautomáticas foram desenvo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.