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Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper
Neste Artigo
Resumo
O sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta útil para estudar vários processos biológicos, particularmente doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, a quantificação manual de fenótipos de olhos ásperos pode ser tendenciosa e não confiável. Aqui descrevemos um método pelo qual ilastik e Flynotyper são usados para quantificar o fenótipo ocular de forma imparcial.
Resumo
O olho composto de Drosophila melanogaster é uma matriz bem estruturada e abrangente de cerca de 800 omatídeos, exibindo um padrão simétrico e hexagonal. Essa regularidade e facilidade de observação tornam o sistema ocular da Drosophila uma ferramenta poderosa para modelar várias doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, as formas de quantificar fenótipos anormais, como a classificação manual dos escores de gravidade ocular, têm limitações, especialmente ao classificar alterações fracas na morfologia ocular. Para superar essas limitações, abordagens computacionais foram desenvolvidas, como o Flynotyper. O uso de um anel de luz permite melhores imagens qualitativas acessando a integridade dos omatídeos individuais. No entanto, essas imagens não podem ser analisadas diretamente pelo Flynotyper devido às sombras nos omatídeos introduzidas pelo anel de luz. Aqui, descrevemos uma maneira imparcial de quantificar os fenótipos oculares ásperos observados em modelos de doença de Drosophila , combinando dois softwares, ilastik e Flynotyper. Ao pré-processar as imagens com ilastik, a quantificação bem-sucedida do fenótipo do olho rugoso pode ser alcançada com o Flynotyper.
Introdução
O genoma de Drosophila melanogaster contém ~ 75% dos ortólogos de genes relacionados a doenças humanas. Além disso, durante o desenvolvimento do olho da Drosophila, aproximadamente dois terços dos genes do genoma são expressos, tornando o olho da Drosophila um excelente sistema genético para investigar várias funções moleculares e celulares, desenvolvimento e modelos de doenças 1,2. Assim, o sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta experimental útil para estudar vários processos biológicos.
O olho composto de....
Protocolo
1. Preparação para quantificação
- Baixe e instale o ilastik11, ImageJ e o plug-in ImageJ Flynotyper1. Consulte a Tabela de Materiais para obter links de sites para instalação. Baixe os pacotes apropriados de acordo com o sistema operacional do computador (Mac, Windows, Linux, etc). Siga as instruções de instalação exatamente como indicado.
NOTA: Seguir as instruções exatamente como indicado nos links fornecidos é imperativo. O computador usado precisa de um sistema operacional de 64 bits; caso contrário, não há outras especificações necessári....
Resultados Representativos
Em um estudo anterior, usamos esse protocolo para determinar modificadores genéticos da proteína VCP mutante ligada à esclerose lateral amiotrófica com demência frontotemporal (ALS-FTD)12. Além disso, esse método também foi usado em outro artigo para avaliar a toxicidade de CHCHD10 ALS-FTD mediada porS59L, mesmo usando um estereomicroscópio mais antigo13. Para validar ainda mais esses resultados, usamos ilastik e Flynoty.......
Discussão
Os omatídeos de Drosophila compreendem um sistema útil para estudar várias funções biológicas e doenças genéticas. A regularidade dos omatídeos é uma boa medida para examinar o efeito de mutações genéticas4. Embora existam vários métodos para calcular a regularidade omaticidial, como a classificação manual, esses métodos podem ser fortemente tendenciosos. Para superar essa abordagem tendenciosa, ferramentas semiautomáticas foram desenvo.......
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Pedro Fernandez-Funez pelo uso do microscópio e da câmera utilizados neste protocolo. Também gostaríamos de agradecer a Ava Schapman por fornecer feedback sobre a clareza do protocolo. O apoio financeiro foi fornecido pelo The Wallin Neuroscience Discovery Fund a Nam Chul Kim.
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer specifications | Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper. |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | Download software here: https://www.ilastik.org/download.html | Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system. |
| ImageJ | Download software here: https://imagej.net/ij/download.html | Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download. | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | System and software used for z-stack acquisition. |
| Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived. |
Referências
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology.
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