Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

Zusammenfassung

Das Drosophila-Augensystem ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen. Die manuelle Quantifizierung von Phänotypen des rauen Auges kann jedoch verzerrt und unzuverlässig sein. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der Ilastik und Flynotyper verwendet werden, um den Augenphänotyp unvoreingenommen zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Das Facettenauge Drosophila melanogaster ist ein gut strukturiertes und umfassendes Array von etwa 800 Ommatidien, das ein symmetrisches und hexagonales Muster aufweist. Diese Regelmäßigkeit und einfache Beobachtung machen das Drosophila-Augensystem zu einem leistungsfähigen Werkzeug zur Modellierung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen des Menschen. Methoden zur Quantifizierung abnormaler Phänotypen, wie z. B. die manuelle Einstufung von Augenschweregraden, haben jedoch Grenzen, insbesondere bei der Einstufung schwacher Veränderungen in der Augenmorphologie. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden computergestützte Ansätze wie Flynotyper entwickelt. Die Verwendung eines Ringlichts ermöglicht qualitativ bessere Bilder, die auf die Unversehrtheit der einzelnen Ommatidien zugreifen. Diese Bilder können jedoch nicht direkt von Flynotyper analysiert werden, da das Ringlicht Schatten auf Ommatidien wirft. Hier beschreiben wir eine unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung von rauen Augenphänotypen, die in Drosophila-Krankheitsmodellen beobachtet wurden, durch die Kombination von zwei Softwares, ilastik und Flynotyper. Durch die Vorverarbeitung der Bilder mit Ilastik kann eine erfolgreiche Quantifizierung des rauen Augenphänotyps mit Flynotyper erreicht werden.

Einleitung

Das Genom von Drosophila melanogaster enthält ~75% der menschlichen krankheitsbezogenen Gen-Orthologe. Darüber hinaus werden während der Entwicklung des Drosophila-Auges etwa zwei Drittel der Gene im Genom exprimiert, was das Drosophila-Auge zu einem hervorragenden genetischen System macht, um verschiedene molekulare und zelluläre Funktionen, Entwicklungs- und Krankheitsmodelle zu untersuchen ^1,2. Somit ist das Drosophila-Augensystem ein nützliches experimentelles Werkzeug, um verschiedene biologische Prozesse zu untersuchen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Quantifizierung

1. Laden Sie ilastik¹¹, ImageJ und das ImageJ-Plugin Flynotyper¹ herunter und installieren Sie es. In der Materialtabelle finden Sie Links zur Installation auf der Website. Laden Sie die entsprechenden Pakete entsprechend dem Betriebssystem des Computers (Mac, Windows, Linux usw.) herunter. Befolgen Sie die Installationsanweisungen genau wie angegeben.
   HINWEIS: Es ist zwingend erforderlich, die Anweisungen genau so zu befolgen, wie sie in den bereitgestellten Links angegeben sind. Der verwendete Computer benö....

Diskussion

Die Ommatidien von Drosophila stellen ein nützliches System zur Untersuchung verschiedener biologischer Funktionen und genetischer Krankheiten dar. Die Regelmäßigkeit von Ommatidien ist ein gutes Maß, um die Wirkung genetischer Mutationen zu untersuchen⁴. Obwohl es mehrere Methoden zur Berechnung der ommatidialen Regelmäßigkeit gibt, wie z. B. das manuelle Ranking, können diese Methoden stark verzerrt sein. Um diesen verzerrten Ansatz zu überwinde.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.