Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

Zusammenfassung

Das Drosophila-Augensystem ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen. Die manuelle Quantifizierung von Phänotypen des rauen Auges kann jedoch verzerrt und unzuverlässig sein. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der Ilastik und Flynotyper verwendet werden, um den Augenphänotyp unvoreingenommen zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Das Facettenauge Drosophila melanogaster ist ein gut strukturiertes und umfassendes Array von etwa 800 Ommatidien, das ein symmetrisches und hexagonales Muster aufweist. Diese Regelmäßigkeit und einfache Beobachtung machen das Drosophila-Augensystem zu einem leistungsfähigen Werkzeug zur Modellierung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen des Menschen. Methoden zur Quantifizierung abnormaler Phänotypen, wie z. B. die manuelle Einstufung von Augenschweregraden, haben jedoch Grenzen, insbesondere bei der Einstufung schwacher Veränderungen in der Augenmorphologie. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden computergestützte Ansätze wie Flynotyper entwickelt. Die Verwendung eines Ringlichts ermöglicht qualitativ bessere Bilder, die auf die Unversehrtheit der einzelnen Ommatidien zugreifen. Diese Bilder können jedoch nicht direkt von Flynotyper analysiert werden, da das Ringlicht Schatten auf Ommatidien wirft. Hier beschreiben wir eine unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung von rauen Augenphänotypen, die in Drosophila-Krankheitsmodellen beobachtet wurden, durch die Kombination von zwei Softwares, ilastik und Flynotyper. Durch die Vorverarbeitung der Bilder mit Ilastik kann eine erfolgreiche Quantifizierung des rauen Augenphänotyps mit Flynotyper erreicht werden.

Einleitung

Das Genom von Drosophila melanogaster enthält ~75% der menschlichen krankheitsbezogenen Gen-Orthologe. Darüber hinaus werden während der Entwicklung des Drosophila-Auges etwa zwei Drittel der Gene im Genom exprimiert, was das Drosophila-Auge zu einem hervorragenden genetischen System macht, um verschiedene molekulare und zelluläre Funktionen, Entwicklungs- und Krankheitsmodelle zu untersuchen ^1,2. Somit ist das Drosophila-Augensystem ein nützliches experimentelles Werkzeug, um verschiedene biologische Prozesse zu untersuchen.

Das Drosophila-Facettenauge ist ein gut strukturiertes und umfassendes Array von ~800 Ommatidien, die ein symmetrisches und sechseckiges Muster aufweisen³. Die Regelmäßigkeit dieses hexagonalen Musters kann verwendet werden, um den Effekt der Einführung von Mutationen und Veränderungen der Genexpression in der Augenmorphologie abzuschätzen⁴. Frühere Studien, die eine Bewertung der Augenmorphologie erfordern, haben sich stark auf eine manuelle Einstufung des Schweregrads von Augenphänotypen verlassen, die mit bloßem Auge erkannt wurden. Um die Augenphänotypen zu ordnen, werden externe Bilder der Augenmorphologie mit einem Stereomikroskop aufgenommen ^5,6. Der Augenphänotyp jeder Gruppe wird beurteilt, indem das äußere Auge in vier Bereiche aufgeteilt und der Anteil der Degeneration in jedem Bereich berechnet^{wird 5,6}. Dann werden die Werte verwendet, um Durchschnittswerte zu berechnen, die mit den Werten verglichen werden, die aus Kontrollfliegen⁷ erhalten wurden. Die Bewertung basiert auf dem Ausmaß der Fusion, dem Verlust von Ommatidien und der Borstenorganisation ^7,8. Mit einem Stereomikroskop aufgenommene Fliegenaugenfotos werden von einem Forscher aufgenommen, und die Augenphänotypanalyse wird von einem anderen Forscher mit dreifachen Validierungssätzen ^7,8 durchgeführt.

Wenn es darum geht, schwache Veränderungen in der Augenmorphologie mit bloßem Auge zu bewerten, gibt es Einschränkungen⁴. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden computergestützte Ansätze wie FLEYE und Flynotyper entwickelt ^1,9. Flynotyper ist eine neuartige Berechnungsmethode zur quantitativen Abschätzung morphologischer Veränderungen im Drosophila-Augensystem¹. Es erkennt automatisch das Drosophila-Auge und das einzelne Ommatidium und berechnet phänotypische Scores (P-Scores) basierend auf der Unregelmäßigkeit desAuges¹. Ein höherer P-Score deutet darauf hin, dass das Fliegenauge stärker degeneriert ist. Diese Software wurde erfolgreich bei der Quantifizierung der Anomalie von Drosophila-Augen eingesetzt¹⁰. Obwohl Flynotyper einen automatisierten Prozess gewährleistet, kann er immer noch nicht erfolgreich auf einige Augenbilder angewendet werden, die mit verschiedenen lichtmikroskopischen Methoden aufgenommen wurden.

Qualitativ bevorzugen wir eine Ringlichtquelle im Vergleich zu einer Einzelpunkt-Lichtquelle, da sie eine genauere Darstellung jedes Ommatidiums bietet. Wenn jedoch das Ringlicht verwendet wird, erzeugt es aufgrund der halbkugelförmigen Form des Ommatidiums einen ringförmigen Schatten an der Spitze jedes Ommatidiums. Dieser ringförmige Schatten verhindert die genaue Erkennung von Ommatiden durch Flynotyper, was zu einer falschen Berechnung der P-Scores führt.

Um diese Probleme zu lösen, haben wir ilastik implementiert, ein auf maschinellem Lernen basierendes Tool für verschiedene Analysen, um Ommatidien in Fliegenaugenbildern zu klassifizieren¹¹. Die von Ilastik generierten Bilder speisten wir dann in Flynotyper ein, um die P-Scores zu berechnen. Dies ermöglicht es uns, die morphologischen Defekte des Drosophila-Auges unvoreingenommen zu quantifizieren¹.

Protokoll

1. Vorbereitung der Quantifizierung

1. Laden Sie ilastik¹¹, ImageJ und das ImageJ-Plugin Flynotyper¹ herunter und installieren Sie es. In der Materialtabelle finden Sie Links zur Installation auf der Website. Laden Sie die entsprechenden Pakete entsprechend dem Betriebssystem des Computers (Mac, Windows, Linux usw.) herunter. Befolgen Sie die Installationsanweisungen genau wie angegeben.
   HINWEIS: Es ist zwingend erforderlich, die Anweisungen genau so zu befolgen, wie sie in den bereitgestellten Links angegeben sind. Der verwendete Computer benötigt ein 64-Bit-Betriebssystem; Andernfalls gibt es keine weiteren erforderlichen Spezifikationen. In der Materialtabelle finden Sie die Computerspezifikationen des Systems, das für dieses Protokoll verwendet wird.
2. Verwenden Sie ein Standardbild, um das Machine Learning-Modell zu trainieren. Nehmen Sie ein Bild eines gesunden Fliegenauges mit einem Lichtmikroskop mit einem Ringlicht (z. B. w1118 x GMR-GAL4) auf, wobei Sie die Mitte des Auges als Brennpunkt verwenden. Analysieren Sie Männchen und Weibchen getrennt; Erfassen Sie daher ein Standardbild für Männer und für Frauen.
   HINWEIS: Die Einstellungen variieren je nach Mikroskop und Kamera stark. Im zweiten Absatz der Diskussion finden Sie allgemeinere Informationen zur Fliegenvorbereitung und Bildaufnahme.
3. Nehmen Sie Bilder der experimentellen Fliegenaugen mit den gleichen Einstellungen auf, die für die Standard-Bildaufnahme verwendet werden.
   HINWEIS: Eine gute Orientierung ist für eine genaue Quantifizierung von größter Bedeutung. Abbildung 4 ist ein Beispiel für die richtige Orientierung.

2. Verwendung von Ilastik zum Nachweis von Ommatidien aus Fliegenaugenbildern

1. Bevor Sie mit der Analyse beginnen, stellen Sie sicher, dass sich alle experimentellen Gruppen, unabhängig von den experimentellen Bedingungen, im selben Dateiordner befinden, um die folgenden Prozesse zu vereinfachen. Stellen Sie sicher, dass die Dateien richtig benannt sind, um experimentelle Gruppen zu identifizieren und zwischen Männchen und Weibchen zu unterscheiden.
   HINWEIS: Wir empfehlen, das Protokoll auszudrucken und die Zahlen mit dem Computer zu vergrößern, da dieses Protokoll visuell am einfachsten zu befolgen ist.
2. Öffnen Sie die Software.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, während der Ausführung der Software keine anderen Anwendungen geöffnet zu haben. Andernfalls kann der Computer sehr langsam laufen, insbesondere in älteren oder weniger robusten Systemen.
3. Klicken Sie auf Neues Projekt erstellen | Andere Workflows, wählen Sie Cell Density Counting (Zählung der Zellendichte) aus, und wählen Sie einen Speicherort für die Projektdatei aus (Abbildung 1A).
4. Klicken Sie auf 1. Eingabedaten | Neu hinzufügen | Fügen Sie separate Bilder hinzu. Wählen Sie das Standardbild aus (Abbildung 1B).
5. Klicken Sie auf 2. Feature-Auswahl und Auswahl der zu verwendenden Features. Wählen Sie die in Abbildung 1C gezeigten Funktionen aus. Wählen Sie mehr Sigma-Werte, um die Empfindlichkeit zu erhöhen (z. B. 10, 15, 20 usw.).
   HINWEIS: Wenn zu viele Kontrollkästchen aktiviert sind, kann das Programm lange laufen.
6. Klicken Sie auf 3. Zählen und setzen Sie den Sigma-Wert für den Vordergrund auf 5,00. Markieren Sie 50 oder mehr einzelne Ommatidien mit dem Vordergrundwerkzeug auf dem Standardbild.
   HINWEIS: Fünfzig Markierungen sind in der Regel für die Analyse ausreichend. Je mehr Ommatidien jedoch markiert sind, desto genauer sind die Ergebnisse (Abbildung 1D).
7. Klicken Sie auf 3. Zählen und verwenden Sie das Hintergrundwerkzeug, um die Außenseite der Ommatidien zu markieren (Abbildung 1E). Zeichnen Sie grüne Linien in Gitterform um die Ommatidien.
   HINWEIS: Ähnlich wie bei mehr Markierungen auf den Ommatidien gilt: Je mehr grüne Linien gezeichnet werden, desto genauer sind die Ergebnisse.
8. Klicken Sie auf 4. Dichte-Export | Wählen Sie Export Image Settings (Bildeinstellungen exportieren ), um die Bildeinstellungen festzulegen (Abbildung 1F). Klicken Sie auf Informationen zur Ausgabedatei | Wählen Sie Format und tif für die weitere Analyse in Flynotyper.
9. Klicken Sie auf 5. Stapelverarbeitung | Wählen Sie Rohdatendateien und dann alle experimentellen Fliegenfotos aus, die analysiert werden sollen (Abbildung 1G). Die Liste der importierten Bilder, die analysiert werden sollen, wird unter "Rohdatendateien auswählen" angezeigt (Abbildung 1H). Klicken Sie unten in der 5 Felder auf Alle Dateien verarbeiten. Abschnitt "Stapelverarbeitung".
   HINWEIS: Zur Erinnerung: Analysen für Männer und Frauen sollten getrennt durchgeführt werden. Je nach verwendetem Computer kann dieser Schritt 10 Minuten oder länger dauern, insbesondere wenn viele Bilder importiert werden.
10. Nachdem die Software fertig ist, überprüfen Sie denselben Dateiordner, der die experimentellen Fliegenaugenbilder enthält. Es werden schwarze Bilder mit dem Namen "YourSampleName_Probabilities" angezeigt (Abbildung 1I).

3. Mit ImageJ Fotos für Flynotyper vorbereiten

1. Öffnen Sie die von Ilastik generierte .tif-Datei (die schwarzen Kästchen) in ImageJ.
   HINWEIS: Jede von Ilastik generierte .tif Datei muss separat behandelt werden.
2. Verwenden Sie das Rechteckauswahl-Werkzeug , um ein Rechteck nur um das Auge zu erstellen. Nachdem das Rechteck gezeichnet wurde, schneiden Sie den Bereich zu, indem Sie entweder Strg + X oder Strg + C drücken (Abbildung 2A). Warten Sie, bis ein schwarzes Feld in Form des rechteckigen Umrisses angezeigt wird.
   HINWEIS: Das Betriebssystem des Computers bestimmt, ob "Strg + X" oder "Strg + C" verwendet werden soll. Normalerweise wird "Strg + X" für Windows und "Strg + C" für Mac verwendet.
3. Öffnen Sie das nun abgeschnittene Fliegenauge mit ImageJ; Klicken Sie auf Datei | Neu | Interne Zwischenablage (Abbildung 2B).
4. Speichern Sie das ausgeschnittene Fliegenauge als JPEG, indem Sie auf Datei | Speichern unter | JPEG. Die ausgeschnittenen Bilder befinden sich nun im selben Dateiordner wie die ursprünglichen experimentellen Bilder.
   HINWEIS: Um den nächsten Schritt zu erleichtern, wird empfohlen, einen neuen Dateiordner mit dem Namen "cut" zu erstellen und alle ausgeschnittenen Bilder in diesem Ordner abzulegen.

4. Verwendung von Flynotyper zur Berechnung phänotypischer Scores

1. Öffnen Sie Flynotyper als ImageJ-Plugin, indem Sie auf Plugins | Flynotyper.
2. Wählen Sie Genotypen hinzufügen und öffnen Sie den Ordner mit den geschnittenen Fliegenaugenbildern (Ordner mit ausgeschnittener Datei). Der Ordnername wird unter Genotypen angezeigt (Abbildung 2C).
3. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Lichtmikroskop und Vertikal , aber passen Sie sie bei Bedarf entsprechend an. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Stabilität und Abstand zur Mitte unter Rang Ommatidia nach: (Abbildung 2C).
4. Geben Sie für Anzahl der berücksichtigten Ommatidien den Wert 200 ein.
   HINWEIS: Im Allgemeinen ist 200 eine gute Zahl, aber passen Sie sie entsprechend Ihren Vorlieben an.
5. Klicken Sie auf Ausführen , und warten Sie, bis die Ergebnisse der Analyse angezeigt werden (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Dieser Schritt kann je nach Rechenleistung des verwendeten Computers 5 Minuten oder länger (oder kürzer) dauern.
6. Kopieren Sie die Beispieldatei und den P-Score und fügen Sie sie zur weiteren Analyse in eine Statistiksoftware ein.

Ergebnisse

In einer früheren Studie haben wir dieses Protokoll verwendet, um genetische Modifikatoren des mutierten VCP-Proteins zu bestimmen, das mit amyotropher Lateralsklerose mit frontotemporaler Demenz (ALS-FTD) in Verbindung gebracht ^wird12. Darüber hinaus wurde diese Methode auch in einer anderen Arbeit verwendet, um die Toxizität von CHCHD10^{S59L-vermittelten} ALS-FTD zu bewerten, selbst wenn ein älteres Stereomikroskop^{verwendet wurde 1...}

Diskussion

Die Ommatidien von Drosophila stellen ein nützliches System zur Untersuchung verschiedener biologischer Funktionen und genetischer Krankheiten dar. Die Regelmäßigkeit von Ommatidien ist ein gutes Maß, um die Wirkung genetischer Mutationen zu untersuchen⁴. Obwohl es mehrere Methoden zur Berechnung der ommatidialen Regelmäßigkeit gibt, wie z. B. das manuelle Ranking, können diese Methoden stark verzerrt sein. Um diesen verzerrten Ansatz zu überwinde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.