使用器官培养的猪角膜评估治疗和化学毒性以及上皮伤口愈合

摘要

猪角膜 离体 器官培养和上皮伤口愈合为测试化学品的眼毒性提供了一种经济、合乎伦理、可重复和定量的方法。它们还有助于阐明上皮化和组织修复调节的潜在机制，以及评估治疗糖尿病角膜病变和伤口愈合延迟的治疗方法。

摘要

由于其解剖学和生理学与人眼的相似性，猪眼是生物医学研究和眼毒性评估的可靠模型。开发了一种使用猪眼的空气/液体角膜培养系统，离 体 上皮伤口愈合被用作这些研究的关键参数。新鲜猪角膜被处理用于器官培养，有或没有上皮损伤。将角膜在 37 °C 的加湿 5% CO₂ 培养箱中在 MEM 中培养，有或没有检测试剂。测量角膜通透性和伤口愈合率，上皮细胞和/或全角膜可以处理用于免疫组织化学、蛋白质印迹和 qPCR 以进行分子和细胞分析。本研究描述了一个详细的方案，并介绍了使用该 离体 系统的两项研究。数据显示，猪角膜器官培养结合上皮伤口愈合，是化学毒性测试、研究糖尿病角膜病变和确定潜在疗法的离体模型。

引言

虽然细胞模型具有有限的克隆群并且无法复制生物体的体内结构，但器官培养或外植体提供了对器官功能、发育、疾病机制和潜在疗法的见解，同时与其他实验模型相比具有伦理和生理优势^1,2.除了减少所需的动物数量外，培养外植体还可以控制和合理操纵周围条件，这非常适合在器官培养环境中详细探索控制细胞增殖、迁移、伤口反应和细胞分化的因素 ^2,3。在不同的组织/器官中，角膜外植体，包括人类的角膜外植体 ^4,5,6，已被广泛用于眼毒性、刺激性评估 ^7,8，研究干细胞功能⁹ 和伤口愈合的分子机制^10,11，以及原发性开角型青光眼

研究方案

由于新鲜猪角膜是食品工业的副产品，机构动物护理和使用委员会不需要批准将其用于研究。与研究中使用的人类角膜不同，没有生物危害问题，猪眼未使用的部分可以作为普通垃圾处理。用于本研究的试剂和设备列在 材料表中。

1. 器官培养的准备

1. 使用前将青霉素-链霉素作为补充剂添加到最低必需培养基 （MEM） 中。
2. 通过将 3.6 g D-葡萄糖添加到 1 L 补充的 MEM 中来制备高葡萄糖培养基，其中含有 5 mM 葡萄糖（等于 90 mg/dL），以达到 25 mM（相当于 450 mg/dL）的最终葡萄糖浓度，模拟糖尿病患者的高血糖。
3. 向 20 mL MEM 中加入 0.2 g 琼脂糖，并在微波炉中加热直至琼脂糖溶解，在含有 5 mM 或 25 mM 葡萄糖的补充 MEM 中制备 1% 琼脂糖。
4. 将含琼脂糖的溶液转移到维持在 48 °C 的水浴中。
5. 实验前，对所有实验试剂进行高压灭菌，例如蒸馏水、PBS 和手术设备：止血钳、镊子、手术刀手柄、剪刀和环钻，以及烧杯、纸巾、无绒湿巾、手套和移液器吸头。将硅模具、剃须刀片和刀架浸泡在 70% 酒精中 30 分钟，然后用无菌 PBS 洗涤 3 次。

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讨论

培养的牛角膜和主要是猪角膜已被用于评估化妆品化学品、青光眼药物和非甾体抗炎药的毒性^21,26。猪角膜也被用作人类糖尿病角膜病变的离体模型。与兔子的眼睛不同，猪眼在解剖学、生理学和生物力学上都类似于 人的眼睛²⁷，因此，被用于异种移植到人类¹⁵ 中，包括?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235