臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

要約

ブタ角膜 ex vivo 臓器培養および上皮創傷治癒は、化学物質の眼毒性をテストするための経済的、倫理的、再現性のある、および定量的な手段を提供します。また、上皮化や組織修復の制御機構の解明や、糖尿病性角膜症や創傷治癒遅延の治療薬の評価にも役立っています。

要約

ブタの眼は、解剖学的および生理学的に人間の眼と類似しているため、生物医学研究や眼毒性評価のための堅牢なモデルとして機能します。ブタの眼を用いた空気/液体角膜培養システムを開発し、これらの研究の重要なパラメータとして ex vivo 上皮創傷治癒を利用しました。新鮮なブタの角膜は、上皮創傷の有無にかかわらず、臓器培養のために処理されました。角膜は、MEMの37°Cで加湿された5%_CO2 インキュベーターで、試験剤の有無にかかわらず培養しました。角膜透過性と創傷治癒率を測定し、上皮細胞および/または角膜全体を免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、および分子および細胞分析のためのqPCRのために処理することができます。この研究では、詳細なプロトコルについて説明し、この ex vivo システムを使用した2つの研究を紹介します。このデータは、ブタの角膜臓器培養と上皮創傷治癒の組み合わせが、化学毒性試験、糖尿病性角膜症の研究、および潜在的な治療法の特定に適したex vivoモデルであることを示しています。

概要

細胞モデルはクローン集団が限られており、生物の生体内構造を再現できませんが、臓器培養または外植片は、臓器の機能、発生、疾患メカニズム、および潜在的な治療法に関する洞察を提供し、他の実験モデルよりも倫理的および生理学的利点を提供します^1,2.培養外植片は、必要な動物の数を減らすだけでなく、周囲の条件を制御し、感覚的に操作するため、臓器培養環境における細胞増殖、遊走、創傷応答、および細胞分化を制御する因子の詳細な探索に理想的です^2,3。さまざまな組織/器官の中で、ヒト^4,5,6を含む角膜外植片は、眼毒性、刺激評価^7,8、幹細胞機能⁹および創傷治癒^10,11

プロトコル

新鮮な豚の角膜は食品産業の副産物であるため、施設動物管理および使用委員会は、研究のためのそれらの使用を承認する必要はありませんでした。研究に用いられているヒトの角膜とは異なり、バイオハザードの心配はなく、ブタの目の未使用部分は一般ゴミとして処分することができます。この研究に使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 臓器培養の準備

1. 使用前に、ペニシリン-ストレプトマイシンをサプリメントとして最小必須培地(MEM)に加えてください。.
2. 5 mMグルコース(90 mg / dLに相当)を含む1 LのサプリメントMEMに3.6 gのD-グルコースを添加して高グルコース培地を調製し、糖尿病患者の高血糖を模倣して25 mM(450 mg / dLに等しい)の最終グルコース濃度に到達します。
3. 5 mMまたは25 mMグルコースを添加したMEMに0.2 gのアガロースを加え、アガロースが溶解するまで電子レンジで加熱することにより、5 mMまたは25 mMグルコースを添加したMEMで1%アガロースを調製します。
4. アガロース含有溶液を48°Cに維持された水浴に移します。
5. 実験の前に、蒸留水、PBS、手術器具(止血剤、鉗子、メスハンドル、はさみ、トレ....

ディスカッション

培養されたウシおよび主にブタの角膜は、化粧品化学物質、緑内障治療薬、および非ステロイド性抗炎症薬^21,26の毒性を評価するために使用されてきた。ブタの角膜は、ヒト糖尿病性角膜症のex vivoモデルとしても使用されています。ウサギの目とは異なり、ブタの目は解剖学的、生理学的、および生体力学的?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235