Avaliação da toxicidade terapêutica e química usando córneas suínas cultivadas em órgãos e cicatrização de feridas epiteliais

Resumo

A cultura de órgãos ex vivo da córnea suína e a cicatrização de feridas epiteliais fornecem um meio econômico, ético, reprodutível e quantitativo para testar a toxicidade ocular de produtos químicos. Eles também ajudam a elucidar os mecanismos subjacentes à regulação da epitelização e reparo tecidual e na avaliação terapêutica para o tratamento de ceratopatia diabética e cicatrização retardada de feridas.

Resumo

Devido às suas semelhanças anatômicas e fisiológicas com o olho humano, o olho suíno serve como um modelo robusto para pesquisa biomédica e avaliação de toxicidade ocular. Um sistema de cultura de córnea ar/líquido usando olhos suínos foi desenvolvido, e a cicatrização de feridas epiteliais ex vivo foi utilizada como um parâmetro crítico para esses estudos. Córneas frescas de suínos foram processadas para cultura de órgãos, com ou sem ferimento epitelial. As córneas foram cultivadas em incubadora umidificada de CO₂ a 5% a 37 °C em MEM, com ou sem agentes de teste. A permeabilidade da córnea e as taxas de cicatrização de feridas foram medidas, e células epiteliais e/ou córneas inteiras podem ser processadas para imuno-histoquímica, western blotting e qPCR para análises moleculares e celulares. Este estudo descreve um protocolo detalhado e apresenta dois estudos utilizando este sistema ex vivo . Os dados mostram que a cultura de órgãos da córnea suína, combinada com a cicatrização de feridas epiteliais, é um modelo ex vivo adequado para testes de toxicidade química, estudo de ceratopatia diabética e identificação de possíveis terapias.

Introdução

Embora os modelos celulares possuam populações clonais limitadas e não reproduzam a arquitetura in vivo de um organismo, a cultura de órgãos ou explante oferece informações sobre a função do órgão, desenvolvimento, mecanismos de doenças e terapias potenciais, ao mesmo tempo em que oferece vantagens éticas e fisiológicas sobre outros modelos experimentais ^1,2. Além de reduzir o número de animais necessários, a cultura de explantes controla e manipula sensivelmente as condições circundantes, o que é ideal para uma exploração detalhada dos fatores que controlam a proliferação celular, migração, resposta a feridas e diferenciação celular em um ambiente de cultura de órgãos ^2,3. Entre diferentes tecidos / órgãos, os explantes da córnea, incluindo os humanos ^4,5,6, têm sido amplamente utilizados para toxicidade ocular, avaliações de irritação ^7,8, para estudar molecularmente os mecanismos subjacentes à função das células-tronco⁹ e cicatrização de feridas^10,11 e para glaucoma primário de ângulo aberto¹².

As córneas suínas compartilham várias semelhanças estruturais e fisiológicas com as córneas humanas, tornando-as um excelente modelo para estudar a biologia e as doenças da córnea humana. Estruturalmente, ambos têm a camada de Bowman, 5-7 camadas de células epiteliais e curvatura e diâmetro semelhantes. Fisiologicamente, eles são altamente transparentes, têm composição de filme lacrimal e hidratação da córnea semelhantes, exibem padrões e funções comparáveis de inervação da córnea e seguem processos de cicatrização de feridas semelhantes, tornando-os um excelente modelo para estudar a biologia e doenças da córnea humana^13,14. Embora as córneas humanas e suínas tenham pequenas diferenças no arranjo das fibrilas de colágeno e no conteúdo de água, sua sinalização imunológica e respostas não são idênticas. Essas diferenças representam desafios para o xenotransplante¹⁵. Portanto, as diferenças específicas da espécie devem ser consideradas ao interpretar os dados experimentais.

Em comparação com as córneas humanas, os olhos suínos estão prontamente disponíveis como subprodutos da indústria da carne, tornando-os econômicos e facilmente acessíveis para pesquisa¹⁴. O uso de córneas suínas ajuda a reduzir a necessidade de córneas de doadores humanos e minimiza as preocupações éticas associadas aos testes em animais. Além disso, a disponibilidade de muitas córneas suínas ao mesmo tempo permite experimentos consistentes e reprodutíveis, o que é crucial para resultados de pesquisa confiáveis.

Um sistema de cultura de órgãos da córnea suína foi inicialmente usado para substituir testes em animais de produtos químicos cosméticos e drogas oculares⁷. Este sistema tem sido usado para estudar a cicatrização de feridas epiteliais da córnea e para identificar várias vias de sinal importantes, como derramamento de ectodomínio HB-EGF, estimulação do ácido lisofosfatídico do mediador lipídico e ativação do EGFR para cicatrização de feridas da córnea^16,17. Usando glicose alta como fator patológico, um modelo ex vivo de hiperglicemia foi estabelecido com cicatrização de feridas epiteliais para mimetizar a ceratopatia diabética humana. Usando este modelo, as expressões de equilíbrio de IL-1β versus IL-1Ra¹⁸ e TGFβ3 versus TGFβ1¹⁹ mostraram-se fatores importantes para a cicatrização adequada de feridas nas córneas, e a manipulação desses equilíbrios pode ser usada para tratar a ceratopatia diabética. Portanto, a cultura de órgãos suínos representa um sistema de experimento relevante, econômico e manipulador com várias aplicações em testes de toxicidade química, pesquisa biomédica, descoberta de medicamentos e avaliação de danos e reparos teciduais em resposta à exposição ocular a armas químicas.

Neste artigo, é descrito um protocolo detalhado de cultura de órgãos da córnea suína e suas aplicações para avaliar os efeitos potenciais do colírio ocular AINE (NS) na saúde da córnea e para determinar as vias de sinalização e os processos biológicos envolvidos na patogênese da ceratopatia diabética.

Protocolo

Como as córneas de porco frescas são um subproduto da indústria alimentícia, o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais não precisou aprovar seu uso para pesquisa. Ao contrário das córneas humanas usadas em pesquisas, não há preocupações com riscos biológicos e partes não utilizadas de olhos de porco podem ser descartadas como lixo comum. Os reagentes e equipamentos utilizados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para a cultura de órgãos

1. Adicione penicilina-estreptomicina ao meio essencial mínimo (MEM) como suplementos antes de usar.
2. Prepare meios de cultura com alto teor de glicose adicionando 3,6 g de D-glicose a 1 L de MEM suplementado, que contém 5 mM de glicose (igual a 90 mg / dL), para atingir uma concentração final de glicose de 25 mM (igual a 450 mg / dL), imitando a hiperglicemia em pacientes diabéticos.
3. Prepare agarose a 1% em MEM suplementado com 5 mM ou 25 mM de glicose adicionando 0,2 g de agarose a 20 mL de MEM e aquecendo-o no micro-ondas até que a agarose se dissolva.
4. Transferir a solução contendo agarose para um banho-maria mantido a 48 °C.
5. Antes do experimento, autoclave todos os reagentes experimentais, como água destilada, PBS e equipamentos cirúrgicos: hemostático, fórceps, cabo de bisturi, tesoura e trefina, além de copos, toalhas de papel, lenços umedecidos, luvas e pontas de pipeta. Mergulhe o molde de silicone, a lâmina de barbear e o porta-lâminas em álcool 70% por 30 min e lave com PBS estéril três vezes.

2. Preparação do globo ocular suíno para cultura da córnea

1. Obtenha globos oculares suínos de um matadouro local e transporte-os para o laboratório no gelo em uma câmara úmida.
   NOTA: Os olhos bovinos também podem ser usados de maneira semelhante. No entanto, os olhos e córneas bovinas diferem dos olhos / córneas humanos de forma mais notável. Por exemplo, córneas humanas e suínas têm 5-7 camadas de células epiteliais, enquanto córneas bovinas têm cerca de 20 camadas ^13,14. Além disso, os olhos bovinos são mais propensos a serem contaminados durante a cultura de órgãos da córnea; portanto, mais olhos bovinos são necessários para análise estatística.
2. Colocar os olhos de suíno num copo de 1 L contendo PBS esterilizado.
   NOTA: Os globos oculares suínos são coletados dentro de 1 h após o abate e transportados para o laboratório em cerca de 2 h. No geral, os olhos foram usados em 4 h (etapa 2.3).
3. Segure um globo ocular com uma pinça e remova os tecidos extraoculares com uma tesoura em uma placa de Petri estéril.
4. Enxágue os globos oculares com água destilada uma vez e PBS duas vezes.
5. Enxágue os bulbos oculares com uma solução anti-séptica de iodopovidona por 10 s, seguida de PBS esterilizado três vezes lavando.
6. Incube os globos oculares em PBS contendo 20 μg/mL de gentamicina por 30 min e enxágue-os duas vezes com PBS.

3. Ferimento do epitélio

1. Segure um globo ocular com lenços esterilizados sem fiapos e marque o centro das córneas com uma trefina de 6 mm.
2. Raspe suavemente as células epiteliais dentro do círculo marcado com trefina com um bisturi pequeno ou lâmina de barbear macia com embotamento de canto, remova todos os detritos celulares, mas deixe a membrana basal intacta e limpe a área da ferida com cotonetes.
   NOTA: O bisturi com células epiteliais coletadas pode ser transferido para um tubo de microcentrífuga colocado no gelo. As células podem ser lisadas imediatamente ou armazenadas em um freezer de -20 °C para servir como controle.

4. Cultura de órgãos da córnea e modelagem ex vivo da hiperglicemia

1. Disseque o globo ocular cortando ao longo das bordas córneo-esclerais com um bisturi e uma tesoura e enxágue as córneas em um béquer esterilizado de 1000 mL contendo PBS (pH 7,4).
2. Coloque as córneas excisadas de cabeça para baixo em um molde estéril feito de silicone líquido não tóxico para fabricação de moldes.
   NOTA: Despeje o líquido não tóxico para fabricação de moldes de silicone nos orifícios de um rack de cultura de tecidos/tubo de ensaio de 50 mL, usando a parte inferior do tubo de ultracentrífuga de 30 mL para fazer um molde semi-redondo.
3. Encha a cavidade endotelial da córnea com MEM contendo 1% de agarose mantida a 48 °C e deixe a mistura gelificar à temperatura ambiente.
4. Inverter e transferir as córneas para uma placa de 35 mm e adicionar 2 mL de MEM com ou sem agente(s) de teste gota a gota na superfície da córnea central para cobrir a região da conjuntiva límbica, deixando o epitélio exposto ao ar (Figura 1).
5. Colocar as placas de cultura numa incubadora humidificada de CO₂ a 5% a 37 °C e substituir o meio por um novo meio MEM com ou sem agente(s) de ensaio diariamente durante 2 dias.
6. Estabeleça um modelo de hiperglicemia ex vivo adicionando L-glicose ao MEM para atingir um total de 25 mM de glicose, que é usada para preparação de gel de agarose a 1% e como meio de cultura.

5. Avaliação da função da córnea

1. Determine a taxa de cicatrização da ferida epitelial colorindo as córneas feridas com a coloração de Richardson20 para marcar a área remanescente da ferida e fotografá-la (Figura 2 e Figura 3). Quantifique o tamanho da ferida com o software Image-J ou Photoshop (histograma).
2. Processe as córneas para análises histológicas, histoquímicas e imuno-histoquímicas (Figura 2 e Figura 3) incorporando-as na OCT e no corte do criostato. Fixe as seções com acetona gelada, core com coloração H & E ou bloqueie com 1% de BSA por 1 h para coloração TUNEL ou imuno-histoquímica para detectar proteínas e moléculas de sinalização (como Erk fosforilada e ATK).
   NOTA: A maioria dos anticorpos disponíveis comercialmente não foi testada para antígenos suínos. No entanto, se um anticorpo reconhecer antígenos humanos e de camundongo, ele pode ser usado principalmente para detectar o Western blotting e a imuno-histoquímica do antígeno suíno correspondente.
3. Lave as córneas coradas com PBS e use a trefina do mesmo tamanho para marcar a ferida original e descartar as células epiteliais dentro dos círculos marcadores.
   1. Colete as células epiteliais com um bisturi pequeno, mergulhe o bisturi com as células coletadas em um tubo de centrífuga pré-resfriado em gelo.
   2. Armazene as células coletadas em freezer a -80 ° C ou extraia-as imediatamente e realize lise para Western blotting e / ou ELISA ou em tampão de extração de RNA para PCR (se necessário) ^{10 , 16 , 21} .

Resultados

A cirurgia de catarata é um dos procedimentos mais realizados em todo o mundo, e os colírios desempenham um papel crucial nos cuidados pós-cirúrgicos. A aplicação de colírios após a cirurgia de catarata ajuda a prevenir complicações como infecções oculares, inflamação e edema macular. Os colírios AINEs (NS), incluindo cetorolaco, bromfenaco e nepafenaco, têm sido comumente usados para tratar a dor e o inchaço do olho antes, durante e após a cirurgia de catarata. O uso p...

Discussão

Córneas bovinas cultivadas e principalmente suínas têm sido usadas para avaliar as toxicidades de produtos químicos cosméticos, medicamentos para glaucoma e anti-inflamatórios não esteróides^21,26. As córneas de porco também têm sido usadas como um modelo ex vivo de ceratopatia diabética humana. Ao contrário dos olhos de coelho, o olho de porco se assemelha ao olho humano anatomicamente, fis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235