הערכת רעילות טיפולית וכימית באמצעות קרניות חזיר בתרבית איברים וריפוי פצעי אפיתל

Summary

תרבית איברים של קרנית חזיר ex vivo וריפוי פצעי אפיתל מספקים אמצעי חסכוני, אתי, ניתן לשחזור וכמותי לבדיקת רעילות העין של כימיקלים. הם גם מסייעים בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות אפיתל ותיקון רקמות, ובהערכת טיפולים לטיפול בקרטופתיה סוכרתית ובריפוי פצעים מאוחר.

Abstract

בשל הדמיון האנטומי והפיזיולוגי שלה לעין האנושית, העין החזירית משמשת מודל חזק למחקר ביו-רפואי ולהערכת רעילות העין. פותחה מערכת תרבית קרנית אוויר/נוזל באמצעות עיניים חזיריות, וריפוי פצעים אפיתל ex vivo שימש כפרמטר קריטי למחקרים אלה. קרניות חזיר טריות עובדו לתרבית איברים, עם או בלי פצעי אפיתל. הקרניות תורבתו באינקובטור לח של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-MEM, עם או בלי חומרי בדיקה. נמדדו חדירות הקרנית ושיעורי ריפוי הפצעים, וניתן לעבד תאי אפיתל ו/או קרניות שלמות עבור אימונוהיסטוכימיה, כתמים מערביים ו-qPCR לאנליזות מולקולריות ותאיות. מחקר זה מתאר פרוטוקול מפורט ומציג שני מחקרים המשתמשים במערכת ex vivo זו. הנתונים מראים כי תרבית איברי קרנית חזירית, בשילוב עם ריפוי פצעי אפיתל, היא מודל אקס ויו מתאים לבדיקת רעילות כימית, חקר קרטופתיה סוכרתית וזיהוי טיפולים פוטנציאליים.

Introduction

בעוד שלמודלים של תאים יש אוכלוסיות שבטים מוגבלות והם אינם מצליחים לשחזר את ארכיטקטורת in vivo של אורגניזם, תרבית איברים או צמח אקספלנט מציעים תובנות לגבי תפקוד איברים, התפתחות, מנגנוני מחלה וטיפולים פוטנציאליים תוך מתן יתרונות אתיים ופיזיולוגיים על פני מודלים ניסיוניים אחרים ^1,2. בנוסף להפחתת מספר בעלי החיים הדרושים, צמחי תרבית שולטים ומתפעלים בתבונה את התנאים הסובבים, וזה אידיאלי לחקירה מפורטת של גורמים השולטים בהתפשטות תאים, נדידה, תגובת פצעים והתמיינות תאית בסביבת תרבית איברים ^2,3. בין רקמות/איברים....

Protocol

מכיוון שקרניות חזיר טריות הן תוצר לוואי של תעשיית המזון, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים לא הייתה צריכה לאשר את השימוש בהן למחקר. שלא כמו קרניות אנושיות המשמשות במחקר, אין חששות לסיכון ביולוגי, וניתן להשליך חלקים שאינם בשימוש של עיני חזיר כזבל רגיל. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לתרבות איברים

1. יש להוסיף פניצילין-סטרפטומיצין למדיום החיוני המינימלי (MEM) כתוספים לפני השימוש.
2. הכינו תרבית עתירת סוכר על ידי הוספת 3.6 גרם D-גלוקוז ל-1 ליטר של תוספת MEM, המכילה 5 מ"מ גלוקוז (שווה ערך ל-90 מ"ג/ד"ל), כדי להגיע לריכוז גלוקו....

תוצאות

ניתוח קטרקט הוא אחד ההליכים המבוצעים בתדירות הגבוהה ביותר בעולם, וטיפות עיניים ממלאות תפקיד מכריע בטיפול שלאחר הניתוח. מריחת טיפות עיניים לאחר ניתוח קטרקט מסייעת במניעת סיבוכים כגון דלקות עיניים, דלקת ובצקת מקולרית. טיפות עיניים NSAID (NS), כולל ketorolac, bromfenac, ו nepafenac, שימשו בד?.......

Discussion

בקר מתורבת וקרניות חזיריות בעיקר שימשו להערכת הרעילות של כימיקלים קוסמטיים, תרופות לגלאוקומה ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות^21,26. קרניות חזיר שימשו גם כמודל ex vivo של קרטופתיה סוכרתית אנושית. בניגוד לעין ארנב, עין החזיר דומה לעי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235