Оценка терапевтической и химической токсичности с использованием роговицы свиней, культивируемых органами, и заживление эпителиальных ран

Резюме

Культура органов ex vivo роговицы свиньи и заживление эпителиальных ран обеспечивают экономические, этичные, воспроизводимые и количественные средства для тестирования токсичности химических веществ для глаз. Они также помогают в выяснении механизмов, лежащих в основе регуляции эпителизации и восстановления тканей, а также в оценке методов лечения диабетической кератопатии и замедленного заживления ран.

Аннотация

Благодаря своему анатомическому и физиологическому сходству с человеческим глазом, свиной глаз служит надежной моделью для биомедицинских исследований и оценки глазной токсичности. Была разработана система культивирования роговицы воздух/жидкость с использованием глаз свиньи, и заживление эпителиальных ран ex vivo использовалось в качестве критического параметра для этих исследований. Свежие роговицы свиней обрабатывали для культивирования органов, с повреждением эпителия или без него. Роговицы культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при 37 °C в MEM, с агентами для тестирования или без них. Измеряли проницаемость роговицы и скорость заживления ран, а эпителиальные клетки и/или целые роговицы можно обрабатывать для иммуногистохимии, вестерн-блоттинга и количественной ПЦР для молекулярного и клеточного анализа. В этом исследовании описан подробный протокол и представлены два исследования с использованием этой системы ex vivo . Данные показывают, что культура органов роговицы свиньи в сочетании с заживлением эпителиальных ран является подходящей моделью ex vivo для тестирования химической токсичности, изучения диабетической кератопатии и определения потенциальных методов лечения.

Введение

В то время как клеточные модели обладают ограниченными клональными популяциями и не могут воспроизвести архитектуру организма in vivo, культивирование органов или эксплант дает представление о функции органа, развитии, механизмах заболевания и потенциальных методах лечения, обеспечивая при этом этические и физиологические преимущества по сравнению с другими ^{экспериментальными} моделями.. В дополнение к сокращению необходимого количества животных, культивирование эксплантов контролирует и разумно манипулирует окружающими условиями, что идеально подходит для детального исследования факторов, контролирующих пролиферацию клеток, миграцию, реакцию на рану и клеточную дифференцировку в условиях культивирования органов ^2,3. Среди различных тканей/органов, экспланты роговицы, в том числе у человека ^4,5,6, широко используются для оценки глазной токсичности, раздражения ^7,8, для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе функции стволовых клеток⁹ и заживления ран ^10,11, а также для первичной открытоугольной глаукомы¹².

Роговицы свиней имеют несколько структурных и физиологических сходств с роговицами человека, что делает их отличной моделью для изучения биологии и болезней роговицы человека. Структурно оба имеют слой Боумана, 5-7 слоев эпителиальных клеток и схожую кривизну и диаметр. Физиологически они очень прозрачны, имеют схожий состав слезной пленки и гидратацию роговицы, демонстрируют сопоставимые паттерны и функции иннервации роговицы и следуют схожим процессам заживления ран, что делает их отличной моделью для изучения биологии роговицы и заболеваний роговицы человека^13,14. В то время как роговица человека и свиньи имеют небольшие различия в расположении коллагеновых фибрилл и содержании воды, их иммунная сигнализация и реакции не идентичны. Эти различия создают трудности для ксенотрансплантации¹⁵. Следовательно, при интерпретации экспериментальных данных необходимо учитывать видоспецифичные различия.

По сравнению с роговицей человека, свиные глаза легко доступны в качестве побочных продуктов мясной промышленности, что делает их экономически эффективными и легкодоступными^{для исследований.} Использование роговицы свиньи помогает снизить потребность в донорских роговицах человека и свести к минимуму этические проблемы, связанные с испытаниями на животных. Более того, наличие большого количества роговиц свиньи за один раз позволяет проводить последовательные и воспроизводимые эксперименты, что имеет решающее значение для надежных результатов исследований.

Система культивирования органов роговицы свиньи первоначально использовалась для замены испытаний косметических химикатов и глазных препаратов на животных⁷. Эта система была использована для изучения заживления эпителиальных ран роговицы и выявления нескольких важных сигнальных путей, таких как выделение эктодомена HB-EGF, стимуляция липидного медиатора лизофосфатидной кислоты и активация EGFR для заживления ран роговицы ^16,17. Используя высокий уровень глюкозы в качестве патологического фактора, была создана модель гипергликемии ex vivo с замедленным заживлением эпителиальных ран для имитации диабетической кератопатии человека. С помощью этой модели было показано, что балансовые экспрессии IL-1β против IL-1Ra¹⁸ и TGFβ3 против TGFβ1¹⁹ являются важными факторами для правильного заживления ран в роговице, и манипуляции с этими балансами могут быть использованы для лечения диабетической кератопатии. Таким образом, культура органов свиньи представляет собой актуальную, экономичную и манипулирующую экспериментальную систему с различными применениями в тестах на химическую токсичность, биомедицинских исследованиях, открытии лекарств, а также оценке повреждений и восстановления тканей в ответ на воздействие химического оружия на глаза.

В данной статье описан подробный протокол культивирования органов роговицы свиньи, а также проиллюстрированы его применение для оценки потенциального влияния глазных капель НПВП (NS) на здоровье роговицы и для определения сигнальных путей и биологических процессов, участвующих в патогенезе диабетической кератопатии.

протокол

Поскольку свежие роговицы свиней являются побочным продуктом пищевой промышленности, Институциональному комитету по уходу за животными и их использованию не нужно было одобрять их использование для исследований. В отличие от человеческой роговицы, используемой в исследованиях, в ней нет никаких опасений по поводу биологической опасности, а неиспользованные части свиных глаз можно утилизировать как обычный мусор. Реагенты и оборудование, использованные для данного исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка к культуре органов

1. Добавляйте пенициллин-стрептомицин в Minimum essential media (MEM) в качестве добавок перед применением.
2. Приготовьте питательные среды с высоким содержанием глюкозы, добавив 3,6 г D-глюкозы к 1 л дополненного MEM, который содержит 5 мМ глюкозы (что равно 90 мг/дл), чтобы достичь конечной концентрации глюкозы 25 мМ (что равно 450 мг/дл), имитируя гипергликемию у пациентов с сахарным диабетом.
3. Приготовьте 1% агарозу в дополненном МЭМ с 5 мМ или 25 мМ глюкозой, добавив 0,2 г агарозы к 20 мл МЭМ и нагревая ее в микроволновой печи до растворения агарозы.
4. Перелейте раствор, содержащий агарозу, на водяную баню при температуре 48 °C.
5. Перед экспериментом в автоклаве должны быть полностью подготовлены все экспериментальные реагенты, такие как дистиллированная вода, ПБС и хирургическое оборудование: гемостат, щипцы, рукоятка скальпеля, ножницы и трепан, а также мензурки, бумажные полотенца, безворсовые салфетки, перчатки и наконечники для пипеток. Замочите силиконовую форму, лезвие бритвы и держатель лезвия в 70% спирте на 30 минут и трижды промойте стерильным PBS.

2. Подготовка глазного яблока свиньи к культуре роговицы

1. Достаньте свиные глазные яблоки на местной скотобойне и перевезите их в лабораторию на льду во влажной камере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бычьи глаза также можно использовать подобным образом. Тем не менее, бычьи глаза и роговица отличаются от человеческих глаз/роговицы более заметно. Например, роговица человека и свиньи имеет 5-7 слоев эпителиальных клеток, в то время как роговица крупного рогатого скота имеет около 20 слоев^13,14. Кроме того, глаза крупного рогатого скота с большей вероятностью будут загрязнены во время культивирования органов роговицы; Следовательно, для статистического анализа требуется больше бычьих глаз.
2. Поместите свиные глаза в стакан объемом 1 л с стерилизованным PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свиные глазные яблоки собирают в течение 1 часа после убоя и транспортируют в лабораторию примерно через 2 часа. В целом, глаза были использованы в течение 4 ч (шаг 2.3).
3. Подержите глазное яблоко пинцетом и удалите экстраокулярные ткани ножницами в стерильной пластине Петри.
4. Промойте глазные яблоки дистиллированной водой один раз и PBS дважды.
5. Промыть глазные луковицы раствором антисептика «Повидон-йод» в течение 10 с с последующим стерилизованным ПБС трижды промыть.
6. Инкубируйте глазные яблоки в PBS, содержащем гентамицин 20 мкг/мл, в течение 30 мин и дважды промойте их PBS.

3. Повреждение эпителия

1. Проведите глазное яблоко стерилизованными безворсовыми салфетками и отметьте центр роговицы трепаном 6 мм.
2. Аккуратно соскребите эпителиальные клетки в пределах круга, отмеченного трепанами, небольшим скальпелем или затупленным мягким лезвием бритвы, удалите все клеточные остатки, но оставьте базальную мембрану нетронутой, и очистите область раны ватными палочками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпель с собранными эпителиальными клетками можно перенести в микроцентрифужную пробирку, помещенную на лед. Клетки могут быть немедленно лизированы или храниться в морозильной камере при температуре -20 °C в качестве контрольных элементов.

4. Культуральное исследование органов роговицы и моделирование гипергликемии ex vivo

1. Рассеките глазное яблоко, разрезав скальпелем и ножницами по краям роговицы и промойте роговицы в стерилизованном стакане объемом 1000 мл, содержащем PBS (pH 7,4).
2. Поместите вырезанные роговицы вверх ногами в стерильную форму, изготовленную из нетоксичного жидкого силикона, образующего плесень.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Залейте нетоксичную силиконовую жидкость для изготовления форм в отверстия штатива для культуры тканей / пробирки объемом 50 мл, используя дно ультрацентрифужной пробирки объемом 30 мл, чтобы сделать полукруглую форму.
3. Заполните эндотелиальную полость роговицы МЭМ, содержащим 1% агарозы, поддерживаемой при температуре 48 °C, и дайте смеси загустеть при комнатной температуре.
4. Переверните роговицу и перенесите ее в чашку диаметром 35 мм и добавьте 2 мл МЭМ, с тестирующим агентом (агентами) или без него, по каплям на поверхность центральной роговицы, чтобы покрыть область лимбальной конъюнктивы, оставив эпителий открытым для воздуха (Рисунок 1).
5. Поместите чашки для культивирования в увлажненный инкубатор с 5%_CO2 при температуре 37 °C и заменяйте среду свежей средой MEM с тестирующим агентом (агентами) или без него ежедневно в течение 2 дней.
6. Создайте модель гипергликемии ex vivo путем добавления L-глюкозы в MEM для получения общего количества глюкозы 25 мМ, которая используется для получения 1% агарозного геля и в качестве питательных сред.

5. Оценка функции роговицы

1. Определите скорость заживления эпителиальной раны, окрашивая поврежденную роговицу окрашиванием по Ричардсону20, чтобы отметить оставшуюся область раны и сфотографировать ее (рис. 2 и рис. 3). Количественно оцените размер раны с помощью программы Image-J или Photoshop (гистограмма).
2. Обработайте роговицы для гистологического, гистохимического и иммуногистохимического анализов (рис. 2 и рис. 3), вставив их в срезы ОКТ и криостата. Зафиксируйте срезы ледяным ацетоном, окрашивайте с помощью H&E окрашивания или блокируйте 1% BSA в течение 1 часа для окрашивания TUNEL или иммуногистохимии для обнаружения белков и сигнальных молекул (таких как фосфорилированный Erk и ATK).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство коммерчески доступных антител не были проверены на антигены свиней. Однако, если антитело распознает как человеческие, так и мышиные антигены, оно в основном может быть использовано для обнаружения соответствующего свиного антигена вестерн-блоттинга и иммуногистохимии.
3. Промойте окрашенную роговицу PBS и используйте трепан того же размера, чтобы отметить первоначальную рану и удалить эпителиальные клетки в пределах маркерных кругов.
   1. Соберите эпителиальные клетки с помощью небольшого скальпеля, погрузите в скальпель со собранными клетками центрифужную трубку, предварительно охлажденную на льду.
   2. Храните собранные клетки в морозильной камере при температуре -80 °C или немедленно извлеките их и выполните лизис для вестерн-блоттинга и/или ИФА или в буфере для экстракции РНК для ПЦР (при необходимости)10,16,21.

Результаты

Хирургия катаракты является одной из наиболее часто выполняемых процедур во всем мире, а глазные капли играют решающую роль в послеоперационном уходе. Применение глазных капель после операции по удалению катаракты помогает предотвратить такие осложнения, как глазн?...

Обсуждение

Культивируемые роговицы крупного рогатого скота и в основном свиньи использовались для оценки токсичности косметических химикатов, лекарств от глаукомы и нестероидных противовоспалительных препаратов^21,26. Роговица свиньи также испо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235