Evaluación de la toxicidad terapéutica y química mediante el cultivo de órganos de córneas porcinas y la cicatrización de heridas epiteliales

Resumen

El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.

Resumen

Debido a sus similitudes anatómicas y fisiológicas con el ojo humano, el ojo porcino sirve como un modelo robusto para la investigación biomédica y la evaluación de la toxicidad ocular. Se desarrolló un sistema de cultivo de córnea aire/líquido utilizando ojos porcinos, y la cicatrización de heridas epiteliales ex vivo se utilizó como parámetro crítico para estos estudios. Se procesaron córneas frescas de cerdo para el cultivo de órganos, con o sin lesiones epiteliales. Las córneas se cultivaron en una incubadora humidificada de CO₂ al 5% a 37 °C en MEM, con o sin agentes de prueba. Se midió la permeabilidad de la córnea y las tasas de cicatrización de heridas, y las células epiteliales y/o las córneas enteras se pueden procesar para inmunohistoquímica, Western blot y qPCR para análisis moleculares y celulares. En este estudio se describe un protocolo detallado y se presentan dos estudios en los que se utiliza este sistema ex vivo . Los datos muestran que el cultivo de órganos corneales porcinos, combinado con la cicatrización de heridas epiteliales, es un modelo ex vivo adecuado para las pruebas de toxicidad química, el estudio de la queratopatía diabética y la identificación de posibles terapias.

Introducción

Mientras que los modelos celulares poseen poblaciones clonales limitadas y no logran reproducir la arquitectura in vivo de un organismo, el cultivo o explante de órganos ofrece información sobre la función de los órganos, el desarrollo, los mecanismos de la enfermedad y las posibles terapias, al tiempo que proporciona ventajas éticas y fisiológicas sobre otros modelos experimentales ^1,2. Además de reducir el número de animales necesarios, el cultivo de explantes controla y manipula sensiblemente las condiciones circundantes, lo que es ideal para una exploraci....

Protocolo

Dado que las córneas frescas de cerdo son un subproducto de la industria alimentaria, el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales no necesitó aprobar su uso para la investigación. A diferencia de las córneas humanas utilizadas en la investigación, no hay problemas de riesgo biológico y las partes no utilizadas de los ojos de cerdo se pueden desechar como basura normal. Los reactivos y equipos utilizados para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación para el cultivo de órganos

1. Agregue penicilina-estreptomicina al medio esencial mín....

Discusión

Se han utilizado córneas bovinas cultivadas y mayoritariamente porcinas para evaluar la toxicidad de productos químicos cosméticos, medicamentos para el glaucoma y antiinflamatorios no esteroideos^21,26. Las córneas de cerdo también se han utilizado como modelo ex vivo de la queratopatía diabética humana. A diferencia de los ojos de conejo, el ojo de cerdo se asemeja al ojo humano anatómica, fisi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235