Bewertung der therapeutischen und chemischen Toxizität anhand von organgezüchteten Schweinehornhäuten und der Heilung von Epithelwunden

Zusammenfassung

Die ex vivo-Organkultur der Schweinehornhaut und die epitheliale Wundheilung bieten ein wirtschaftliches, ethisches, reproduzierbares und quantitatives Mittel zur Prüfung der Augentoxizität von Chemikalien. Sie helfen auch bei der Aufklärung von Mechanismen, die der Regulation der Epithelisierung und Gewebereparatur zugrunde liegen, sowie bei der Bewertung von Therapeutika zur Behandlung von diabetischer Keratopathie und verzögerter Wundheilung.

Zusammenfassung

Aufgrund seiner anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Auge dient das Schweineauge als robustes Modell für die biomedizinische Forschung und die Bewertung der Augentoxizität. Es wurde ein Luft/Flüssig-Hornhautkultursystem mit Schweineaugen entwickelt, und die ex vivo epitheliale Wundheilung wurde als kritischer Parameter für diese Studien verwendet. Frische Schweinehornhäute wurden für die Organkultur verarbeitet, mit oder ohne Epithelverletzung. Die Hornhäute wurden in einem befeuchteten 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 °C in MEM kultiviert, mit oder ohne Testmittel. Die Hornhautpermeabilität und die Wundheilungsraten wurden gemessen, und Epithelzellen und/oder ganze Hornhäute können für Immunhistochemie, Western Blot und qPCR für molekulare und zelluläre Analysen verarbeitet werden. Diese Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll und stellt zwei Studien vor, die dieses ex vivo-System verwendet haben. Die Daten zeigen, dass die Hornhautorgankultur von Schweinen in Kombination mit der epithelialen Wundheilung ein geeignetes ex vivo-Modell für chemische Toxizitätstests, die Untersuchung der diabetischen Keratopathie und die Identifizierung potenzieller Therapien ist.

Einleitung

Während Zellmodelle über begrenzte klonale Populationen verfügen und die In-vivo-Architektur eines Organismus nicht reproduzieren können, bietet die Organkultur oder das Explantat Einblicke in die Funktion, Entwicklung, Krankheitsmechanismen und potenziellen Therapien von Organen und bietet gleichzeitig ethische und physiologische Vorteile gegenüber anderen experimentellen Modellen ^1,2. Neben der Reduzierung der Anzahl der benötigten Tiere kontrolliert und manipuliert die Kultivierung von Explantaten auch die Umgebungsbedingungen, was ideal für eine detaillierte Untersuchung der Faktoren ist, die die Zellproliferation, Migration, Wundreaktion und zelluläre Differenzierung in einer Organkultur kontrollieren ^2,3. Unter verschiedenen Geweben/Organen wurden Hornhautexplantate, einschließlich^{des menschlichen 4,5,6}, in großem Umfang für die Beurteilung der Augentoxizität, die Beurteilung von Reizungen ^7,8, zur Untersuchung molekularer Mechanismen, die der Stammzellfunktion⁹ und der Wundheilung ^10,11 zugrunde liegen, und für das primäre Offenwinkelglaukom¹² verwendet.

Schweinehornhäute weist mehrere strukturelle und physiologische Ähnlichkeiten mit menschlichen Hornhäuten auf, was sie zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung der Biologie und Krankheiten der menschlichen Hornhaut macht. Strukturell haben beide die Bowman-Schicht, 5-7 Schichten Epithelzellen und eine ähnliche Krümmung und einen ähnlichen Durchmesser. Physiologisch sind sie hochtransparent, haben eine ähnliche Tränenfilmzusammensetzung und Hornhauthydratation, weisen vergleichbare Muster und Funktionen der Hornhautinnervation auf und folgen ähnlichen Wundheilungsprozessen, was sie zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung der menschlichen Hornhautbiologie und -krankheiten macht^13,14. Während menschliche und schweinische Hornhäute leichte Unterschiede in der Anordnung der Kollagenfibrillen und dem Wassergehalt aufweisen, sind ihre Immunsignale und -reaktionen nicht identisch. Diese Unterschiede stellen eine Herausforderung für die Xenotransplantation^{dar 15}. Daher müssen bei der Interpretation experimenteller Daten speziesspezifische Unterschiede berücksichtigt werden.

Im Vergleich zu menschlichen Hornhäuten sind Schweineaugen als Nebenprodukte der Fleischindustrie leicht verfügbar, was sie kostengünstig und für die Forschung leicht zugänglich macht¹⁴. Die Verwendung von Schweinehornhäuten trägt dazu bei, den Bedarf an menschlichen Spenderhornhäuten zu verringern und die ethischen Bedenken im Zusammenhang mit Tierversuchen zu minimieren. Darüber hinaus ermöglicht die Verfügbarkeit vieler Schweinehornhäute auf einmal konsistente und reproduzierbare Experimente, was für zuverlässige Forschungsergebnisse von entscheidender Bedeutung ist.

Ein Hornhaut-Organkultursystem für Schweine wurde ursprünglich verwendet, um Tierversuche mit kosmetischen Chemikalien und Augenmedikamenten zu ersetzen⁷. Dieses System wurde verwendet, um die Wundheilung des Hornhautepithels zu untersuchen und mehrere wichtige Signalwege zu identifizieren, wie z. B. die Ablösung der HB-EGF-Ektodomäne, die Stimulation des Lipidmediators Lysophosphatidsäure und die EGFR-Aktivierung für die Wundheilung der Hornhaut^16,17. Unter Verwendung eines hohen Glukosespiegels als pathologischer Faktor wurde ein ex vivo-Modell der Hyperglykämie mit verzögerter epithelialer Wundheilung etabliert, um die diabetische Keratopathie des Menschen nachzuahmen. Unter Verwendung dieses Modells wurde gezeigt, dass die Gleichgewichtsexpressionen von IL-1β gegenüber IL-1Ra¹⁸ und TGFβ3 gegenüber TGFβ1¹⁹ wichtige Faktoren für die richtige Wundheilung in der Hornhaut sind, und die Manipulation dieser Gleichgewichte kann zur Behandlung der diabetischen Keratopathie eingesetzt werden. Daher stellt die Organkultur von Schweinen ein relevantes, wirtschaftliches und manipulatives Experimentiersystem mit verschiedenen Anwendungen in chemischen Toxizitätstests, in der biomedizinischen Forschung, in der Arzneimittelforschung und bei der Bewertung von Gewebeschäden und -reparaturen als Reaktion auf die Exposition des Auges gegenüber chemischen Waffen dar.

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll der Hornhautorgankultur von Schweinen beschrieben und ihre Anwendungen zur Bewertung der potenziellen Auswirkungen von okulären NSAID (NS) Augentropfen auf die Hornhautgesundheit und zur Bestimmung von Signalwegen und biologischen Prozessen veranschaulicht, die an der Pathogenese der diabetischen Keratopathie beteiligt sind.

Protokoll

Da frische Schweinehornhäute ein Nebenprodukt der Lebensmittelindustrie sind, musste der Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Tieren ihre Verwendung für Forschungszwecke nicht genehmigen. Im Gegensatz zu menschlichen Hornhäuten, die in der Forschung verwendet werden, gibt es keine Bedenken hinsichtlich der biologischen Gefährdung, und unbenutzte Teile von Schweineaugen können als normaler Müll entsorgt werden. Die für diese Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung für die Organkultur

1. Fügen Sie Penicillin-Streptomycin vor der Anwendung als Nahrungsergänzungsmittel zum Minimum essentiellen Medium (MEM) hinzu.
2. Bereiten Sie Nährmedien mit hohem Glukosegehalt vor, indem Sie 3,6 g D-Glukose zu 1 l supplementiertem MEM hinzufügen, das 5 mM Glukose (entspricht 90 mg/dl) enthält, um eine endgültige Glukosekonzentration von 25 mM (entsprechend 450 mg/dl) zu erreichen, die eine Hyperglykämie bei Diabetikern nachahmt.
3. Bereiten Sie 1% Agarose in supplementiertem MEM mit 5 mM oder 25 mM Glukose vor, indem Sie 0,2 g Agarose zu 20 mL MEM hinzufügen und in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose aufgelöst hat.
4. Die agarosehaltige Lösung in ein Wasserbad bei 48 °C überführen.
5. Vor dem Experiment werden alle experimentellen Reagenzien wie destilliertes Wasser, PBS und chirurgische Geräte autoklaviert: Hämostat, Pinzette, Skalpellgriff, Schere und Trephin sowie Becher, Papiertücher, fusselfreie Tücher, Handschuhe und Pipettenspitzen. Weichen Sie die Silikonform, die Rasierklinge und den Klingenhalter 30 Minuten lang in 70%igem Alkohol ein und waschen Sie sie dreimal mit sterilem PBS.

2. Vorbereitung des Augapfels für die Hornhautkultur

1. Besorge dir Augäpfel von Schweinen aus einem örtlichen Schlachthof und transportiere sie auf Eis in einer Feuchtkammer ins Labor.
   HINWEIS: Rinderaugen können auch auf ähnliche Weise verwendet werden. Rinderaugen und -hornhäute unterscheiden sich jedoch deutlicher von menschlichen Augen/Hornhäuten. Zum Beispiel haben menschliche und schweinische Hornhäute 5-7 Schichten von Epithelzellen, während Rinderhornhäute etwa 20 Schichten haben^13,14. Darüber hinaus ist es wahrscheinlicher, dass Rinderaugen während der Hornhautorgankultur kontaminiert werden. Daher werden mehr Rinderaugen für die statistische Analyse benötigt.
2. Die Schweineaugen werden in ein 1-Liter-Becherglas mit sterilisiertem PBS gelegt.
   HINWEIS: Die Augäpfel des Schweins werden innerhalb von 1 h nach der Schlachtung entnommen und in ca. 2 h zum Labor transportiert. Insgesamt wurden die Augen innerhalb von 4 h verwendet (Schritt 2.3).
3. Halten Sie einen Augapfel mit einer Pinzette fest und entfernen Sie das extraokulare Gewebe mit einer Schere in einer sterilen Petriplatte.
4. Spülen Sie die Augäpfel einmal mit destilliertem Wasser und zweimal mit PBS aus.
5. Spülen Sie die Augenzwiebeln 10 s lang mit einer antiseptischen Povidon-Jod-Lösung aus, gefolgt von dreimal sterilisiertem PBS-Waschen.
6. Inkubieren Sie die Augäpfel 30 Minuten lang in PBS mit 20 μg/ml Gentamicin und spülen Sie sie zweimal mit PBS.

3. Epithel-Verwundung

1. Halten Sie einen Augapfel mit sterilisierten, fusselfreien Tüchern fest und markieren Sie die Mitte der Hornhaut mit einem 6 mm Trepan.
2. Kratzen Sie die Epithelzellen innerhalb des Trepan-markierten Kreises vorsichtig mit einem kleinen Skalpell oder einer weichen Rasierklinge ab, entfernen Sie alle Zelltrümmer, lassen Sie aber die Basalmembran intakt, und reinigen Sie den Wundbereich mit Wattestäbchen.
   HINWEIS: Das Skalpell mit den gesammelten Epithelzellen kann in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt werden, das auf Eis gestellt wird. Die Zellen können sofort lysiert oder in einem -20 °C Gefrierschrank gelagert werden, um als Kontrolle zu dienen.

4. Hornhautorgankultur und ex vivo Hyperglykämiemodellierung

1. Präparieren Sie den Augapfel, indem Sie mit einem Skalpell und einer Schere entlang der Hornhaut-Skleral-Ränder schneiden und spülen Sie die Hornhaut in einem sterilisierten 1000-ml-Becherglas ab, das PBS (pH 7,4) enthält.
2. Legen Sie die herausgeschnittenen Hornhäute kopfüber in eine sterile Form aus ungiftigem flüssigem Silikon für die Formenherstellung.
   HINWEIS: Gießen Sie die ungiftige Flüssigkeit zur Herstellung von Silikonformen in die Löcher eines 50-ml-Gewebekultur-/Reagenzglasgestells und verwenden Sie den Boden des 30-ml-Ultrazentrifugenröhrchens, um eine halbrunde Form herzustellen.
3. Füllen Sie die endotheliale Hornhauthöhle mit MEM, das 1 % Agarose enthält, die bei 48 °C gehalten wird, und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur gelieren.
4. Drehen Sie die Hornhäute um und übertragen Sie sie in eine 35-mm-Schale, und fügen Sie 2 ml MEM mit oder ohne Testmittel tropfenweise auf die Oberfläche der zentralen Hornhaut hinzu, um den limbalen Bindehautbereich zu bedecken, wobei das Epithel der Luft ausgesetzt bleibt (Abbildung 1).
5. Die Kulturschalen sind in einen befeuchteten 5 %_{CO 2} -Inkubator bei 37 °C zu stellen und das Medium 2 Tage lang täglich durch frische MEM-Medien mit oder ohne Prüfmittel zu ersetzen.
6. Etablierung eines ex vivo Hyperglykämiemodells durch Zugabe von L-Glukose zu MEM, um insgesamt 25 mM Glukose zu erreichen, die für die Herstellung von 1 % Agarosegel und als Kulturmedium verwendet wird.

5. Beurteilung der Hornhautfunktion

1. Bestimmen Sie die epitheliale Wundheilungsrate, indem Sie die verwundeten Hornhäute mit der Richardson-Färbung20 färben, um den verbleibenden Wundbereich zu markieren und zu fotografieren (Abbildung 2 und Abbildung 3). Quantifizieren Sie die Wundgröße mit Image-J oder Photoshop (Histogramm).
2. Verarbeiten Sie die Hornhäute für histologische, histochemische und immunhistochemische Analysen (Abbildung 2 und Abbildung 3), indem Sie sie in die OCT- und Kryostat-Schnitte einbetten. Fixieren Sie die Abschnitte mit eiskaltem Aceton, färben Sie mit H&E-Färbung oder blockieren Sie 1 h lang mit 1 % BSA für die TUNEL-Färbung oder Immunhistochemie zum Nachweis von Proteinen und Signalmolekülen (z. B. phosphoryliertes Erk und ATK).
   HINWEIS: Die meisten im Handel erhältlichen Antikörper wurden nicht auf Schweineantigene getestet. Erkennt ein Antikörper jedoch sowohl Human- als auch Maus-Antigene, kann er meist zum Nachweis des entsprechenden Schweineantigens Western Blot und Immunhistochemie verwendet werden.
3. Waschen Sie die gefärbten Hornhäute mit PBS und verwenden Sie das gleich große Trepan, um die ursprüngliche Wunde zu markieren und Epithelzellen innerhalb der Markierungskreise zu entfernen.
   1. Mit einem kleinen Skalpell Epithelzellen sammeln, das Skalpell mit den gesammelten Zellen in ein auf Eis vorgekühltes Zentrifugenröhrchen tauchen.
   2. Lagern Sie die gesammelten Zellen in einem Tiefkühlschrank bei -80 °C oder extrahieren Sie sie sofort und führen Sie die Lyse für Western Blotting und/oder ELISA oder in einem RNA-Extraktionspuffer für die PCR durch (falls erforderlich)10,16,21.

Ergebnisse

Die Kataraktoperation ist eine der am häufigsten durchgeführten Eingriffe weltweit, und Augentropfen spielen eine entscheidende Rolle in der postoperativen Versorgung. Das Auftragen von Augentropfen nach einer Kataraktoperation hilft, Komplikationen wie Augeninfektionen, Entzündungen und Makulaödeme zu verhindern. NSAID (NS)-Augentropfen, einschließlich Ketorola, Bromfenac und Nepafenac, wurden häufig zur Behandlung von Schmerzen und Schwellungen des Auges vor, während und nach ei...

Diskussion

Kultivierte Hornhäute von Rindern und hauptsächlich Schweinen wurden verwendet, um die Toxizität von kosmetischen Chemikalien, Glaukommedikamenten und nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln zu beurteilen^21,26. Schweinehornhäute wurden auch als Ex-vivo-Modell für die diabetische Keratopathie beim Menschen verwendet. Im Gegensatz zu Kaninchenaugen ähnelt das Schweineauge anatomisch, physiologis...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235