THP-1 细胞中基于电穿孔的 CRISPR-Cas9 介导的基因敲除和单细胞克隆分离

摘要

THP-1 细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各种生物学相关研究领域功能的模型。本文介绍了一种基于 CRISPR-Cas9 的高效工程和单细胞克隆分离方案，能够产生可靠且可重复的表型数据。

摘要

人急性单核细胞白血病 （AML） THP-1 细胞系被广泛用作研究人单核细胞衍生巨噬细胞功能的模型，包括它们与人类免疫缺陷病毒 （HIV） 等重要人类病原体的相互作用。与其他来源于骨髓的永生化细胞系相比，THP-1 细胞保留了许多完整的炎症信号通路，并显示出更接近原代单核细胞的表型特征，包括在用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA） 处理时分化为巨噬细胞的能力。使用 CRISPR-Cas9 技术通过靶向基因敲除 （KO） 来改造 THP-1 细胞，为更好地表征免疫相关机制（包括病毒与宿主相互作用）提供了一种强大的方法。本文介绍了一种基于高效 CRISPR-Cas9 的工程方案，使用电穿孔将预组装的 Cas9：sgRNA 核糖核蛋白递送到细胞核中。如T7核酸内切酶I测定所评估的那样，使用多个sgRNA靶向略有不同位置的同一位点会导致大DNA片段的缺失，从而提高编辑效率。通过 Sanger 测序验证了 CRISPR-Cas9 介导的基因水平编辑，然后进行了 CRISPR 编辑推断 （ICE） 分析。通过免疫印迹结合功能测定来确认蛋白质耗竭。使用该方案，在目标基因座中实现了高达 100% 的插入缺失和超过 95% 的蛋白质表达降低。高编辑效率使得通过限制稀释来方便地分离单细胞克隆。

引言

THP-1 是从急性白血病 （AML） 患者中分离的人单核细胞衍生细胞系，其表型特征与原代单核细胞非常相似¹。与原代单核细胞衍生的巨噬细胞相比，原代单核细胞衍生的巨噬细胞不会分裂，并且表现出有限的寿命和供体间/供体内表型的变异性，THP-1 细胞几乎可以永久培养，并且具有更均匀的行为，有利于结果的可重复性 ^2,3,4,5,6.值得注意的是，THP-1 细胞可以通过佛波醇-12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA） 分化为巨噬细胞样表型，使其成为一种广泛使用的体外模型，用于研究单核细胞/巨噬细胞对炎症信号的反应 7,8,9,10,11,12,13 或临床相关人类病原体（包括 HIV^{14）感染 14，15,16}。对 THP-1 细胞进行基因工程改造的可能性在许多生物学相关研究领域都引起了人们的兴趣。

成簇的规则间隔短回文重复序列-CRISPR 相关蛋白 9 （CRISPR-Cas9） 是一种原核适应性免疫系统，在 RNA 引导的核酸酶上传递以降解入侵的病毒基因组，该基因组已被重新编程为基因工程工具¹⁷。基因组编辑的过程分三个步骤进行：识别、切割和修复。单向导 RNA （sgRNA） 通过与 20 bp 向导序列的碱基配对，将 Cas9 核酸酶募集到特定的基因组位点。20 bp 基因组靶序列的 3' 直接存在原始间隔区相邻基序 （PAM） 序列会触发 Cas9 介导的 17 和 18 位之间两条 DNA 链（PAM 的 3 bp 5'）的解旋和切割。由此产生的双链断裂 （DSB） 由两条主要修复途径处理。在没有与受损基因座具有同源性的修复模板的情况下，易出错的非同源末端连接 （NHEJ） 通路将引入随机核苷酸插入和/或缺失 （插入缺失），可能导致移码突变和/或引入过早终止密码子 （PTC）。反过来，含 PTC 的 mRNA 通过无义介导的 mRNA 衰变 （NMD） 途径降解成为靶标，最终破坏蛋白质表达/功能 18,19,20。或者，模板依赖性同源定向修复 （HDR） 通路可以作并忠实修复 DSB。这种机制已被用于实现精确的基因编辑，包括敲入和碱基替换。值得注意的是，细胞周期状态是影响 DSB 修复途径选择的重要因素。事实上，NHEJ 在细胞周期的所有阶段都具有活性，而 HDR 主要局限于 S/G2 期²¹。

THP-1 细胞在悬浮液中生长，众所周知，很难用质粒 DNA 转染，这一过程也可能改变其活力和/或分化能力^22,23。使用编码 Cas9 和 sgRNA 的基于 HIV-1 的慢病毒载体进行转导通常用于敲除 （KO） 目标基因²⁴。将 Cas9/sgRNA 盒整合到细胞基因组中可确保延长表达和高效 KO，但也是脱靶效应的持续来源²⁵。或者，预组装的 Cas9：sgRNA 核糖核蛋白 （RNP） 通过电穿孔递送，该方法涉及在施加电脉冲时在质膜和核膜中临时形成孔。在采用这种方法时，保持细胞活力是一个重要的挑战。

在这里，生产了稳定表达 GFP （THP-1_GFP） 的 THP-1 细胞系，作为建立实现基于 CRISPR-Cas9 的高效编辑方案的工具。在设计了同时使用三个 sgRNA 灭活 EGFP 基因的策略（多向导方法）后，使用 GFP 表达作为读数确定了几种电穿孔条件下的 KO 效率。同时监测细胞增殖。通过 T7 核酸内切酶 I （T7EI） 测定和 Sanger 测序确认基因编辑，然后使用 CRISPR 编辑推断 （ICE） 算法进行分析²⁶。随着 THP-1 细胞在电穿孔后恢复正常生长速率，导致高达 95% GFP 表达降低的参数被成功用于灭活内源基因 （SAMHD1） 并产生单细胞 THP-1 克隆。

研究方案

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 使用 CRISPOR 进行指导设计（图 1.1）

注：SnapGene Viewer 软件可用于步骤 4、7 和 10 中，以注释编辑靶位点和目标基因内 PCR 引物杂交的位置。

1. 转到 Ensembl 网站 （www.ensembl.org）。在 Search 框中，选择一个物种并输入目标基因的名称。点击 Go。选择与基因对应的结果（不是转录本）。
2. 单击 Show transcript table（显示转录表），然后选择与 Biotype 列中的金色标记 Protein coding（蛋白质编码）相对应的转录本 ID。进入成绩单页面后，单击左侧菜单中的 Exons。
3. 向下滚动并单击 Download sequence （下载序列）。确保 File format 为 FASTA。在 Settings - Included Sequences （设置 - 包含的序列） 中，取消选择除 Genomic sequence 之外的所有内容。
   在 脚本框的两端的 Flanking sequence 中输入数字 “500”。单击 Preview，选择整个序列（仅选择没有标题的核苷酸），然后复制它 （Ctrl+C）。
4. 打开 SnapGene 查看器并单击 New > DNA file（新建 DNA 文件）。将序列 （Ctrl+V） 粘贴到 Create a sequence 框中。取消选中 Detect common features ，然后选择 Linear in Topology。
   重命名文件并单击 Create。在左侧菜单中，取消选择 Show enzymes （第一个图标）。在窗口底部，选择 Sequence 选项卡。
   注：此步骤允许检索完整的基因序列，包括外显子、内含子和 500 bp 侧翼序列（可选）。后一种信息可用于设计用于扩增位于第一个外显子内的靶位点的 PCR 引物。
5. 返回 Ensembl 网站，在文件预览上向上滚动，然后单击 Back（返回）。现在，将 文件格式 更改为 RTF。在 设置 - 包含的序列 中，取消选择除 Exons 之外的所有内容。在 Show variants （显示变体） 中，选择 No （否）。单击页面顶部的 Download（下载 ）。
6. 打开下载的文件（带有 Word），其中包含外显子序列并以蓝色显示编码序列，从初始 ATG 开始。选择要由 CRISPR-Cas9 定向编辑靶向的外显子（请参阅下面的建议），选择它，然后复制它 （Ctrl+C）。
   1. 目标外显子是早期外显子或编码蛋白质功能重要结构域的外显子。值得注意的是，在靠近 3' UTR 的晚期外显子中建立 PTC 可能无法引发 NMD，从而导致 C 端截短蛋白的表达。相反，在天然起始位点近端的早期外显子中引入 PTC 与非法翻译（ITL，又名选择性翻译起始 （ATI））的风险有关，从而产生 N 末端截短蛋白的意外表达，该蛋白从第一个 ATG 密码子下游的框内翻译起始位点 （TIS） 开始。为了减轻后一种风险，建议使用 ATGpr²⁷ （atgpr.dbcls.jp） 和/或 NetStart 1.0²⁸ （services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/） 评估替代 TIS 的发生。
   2. 确保目标外显子包含编码序列。然而，选择初始 ATG 上游 5'UTR 区的 sgRNA 退火以将其包含在缺失的片段中可能证明是有用的。
   3. 理想情况下，靶向外显子应该是该基因的所有蛋白质编码转录本变体共有的。通过搜索目标基因，在 NCBI 的 Genome Data Viewer （www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/） 上检查是否是这种情况。
      单击显示窗口中的基因名称（绿色）将显示转录本变体（紫色）。外显子由矩形表示。
7. 在 SnapGene 查看器中，按 Ctrl+F、Ctrl+V，然后按 Enter 键搜索外显子序列。按 Ctrl+T 添加新特征，为其命名，将类型更改为“exon”，然后单击 “确定”。
8. 转到 CRISPOR 网站 （http://crispor.gi.ucsc.edu/） 并粘贴步骤 1 中的外显子序列。首先，在 第 2 步 中选择一个参考基因组，然后在 第 3 步中选择要靶向的 PAM 类型，通常为 SpCas9 的 20 bp-NGG。单击 SUBMIT（提交）。
9. 选择两个 sgRNA，使它们之间最多相隔 150 bp，然后在两者之间选择第三个 sgRNA。以下是 sgRNA 选择的一些指南：
   1. MIT 特异性评分与脱靶效应相关。分数越高表示潜在的脱靶越少。右列显示三个预测的脱靶位点，从最不可能到最不可能排序，以及它们的位置（在外显子、内含子或基因间区域）。单击 Show all 可访问预测的脱靶站点的完整列表。如果可能，选择 MIT 评分为 >80 的 sgRNA，优先考虑那些没有脱靶的 0、1 或 2 错配的 sgRNA。此外，应避免使用外显子中具有脱靶的 sgRNA，这些 sgRNA 最有可能影响表型。
   2. 有关预测疗效，请参阅 Doench '16 评分。请注意，高 Doench '16 分数仅表明 sgRNA 更有可能有效。实际疗效必须通过实验确定。因此，选择多个 sgRNA 总是有用的，即使它们不打算一起使用。
   3. GC 含量过高或过低以及某些基序都可能对 sgRNA 效率有害，应避免使用。CRISPOR 突出显示了这些参数。
10. 重复步骤 1.7 将 sgRNA 序列和相关的 PAM 序列添加到 SnapGene Viewer 中的基因序列中。同时，将 sgRNA 序列（不含 PAM）粘贴到文本或 Excel 文件中，以保留订购寡核苷酸时所需的 5'-3' 方向。
11. 对于靶位点的基于 PCR 的扩增，请围绕它设计几个引物。扩增子大小应在 800 到 1000 bp 之间。PrimerQuest 用于设计该方案的引物 （https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest）。或者，CRISPOR 提供了一系列引物来扩增目标基因组区域以及脱靶位点。显示潜在脱靶位点的完整列表（步骤 1.9.1）后，单击右下角的脱靶引物 。

2. 用于电穿孔的试剂和细胞制备（图 1.2）

1. 准备一个 24 孔培养板，通过在电穿孔后用 500 μL 补充有 20% 热灭活（56 °C，30 分钟）、过滤 （0.20 μm） 胎牛血清 （FBS） 的 RPMI 1640 培养基填充孔来回收细胞。不要添加抗生素。将板保存在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中 24 小时，直至电穿孔。
2. 如果 sgRNA 是干燥运输的，则用 TE 缓冲液（10 mM Tris、1 mM EDTA，pH 8.0）再水化至终浓度为 100 μM（即 每 1 nmol sgRNA 10 μL TE 缓冲液）。涡旋30秒，在4°C下孵育过夜以完全再水化，并在短暂的移液器匀浆后，将sgRNA储备液储存在-20°C。 根据最终体积，分装以避免多次冻融循环。
3. 通过在无核酸酶的水中稀释 100 μM 储备液，制备终浓度为 30 μM 的工作 sgRNA 溶液。涡旋 30 秒，并在室温下孵育 5 分钟。
4. 通过在电穿孔试剂盒中包含的 3.5 μL 重悬缓冲液 R 中同时稀释 1 μL 三个 30 μM sgRNA 和 0.5 μL 20 μM Cas9 溶液，以 1：9 的摩尔比组装 Cas9：sgRNA RNP（最终体积为 7 μL，对于一个实验条件;相应地缩放）。短暂涡旋并在室温下孵育 5 分钟。
5. 同时，通过将 0.5 μL 的 20 μM Cas9 添加到 6.5 μL 的重悬缓冲液 R. Vortex 中短暂漩涡并在室温下孵育 5 分钟来制备未经编辑的对照。
6. 向所有样品中加入 5 μL 重悬缓冲液 R，每种电穿孔条件的最终体积为 12 μL。
7. 准备用于电穿孔的 THP-1 细胞。
   1. 通过台盼蓝排除试验评估浓度和活力。在 0.4% 台盼蓝染色溶液中以 1：2 稀释细胞。孵育 30 秒后，充分匀浆，并在计数室的壁中加入 10 μL，采用 Neubauer 改进的网格样式。计数三个大方块，将计数除以 100 得到细胞浓度 （x10⁶ 个细胞/mL）。
      注意：细胞的健康状况会影响它们对电穿孔的敏感性。应注意在最佳条件下进行细胞培养。必须限制在培养箱外的时间，并且应提前准备好所有试剂和溶液并预热。
   2. 对于每种条件，收集相当于 0.2 x 10⁶ 个细胞的体积并离心（336 x g ，5 分钟，20 °C）。
   3. 使用移液管吸出上清液，并将沉淀重悬于 500 μL PBS 中。再次离心（336 x g ，5 分钟，20 °C）。
   4. 使用移液管小心吸出上清液，并用 12 μL RNP 溶液重悬 THP-1 细胞沉淀（步骤 2.6）。

3. 电穿孔系统设置和成核转染（图 1.3）

1. 将移液器站放在生物安全柜下，将电穿孔管放在支架中，并加入 3 mL 缓冲液 E，包含在电穿孔试剂盒中。
2. 打开电穿孔设备后，使用触摸屏设置以下电穿孔参数： 电压 = 1 500 V，持续时间 = 10 ms，数字 = 3。
3. 为电穿孔移液器配备吸头并吸出 10 μL 的 RNP/THP-1 溶液（步骤 2.7.4）。将移液器插入电穿孔管中，然后按电穿孔设备屏幕上的 Start（开始 ）。等待消息 Complete 出现，然后从试管中取出移液器。
4. 将细胞转移到预热的 24 孔板的孔中，并轻轻匀浆。将板放回加湿的培养箱中，让它们不受干扰地静置 72 小时。
   注意：移液 RNP/THP-1 悬液时注意不要产生任何气泡，因为它们会干扰电穿孔程序。如果在没有可见电弧的情况下出现错误消息，请从试管中取出电穿孔移液器，然后再次按下 Start（开始 ）。但是，如果观察到短暂明亮火花形式的电弧，则可能表明存在气泡。即使没有错误消息，电穿孔程序也可能会失败。

4. THP-1 回收率电穿孔后 72 小时（图 1.4）

1. 电穿孔后 72 小时对细胞进行计数以评估浓度（步骤 2.7.1）。
2. 如果有足够的细胞（即 ≥0.6 x 10⁶ 个细胞/mL），用补充有 20% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI 将它们稀释至少 2 倍，并使浓度在 0.3-0.5 x 10⁶ 个细胞/mL 之间。否则，让细胞再恢复 72 小时。
3. 传代并扩增细胞，直到有足够的细胞进行 KO 验证。同时，可以开始分离单细胞克隆（步骤 7）。

5. 通过 T7EI 错配测定进行基因编辑验证（图 1.5）

注意：鉴于 T7EI 识别大于 1 bp 的错配，该测定可能低估了编辑效率。因此，除非经过适当修饰，否则 T7EI 测定对于筛选纯合细胞群（即单细胞克隆）没有用（步骤 5.7）。

1. 评估细胞浓度（步骤 2.7.1）并在 1.5 mL 试管中取出相当于 0.1 x 10⁶ 个细胞的体积。离心（336 x g，5 分钟，20 °C），吸出上清液，并将沉淀重悬于 500 μL PBS 中。再次离心，并使用移液管吸出尽可能多的上清液，而不会干扰沉淀。快速冷冻样品并储存在 -20 °C。
2. 提取基因组 DNA 作为 PCR 扩增的基质。
   1. 用 50 μL DNA 提取溶液重悬沉淀，匀浆，并在 0.2 mL PCR 管中转移整个体积。涡旋并短暂离心（脉冲 3 秒）。
   2. 将试管放入热循环仪中，在 65 °C 下加热 15 分钟，然后在 98 °C 下加热 10 分钟。
   3. 用 90 μL 超纯水稀释提取的 DNA。涡旋并短暂离心（5,000 x g ，3 s）。
3. 用超纯水稀释 PCR 引物（参见 材料表）， 终浓度为 10 μM（即 10 pmol/μL）。
4. 在 0.2 mL PCR 管中制备 PCR 混合物（按照下面的注释）（对于一种条件，最终体积 = 50 μL）。通常，至少有两个条件：KO 和仅使用 Cas9 的未编辑控件。
   注：纯化的基因组 DNA：10 μL;正向和反向引物 （10 μM）：各 2.5 μL，终浓度为 500 nM;反应缓冲液 （5x）：10 μL。添加前充分涡旋。混合 dNTP（每种 25 mM）：0.6 μL，每种 dNTP 的最终浓度为 0.3 mM。DNA 聚合酶：0.5 μL;超纯水：23.9 μL。涡旋并短暂离心（脉冲 3 秒）。
5. 将试管放入热循环仪中，并使用以下设置运行 PCR 程序：
   注：一个循环在 95 °C 下 5 分钟，然后是 30 个循环 [98 °C 20 秒（变性步骤），X °C 15 秒（退火步骤），72 °C 45 秒（伸长步骤）]，然后在 72 °C 下最后一个循环 2 分钟。扩增结束时，取出试管，涡旋并短暂离心（脉冲 3 秒）。退火温度 （X） 是引物的熔解温度 （Tm） 减去 5 °C。
6. 对于多克隆编辑群体：在新的 0.2 mL 试管中，加入 17.5 μL PCR 扩增子和 2 μL NEBuffer 2 （10x），最终体积为 19.5 μL。涡旋并短暂离心（脉冲 3 秒）。或者，为了筛选单细胞克隆，将来自编辑和未编辑对照细胞的 PCR 产物以 1：1 的比例混合（步骤 5.6）（补充图 1）。
7. 对于异源双链体形成，将试管放入热循环仪中并运行以下程序：一个在 95 °C 下循环 10 分钟，一个在 95 °C 至 85 °C 下以 -2 °C/s 的斜坡，一个从 85 °C 到 25 °C 的斜坡为 -0.3 °C/s，并在 10 °C 下进行一次最终冷却循环 HOLD。
8. 异源双链体形成后，向试管中加入 0.5 μL T7EI 溶液。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
9. 准备 1.2% 琼脂糖凝胶：
   1. 在玻璃瓶中称量琼脂糖，并加入适当体积的 1x TAE 缓冲液（40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA，pH 8.3）。将其放入微波炉中，注意不要拧紧盖子。加热数次，直到琼脂糖晶体完全溶解。
      注意：如果需要，混合溶液。不要让它沸腾，否则体积会减少，从而改变琼脂糖浓度。
   2. 加入以 1/20,000 稀释的 DNA 凝胶染料并充分混合。
   3. 将琼脂糖溶液倒入模具中，加入梳子，在室温下凝固。
10. 通过将 5 μL 的 T7EI 消化产物（步骤 5.9）或未消化的 PCR 产物与 5 μL 水和 2 μL 的 6x DNA 上样染料混合来制备用于凝胶电泳的样品。加载样品和分子量标准，并在 80 V 下迁移 45 分钟（时间可根据 DNA 片段的预期大小进行调整）。迁移结束后，使用适当的成像系统获取凝胶的图像。

6. 通过 Sanger 测序分析进行基因编辑验证（图 1.6）

1. 为了表征基因修饰，纯化 PCR 产物（步骤 5.4），并在 Sanger 测序后，使用 ICE 工具 （https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis） 分析结果。
2. 控制在修饰后是否可以生产蛋白质。
   1. 下载 ICE 结果并打开 contribs.txt 文件。
   2. 将编辑后的序列与 WT 对应序列进行比较。绘制插入缺失并验证它们是否出现在目标基因组区域。评估他们的规模。如果插入缺失长度不是 3 的倍数，则会发生移码，并且可能会引入 PTC。预计突变的 mRNA 将经历 NMD 介导的降解。

7. 通过有限稀释分离单细胞克隆（图 1.7）

注：单细胞克隆的分离不是强制性的。然而，如果选择这样做，则重要的是表征多个克隆并将其表型与原始多克隆群体进行比较。

1. 取细胞悬液样品，用培养基稀释 1/2，并评估浓度（步骤 2.7.1）。稀释可提高计数准确性。
2. 执行 2 至 3 个连续稀释步骤，以达到 7 个细胞/mL 的浓度。在圆底 96 孔板中每孔分配 100 μL 细胞悬液（即每孔 0.7 个细胞）。让细胞倒出几个小时，然后在显微镜下观察板以识别含有一个细胞的孔。
3. 定期监测集落形成和生长，并在需要时将细胞转移到更大的培养板或培养瓶中。

8. 通过 HIV-1 限制性试验对 THP-1 KO SAMHD1 细胞进行功能表征

1. 将 THP-1 接种在 24 孔培养板中，每孔 0.25 x 10⁶ 个细胞，溶于 300 μL 补充有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素（完全 RPMI）并含有 300 ng/mL PMA 的 RPMI 中用于分化。将板保存在加湿培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中 24 小时。
2. 用不含 PMA 的完全 RPMI 培养基替换培养基，并将板放回培养箱中再放置 24 小时。
3. 使用真空泵吸出所有培养基。加入 250 μL VSVg 假型 HIV-1-GFP 病毒原液（MOI = 0.5 IFU/细胞）。包括未感染的对照。将板在 4 °C 下放置 2 小时以同步感染。
4. 用 RPMI 洗涤细胞一次。向每个孔中加入 500 μL 完全 RPMI，并在标准条件下孵育 48 小时（时间可以调整）。
5. 去除培养基后，用冷的 1x PBS 洗涤细胞一次。然后，在每个孔中加入 100 μL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。将板置于 37 °C 的培养箱中，直到细胞完全分离（5 分钟就足够了），然后加入 200 μL 完全 RPMI 以灭活酶。将 250 μL 从每个孔转移到 96 孔圆底板中（确保流式细胞仪接受培养板）。
6. 离心板（757 x g ，3 分钟，减速 = 6,20 °C）并使用多通道移液器吸出上清液。用 100 μL 4% PFA 重悬沉淀，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。加入 100 μL 冷的 1X PBS。
7. 通过流式细胞术分析以 GFP 阳性细胞表示的感染率（有关建议的门控策略，请参见 补充图 2 ）。

结果

稳定产生表达 GFP 报告蛋白 （THP-1_GFP） 的 THP-1 细胞系 （图 2A），并用作建立高效 CRISPR-Cas9 介导基因编辑方案的工具。为此，使用 CRISPOR 网络工具²⁹ 设计了靶向 EGFP 基因的 3 个 sgRNA（图 2B），它们以 9：1 的摩尔比同时与 Cas9 复合形成 RNP，然后使用不同的设置通过电穿孔递送到细胞中。接下来，细胞在...

讨论

这里描述了一种方案，以获得成功的 THP-1 细胞系的 CRISPR 介导的编辑。该方法依赖于通过电穿孔/成核转染转移预组装的 sgRNA/Cas9 RNP。选择该策略是为了限制慢病毒介导的 sgRNA/Cas9 盒整合时可能出现的脱靶效应，从而产生核酸酶的持续表达。选择靶向目标基因的多个 sgRNA 以实现可靠和高效的编辑，这增加了产生基因组插入缺失的可能性，从而导致蛋白质表达和功能 KO

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	ClearLine	146560	_
0.4 % trypan blue	Beckman Coulter	383200	_
1.5 mL tube	Eppendorf	3810X	_
24-well plate	Corning	353047	_
6x TriTrack DNA Loading Dye	Thermo scientific	R1161	_
75 cm² Culture Flask Vented Cap	Corning	353136	_
8-Strip PCR Tubes with Caps	Life technologies	AM12230	_
96-well plates Flat bottom	Corning	353072	_
96-well plates Round bottom	Corning	353077	_
Agarose	Euromedex	D5	_
ATGpr	_	_	https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging System	BIO-RAD	12003153	_
Counting slide	NanoEntek	DHC-N04	_
CRISPOR	_	_	http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBS	Gibco	14190094	_
Ensembl	EMBL-EBI	_	https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	_
FlowJo	BD Life Sciences	v10.10	_
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo scientific	SM0323	_
Genome Data Viewer	NCBI	_	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad Prism	Dotmatics	_	Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA Polymerases	Agilent	600679	_
ICE CRISPR Analysis Tool	Synthego	_	https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab Touch	BIO-RAD	_	Version 2.4.0.03
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µL	Invitrogen	MPK1025K	Electroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	_
NetStart 1.0	_	_	https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free Water	Synthego	_	_
PCR primer (EGFP)	Eurofins	_	Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)	Eurofins	_	Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	_
PFA	Electron Microscopy Sciences	15714	_
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	_
PrimerQuest	IDT	_	https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	_
QuickExtract DNA Extraction Solution	Biosearch Technologies	QE09050	_
RPMI 1640, GlutaMAX	Gibco	61870010	_
SnapGene Viewer	Dotmatics	_	Version 7
SpCas9 2NLS Nuclease	Synthego	_	_
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	_
Synthetic sgRNA (EGFP)	Synthego	_	#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetic sgRNA (SAMHD1)	Synthego	_	#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Syringe Plastipak Luer Lock	BD	301229	_
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	1861096	_
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302S	_
TAE buffer UltraPure, 10x	Invitrogen	15558026	400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cells	ATCC	TIB-202	_
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco	25300054	_
ZE5 Cell Analyzer	BIO-RAD	12014135	_