Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Zusammenfassung

Die THP-1-Zelllinie wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen menschlicher Monozyten/Makrophagen in verschiedenen biologiebezogenen Forschungsbereichen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering und Einzelzell-Klonisolierung, das die Produktion robuster und reproduzierbarer phänotypischer Daten ermöglicht.

Zusammenfassung

Die THP-1-Zelllinie der humanen akuten monozytären Leukämie (AML) wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen zu untersuchen, einschließlich ihres Zusammenspiels mit bedeutenden humanen Krankheitserregern wie dem humanen Immundefizienzvirus (HIV). Im Vergleich zu anderen immortalisierten Zelllinien myeloischen Ursprungs behalten THP-1-Zellen viele intakte Entzündungssignalwege bei und weisen phänotypische Merkmale auf, die denen primärer Monozyten ähnlicher sind, einschließlich der Fähigkeit, sich bei Behandlung mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) in Makrophagen zu differenzieren. Der Einsatz der CRISPR-Cas9-Technologie zur Entwicklung von THP-1-Zellen durch gezielten Gen-Knockout (KO) bietet einen leistungsstarken Ansatz zur besseren Charakterisierung immunbezogener Mechanismen, einschließlich Virus-Wirt-Interaktionen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering unter Verwendung von Elektroporation, um vorassemblierte Cas9:sgRNA-Ribonukleoproteine in den Zellkern zu bringen. Die Verwendung mehrerer sgRNAs, die auf denselben Locus an leicht unterschiedlichen Positionen abzielen, führt zur Deletion großer DNA-Fragmente, wodurch die Editierungseffizienz erhöht wird, wie mit dem T7-Endonuklease-I-Assay bewertet wurde. Die CRISPR-Cas9-vermittelte Editierung auf genetischer Ebene wurde durch Sanger-Sequenzierung mit anschließender Inference of CRISPR Edits (ICE)-Analyse validiert. Die Proteinverarmung wurde durch Immunblotting in Verbindung mit einem funktionellen Assay bestätigt. Mit diesem Protokoll wurden bis zu 100% Indels im Ziellocus und eine Abnahme der Proteinexpression um über 95% erreicht. Die hohe Editiereffizienz macht es bequem, einzellige Klone zu isolieren, indem die Verdünnung begrenzt wird.

Einleitung

THP-1 ist eine von humanen Monozyten abgeleitete Zelllinie, die von einem Patienten mit akuter Leukämie (AML) isoliert wurde und phänotypische Merkmale aufweist, die denen der primären Monozyten^{sehr ähnlich sind 1}. Im Vergleich zu primären Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, die sich nicht teilen und sowohl eine begrenzte Lebensdauer als auch eine Variabilität des Phänotyps zwischen und innerhalb der Donoren aufweisen, können THP-1-Zellen praktisch unbegrenzt kultiviert werden und haben ein homogeneres Verhalten, das die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse begünstigt 2,3,4,5,6 . Bemerkenswert ist, dass THP-1-Zellen in Richtung eines Makrophagen-ähnlichen Phänotyps mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) differenziert werden können, was sie zu einem weit verbreiteten In-vitro-Modell macht, um die Reaktionen von Monozyten/Makrophagen auf Entzündungssignale 7,8,9,10,11,12,13 oder eine Infektion durch klinisch relevante humane Krankheitserreger, einschließlich HIV ^{14, zu untersuchen,15,16}. Die Möglichkeit, THP-1-Zellen gentechnisch zu verändern, ist in vielen biologischen Forschungsbereichen von Interesse.

Das CRISPR-assoziierte Protein 9 (CRISPR-Cas9) ist ein prokaryotisches adaptives Immunsystem, das auf RNA-gesteuerte Nuklease zurückgreift, um eindringende virale Genome abzubauen, das als gentechnisches Werkzeug umprogrammiert wurde¹⁷. Der Prozess der Genom-Editierung verläuft in drei Schritten: Erkennen, Spalten und Reparieren. Eine Single-Guide-RNA (sgRNA) rekrutiert die Cas9-Nuklease durch Basenpaarung mit ihrer 20-bp-Guide-Sequenz an einen spezifischen genomischen Locus. Das Vorhandensein einer Protospacer Adjacent Motif (PAM)-Sequenz direkt 3' der genomischen 20-bp-Zielsequenz löst die Cas9-vermittelte Abwicklung und Spaltung an beiden DNA-Strängen zwischen den Positionen 17 und 18 (3-bp 5' der PAM) aus. Der resultierende Doppelstrangbruch (DSB) wird über zwei Hauptreparaturwege verarbeitet. In Ermangelung einer Reparaturschablone, die eine Homologie mit dem beschädigten Locus aufweist, führt der fehleranfällige Non-Homologus End Joining (NHEJ)-Weg zufällige Nukleotidinsertionen und/oder -deletionen (Indels) ein, was möglicherweise zu Frameshift-Mutationen und/oder der Einführung von Codons für vorzeitige Termination (PTC) führt. Im Gegenzug werden PTC-haltige mRNAs durch den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg (NMD) abgebaut, wodurch letztendlich die Proteinexpression/-funktion gestört wird 18,19,20. Alternativ kann der vorlagenabhängige HDR-Pfad (Homology-Directed Repair) den DSB betreiben und originalgetreu reparieren. Dieser Mechanismus wurde genutzt, um eine präzise Geneditierung zu erreichen, einschließlich Knock-Ins und Basensubstitutionen. Es ist erwähnenswert, dass der Zellzyklusstatus ein wichtiger Faktor ist, der die Wahl des DSB-Reparaturwegs beeinflusst. Tatsächlich ist NHEJ in allen Stadien des Zellzyklus aktiv, während HDR hauptsächlich auf die S/G2-Phasen beschränkt ist²¹.

THP-1-Zellen wachsen in Suspension und sind notorisch schwer mit Plasmid-DNA zu transfizieren, ein Verfahren, das möglicherweise auch ihre Lebensfähigkeit und/oder Differenzierungsfähigkeit verändert^22,23. Die Transduktion mit HIV-1-basierten lentiviralen Vektoren, die sowohl für Cas9 als auch für die sgRNA kodieren, wird häufig eingesetzt, um ein Gen von Interesse auszuschalten (KO)²⁴. Die Integration der Cas9/sgRNA-Kassette in das zelluläre Genom gewährleistet eine verlängerte Expression und eine effiziente KO, ist aber auch eine anhaltende Quelle für Off-Target-Effekte²⁵. Alternativ werden die vorassemblierten Cas9:sgRNA-Ribonukleoproteine (RNPs) durch Elektroporation abgegeben, eine Methode, bei der durch Anlegen elektrischer Impulse vorübergehend Poren sowohl in der Plasma- als auch in der Kernmembran gebildet werden. Die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen ist eine wichtige Herausforderung bei diesem Ansatz.

In dieser Arbeit wurde eine THP-1-Zelllinie hergestellt, die GFP (THP-1_GFP) stabil exprimiert, um als Werkzeug zur Etablierung eines Protokolls für eine effiziente CRISPR-Cas9-basierte Editierung zu dienen. Nach der Entwicklung einer Strategie zur Inaktivierung des EGFP-Gens mit drei sgRNAs gleichzeitig (Multi-Guide-Ansatz) wurde die KO-Effizienz unter verschiedenen Elektroporationsbedingungen unter Verwendung der GFP-Expression als Auslesung bestimmt. Parallel dazu wurde die Zellproliferation überwacht. Die Geneditierung wurde sowohl durch einen T7-Endonuklease I (T7EI)-Assay als auch durch eine Sanger-Sequenzierung bestätigt, gefolgt von einer Analyse mit dem Inference of CRISPR Edits (ICE)-Algorithmus²⁶. Parameter, die zu einer Verringerung der GFP-Expression um bis zu 95 % führten, wobei THP-1-Zellen nach der Elektroporation normale Wachstumsraten wiedererlangten, wurden erfolgreich eingesetzt, um ein endogenes Gen (SAMHD1) zu inaktivieren und einzellige THP-1-Klone zu produzieren.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Führungsaufbau mit CRISPOR (Abbildung 1.1)

HINWEIS: Die SnapGene Viewer-Software kann in den Schritten 4, 7 und 10 verwendet werden, um die Editierungszielstelle und die Position der PCR-Primer-Hybridisierung innerhalb des interessierenden Gens zu annotieren.

1. Rufen Sie die Ensembl-Website auf (www.ensembl.org). Wählen Sie im Suchfeld eine Spezies aus und geben Sie den Namen des interessierenden Gens ein. Klicken Sie auf Los. Wählen Sie das Ergebnis aus, das dem Gen entspricht (kein Transkript).
2. Klicken Sie auf Transkripttabelle anzeigen und wählen Sie dann die Transkript-ID aus, die der goldmarkierten Proteincodierung in der Spalte Biotyp entspricht. Sobald Sie sich auf der Transkriptseite befinden, klicken Sie im linken Menü auf Exons .
3. Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf Sequenz herunterladen. Stellen Sie sicher, dass das Dateiformat FACHA ist. Deaktivieren Sie unter Einstellungen - Eingeschlossene Sequenzen alles außer der genomischen Sequenz.
   Geben Sie die Zahl "500" in Flankierende Sequenz an einem der Enden des Transkriptfelds ein. Klicken Sie auf Vorschau, wählen Sie die gesamte Sequenz aus (nur die Nukleotide ohne Header) und kopieren Sie sie (Strg+C).
4. Öffnen Sie SnapGene Viewer und klicken Sie auf Neu > DNA-Datei. Fügen Sie die Sequenz (Strg+V) in das Feld Sequenz erstellen ein. Deaktivieren Sie Allgemeine Features erkennen, und wählen Sie In Topologie die Option Linear aus.
   Benennen Sie die Datei um und klicken Sie auf Erstellen. Deaktivieren Sie im linken Menü die Option Enzyme anzeigen (erstes Symbol). Wählen Sie am unteren Rand des Fensters die Registerkarte Sequenz aus.
   HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht den Abruf der gesamten Gensequenz, einschließlich Exons, Introns und flankierenden Sequenzen mit 500 bp (optional). Diese letztgenannte Information ist nützlich für die Entwicklung von PCR-Primern für die Amplifikation einer Zielstelle, die sich innerhalb des ersten Exons befindet.
5. Scrollen Sie auf der Ensembl-Website in der Dateivorschau nach oben und klicken Sie auf Zurück. Ändern Sie nun das Dateiformat in RTF. Deaktivieren Sie unter Einstellungen - Eingeschlossene Sequenzen alles außer Exons. Wählen Sie unter Varianten anzeigen die Option Nein aus. Klicken Sie oben auf der Seite auf Download .
6. Öffnen Sie die heruntergeladene Datei (mit Word), die die Sequenz der Exons enthält und die Codierungssequenz in Blau anzeigt, beginnend mit dem anfänglichen ATG. Wählen Sie das Exon aus, auf das die CRISPR-Cas9-gerichtete Bearbeitung abzielen soll (Empfehlungen siehe unten), wählen Sie es aus und kopieren Sie es (Strg+C).
   1. Das anvisierte Exon ist entweder ein frühes Exon oder ein Exon, das für eine funktionell wichtige Domäne des Proteins kodiert. Es ist erwähnenswert, dass die Etablierung eines PTC in einem späten Exon in der Nähe der 3'-UTR wahrscheinlich nicht in der Lage sein wird, NMD auszulösen, was zur Expression eines C-terminalen verkürzten Proteins führt. Umgekehrt ist die Einführung eines PTC in einem frühen Exon proximal der nativen Initiationsstelle mit dem Risiko einer illegitimen Translation (ITL, auch bekannt als alternative Translationsinitiation (ATI)) verbunden, die zur unerwarteten Expression eines N-terminalen verkürzten Proteins führt, das an einer In-Frame-Translationsinitiationsstelle (TIS) stromabwärts des ersten ATG-Codons beginnt. Um dieses letztgenannte Risiko zu mindern, wird empfohlen, das Auftreten alternativer TIS mit ATGpr²⁷ (atgpr.dbcls.jp) und/oder NetStart 1.0²⁸ (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/) zu bewerten.
   2. Stellen Sie sicher, dass das Ziel-Exon eine Codierungssequenz enthält. Es könnte sich jedoch als nützlich erweisen, ein sgRNA-Annealing mit der 5'UTR-Region stromaufwärts des ursprünglichen ATG zu wählen, um es in das deletierte Fragment aufzunehmen.
   3. Im Idealfall sollte das zielgerichtete Exon allen proteinkodierenden Transkriptvarianten des Gens gemeinsam sein. Überprüfen Sie, ob dies auf dem Genome Data Viewer (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) des NCBI der Fall ist, indem Sie nach dem interessierenden Gen suchen.
      Ein Klick auf den Gennamen (in grün) im Anzeigefenster zeigt die Transkriptvarianten (in lila) an. Exons werden durch ein Rechteck dargestellt.
7. Drücken Sie in SnapGene Viewer STRG+F, STRG+V und dann die EINGABETASTE , um nach der Sequenz des Exons zu suchen. Drücken Sie Strg+T , um eine neue Funktion hinzuzufügen, benennen Sie sie, ändern Sie den Typ in "exon" und klicken Sie auf OK.
8. Gehen Sie auf die CRISPOR-Website (http://crispor.gi.ucsc.edu/) und fügen Sie die Exon-Sequenz in Schritt 1 ein. Wählen Sie zunächst in Schritt 2 ein Referenzgenom aus und dann in Schritt 3 den Typ des PAM, auf den abgezielt werden soll, in der Regel 20bp-NGG für SpCas9. Klicken Sie auf SENDEN.
9. Wählen Sie zwei sgRNAs aus, so dass sie bis zu 150 bp voneinander entfernt sind, und wählen Sie dann eine dritte sgRNA dazwischen aus. Hier sind einige Richtlinien für die sgRNA-Auswahl:
   1. Der MIT-Spezifitätswert hängt mit Off-Target-Effekten zusammen. Eine höhere Punktzahl weist auf weniger potenzielle Off-Targets hin. In der rechten Spalte werden drei vorhergesagte Off-Target-Stellen angezeigt, die von der wahrscheinlichsten bis zur unwahrscheinlichsten eingestuft sind, zusammen mit ihren Positionen (in einem Exon, einem Intron oder einer intergenen Region). Die vollständige Liste der vorhergesagten Off-Target-Websites kann durch Klicken auf Alle anzeigen aufgerufen werden. Wenn möglich, wählen Sie sgRNAs mit einem MIT-Score >80 aus und priorisieren Sie diejenigen ohne Off-Targets für 0, 1 oder 2 Diskrepanzen. Darüber hinaus sollten sgRNAs mit Off-Targets in einem Exon, die das größte Potenzial zur Beeinflussung des Phänotyps haben, vermieden werden.
   2. Für die vorhergesagte Wirksamkeit beziehen Sie sich auf den Doench '16 Score. Beachten Sie, dass ein hoher Doench '16-Score lediglich darauf hinweist, dass die sgRNA mit größerer Wahrscheinlichkeit wirksam ist. Die tatsächliche Wirksamkeit muss experimentell ermittelt werden. Aus diesem Grund ist es immer sinnvoll, mehrere sgRNAs auszuwählen, auch wenn sie nicht für die gemeinsame Verwendung gedacht sind.
   3. Ein entweder zu hoher oder zu niedriger GC-Gehalt sowie bestimmte Motive können sich nachteilig auf die sgRNA-Effizienz auswirken und sollten vermieden werden. Diese Parameter werden von CRISPOR hervorgehoben.
10. Wiederholen Sie Schritt 1.7, um die sgRNA-Sequenz und die zugehörige PAM-Sequenz zur Gensequenz im SnapGene Viewer hinzuzufügen. Fügen Sie gleichzeitig die sgRNA-Sequenz (ohne PAM) in eine Text- oder Excel-Datei ein, um die bei der Bestellung des Oligonukleotids erforderliche 5'-3'-Ausrichtung beizubehalten.
11. Für die PCR-basierte Amplifikation der Zielstelle entwerfen Sie einige Primer, die sie umgeben. Die Amplikongröße sollte zwischen 800 und 1000 bp liegen. PrimerQuest wurde verwendet, um die Primer für dieses Protokoll zu entwerfen (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Alternativ bietet CRISPOR eine Liste von Primern zur Amplifikation der genomischen Zielregion sowie der Off-Target-Stellen. Nachdem Sie die vollständige Liste der potenziellen Off-Target-Sites (Schritt 1.9.1) angezeigt haben, klicken Sie auf Off-Target-Primer in der unteren rechten Ecke.

2. Reagenz- und Zellvorbereitung für die Elektroporation (Abbildung 1.2)

1. Bereiten Sie eine 24-Well-Kulturplatte vor, um Zellen nach der Elektroporation zu gewinnen, indem Sie die Wells mit 500 μl RPMI 1640-Medium füllen, das mit 20 % hitzeinaktiviertem (56 °C, 30 min), gefiltertem (0,20 μm) fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Fügen Sie keine Antibiotika hinzu. Bewahren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ 24 h bis zur Elektroporation auf.
2. Wenn die sgRNAs trocken versendet werden, rehydrieren Sie sie mit TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 100 μM (d. h. 10 μl TE-Puffer pro 1 nmol sgRNA). 30 s lang vortexen, über Nacht bei 4 °C inkubieren, um eine vollständige Rehydrierung zu ermöglichen, und nach einer kurzen Pipettenhomogenisierung die sgRNA-Stammlösung bei -20 °C lagern. Je nach Endvolumen sind Aliquote zu erstellen, um mehrfache Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
3. Bereiten Sie eine Arbeits-sgRNA-Lösung mit einer Endkonzentration von 30 μM her, indem Sie die 100 μM-Stammlösung in nukleasefreiem Wasser verdünnen. 30 s vortexen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Assemblieren Sie die Cas9:sgRNA-RNPs in einem molaren Verhältnis von 1:9, indem Sie gleichzeitig 1 μl jeder der drei 30 μM sgRNAs und 0,5 μl 20 μM Cas9-Lösungen in 3,5 μl Resuspensionspuffer R verdünnen, der im Elektroporationskit enthalten ist (endgültiges Volumen von 7 μl, für eine Versuchsbedingung; entsprechend skalieren). Kurz vortexen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. In der Zwischenzeit wird eine uneditierte Kontrolle hergestellt, indem 0,5 μl 20 μM Cas9 zu 6,5 μl Resuspensionspuffer R. Vortex gegeben und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert werden.
6. Geben Sie 5 μl Resuspensionspuffer R zu allen Proben, um ein Endvolumen von 12 μl pro Elektroporationsbedingung zu erhalten.
7. Bereiten Sie die THP-1-Zellen für die Elektroporation vor.
   1. Zur Beurteilung der Konzentration und Lebensfähigkeit durch den Trypanblau-Ausschlusstest. Verdünnen Sie die Zellen 1:2 in einer 0,4%igen Trypanblau-Färbelösung. Nach 30 s Inkubation gut homogenisieren und 10 μl in eine Wand einer Zählkammer mit einem von Neubauer verbesserten Gitterstil geben. Zählen Sie drei große Quadrate und teilen Sie die Zählung durch 100, um die Zellkonzentration (x10⁶ Zellen/ml) zu erhalten.
      HINWEIS: Die Gesundheit der Zellen beeinflusst ihre Empfindlichkeit gegenüber Elektroporation. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Zellkultur unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird. Die Zeit außerhalb des Inkubators muss begrenzt werden, und alle Reagenzien und Lösungen sollten im Voraus vorbereitet und aufgewärmt werden.
   2. Für jede Bedingung ein Volumen entnehmen, das 0,2 x 10⁶ Zellen entspricht, und zentrifugieren (336 x g, 5 min, 20 °C).
   3. Der Überstand wird mit einer Pipette aspiriert und das Pellet in 500 μl PBS resuspendiert. Erneut zentrifugieren (336 x g, 5 min, 20 °C).
   4. Der Überstand wird vorsichtig mit einer Pipette aspiriert und das THP-1-Zellpellet mit den 12 μl RNP-Lösung resuspendiert (Schritt 2.6).

3. Aufbau des Elektroporationssystems und Nukleofektion (Abbildung 1.3)

1. Stellen Sie die Pipettenstation unter eine Biosicherheitswerkstatt, setzen Sie einen Elektroporationsschlauch in die Halterung ein und fügen Sie 3 ml Puffer E hinzu, der im Elektroporationskit enthalten ist.
2. Stellen Sie nach dem Einschalten des Elektroporationsgeräts über den Touchscreen die folgenden Elektroporationsparameter ein: Spannung = 1 500 V, Dauer = 10 ms, Zahl = 3.
3. Die Elektroporationspipette mit einer Spitze ausstatten und 10 μl der RNP/THP-1-Lösung aspirieren (Schritt 2.7.4). Führen Sie die Pipette in den Elektroporationsschlauch ein und drücken Sie auf dem Bildschirm des Elektroporationsgeräts auf Start . Warten Sie, bis die Meldung Abgeschlossen angezeigt wird, und entfernen Sie die Pipette aus dem Röhrchen.
4. Übertragen Sie die Zellen in eine Vertiefung der vorgeheizten 24-Well-Platte und homogenisieren Sie sie vorsichtig. Stellen Sie die Platte wieder in den befeuchteten Brutschrank und lassen Sie sie 72 h ungestört ruhen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, beim Pipettieren der RNP/THP-1-Suspension keine Blasen zu bilden, da diese den Elektroporationsvorgang beeinträchtigen. Wenn eine Fehlermeldung angezeigt wird, weil kein Lichtbogen sichtbar ist, entfernen Sie die Elektroporationspipette aus dem Röhrchen und drücken Sie erneut Start . Wenn jedoch ein Lichtbogen in Form eines kurzen hellen Funkens beobachtet wird, kann dies auf das Vorhandensein von Blasen hinweisen. Das Elektroporationsverfahren wird wahrscheinlich fehlschlagen, auch wenn keine Fehlermeldung angezeigt wird.

4. THP-1-Wiederfindung 72 h nach der Elektroporation (Abbildung 1.4)

1. Zählen Sie die Zellen zur Bestimmung der Konzentration (Schritt 2.7.1) 72 h nach der Elektroporation.
2. Wenn genügend Zellen vorhanden sind (d. h. ≥0,6 x 10⁶ Zellen/ml), verdünnen Sie sie mindestens um den Faktor 2 mit RPMI, ergänzt mit 20 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, und bringen Sie die Konzentration zwischen 0,3 und 0,5 x 10⁶ Zellen pro ml. Andernfalls lassen Sie die Zelle weitere 72 Stunden erholen.
3. Passage und Amplifikation der Zellen, bis genügend Zellen für die KO-Validierung vorhanden sind. In der Zwischenzeit kann die Isolierung von einzelligen Klonen eingeleitet werden (Schritt 7).

5. Validierung der Geneditierung durch T7EI-Mismatch-Assay (Abbildung 1.5)

HINWEIS: Der Assay könnte die Editierungseffizienz unterschätzen, da T7EI Fehlanpassungen von mehr als 1 bp erkennt. Daher ist der T7EI-Assay nicht für das Screening homozygoter Zellpopulationen (d. h. Einzelzellklone) geeignet, es sei denn, er wird entsprechend modifiziert (Schritt 5.7).

1. Bestimmen Sie die Zellkonzentration (Schritt 2.7.1) und entnehmen Sie ein Volumen, das 0,1 x 10⁶ Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen entspricht. Zentrifugieren (336 x g, 5 min, 20 °C), den Überstand aspirieren und das Pellet in 500 μl PBS resuspendieren. Erneut zentrifugieren und mit einer Pipette so viel Überstand wie möglich absaugen, ohne das Pellet zu stören. Die Probe wird eingefroren und bei -20 °C gelagert.
2. Extrahieren Sie die genomische DNA, um sie als Matrix für die PCR-Amplifikation zu verwenden.
   1. Resuspendieren Sie das Pellet mit 50 μl DNA-Extraktionslösung, homogenisieren Sie es und übertragen Sie das gesamte Volumen in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen. Vortexen und kurz zentrifugieren (3 s pulsieren).
   2. Legen Sie das Rohr in einen Thermocycler und erhitzen Sie es 15 Minuten lang auf 65 °C, gefolgt von 98 °C für 10 Minuten.
   3. Verdünnen Sie die extrahierte DNA mit 90 μl Reinstwasser. Vortexen und kurz zentrifugieren (5.000 x g, 3 s).
3. Verdünnen Sie den PCR-Primer (siehe Materialtabelle) in Reinstwasser auf eine Endkonzentration von 10 μM (d. h. 10 pmol/μL).
4. Bereiten Sie die PCR-Mischung (gemäß der nachstehenden Anmerkung) in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen vor (Endvolumen = 50 μl, für eine Bedingung). Normalerweise gibt es mindestens zwei Bedingungen: das KO und das unbearbeitete Steuerelement nur mit Cas9.
   HINWEIS: Gereinigte genomische DNA: 10 μl; Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM): je 2,5 μL, die Endkonzentration beträgt 500 nM; Reaktionspuffer (5x): 10 μL. Vor der Zugabe gut vortexen. Mischen Sie dNTP (je 25 mM): 0,6 μl, Endkonzentration von 0,3 mM für jedes dNTP. DNA-Polymerase: 0,5 μL; Reinstwasser: 23,9 μL. Vortex und kurz zentrifugieren (3 s pulsieren).
5. Legen Sie die Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das PCR-Programm mit den folgenden Einstellungen aus:
   HINWEIS: Ein Zyklus bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen [98 °C für 20 s (Denaturierungsschritt), X °C für 15 s (Glühschritt), 72 °C für 45 s (Dehnungsschritt)], dann ein letzter Zyklus bei 72 °C für 2 min. Entfernen Sie am Ende der Amplifikation die Röhrchen, den Wirbel und zentrifugieren Sie kurz (Impuls für 3 s). Die Glühtemperatur (X) ist die Schmelztemperatur (Tm) der Primer minus 5 °C.
6. Für eine polyklonale editierte Population: In ein neues 0,2-ml-Röhrchen 17,5 μl des PCR-Amplikons und 2 μl NEBuffer 2 (10x) für ein Endvolumen von 19,5 μl geben. Vortex und kurz zentrifugieren (Puls für 3 s). Alternativ können zum Screening von Einzelzellklone 1:1 der PCR-Produkte sowohl aus den editierten als auch aus den uneditierten Kontrollzellen gemischt werden (Schritt 5.6) (Ergänzende Abbildung 1).
7. Für die Heteroduplex-Bildung legen Sie die Rohre in den Thermocycler und führen das folgende Programm durch: einen Zyklus bei 95 °C für 10 min, einen mit einer Rampe von -2 °C/s von 95 auf 85 °C, einen mit einer Rampe von -0,3 °C/s von 85 auf 25 °C und einen abschließenden Kühlzyklus bei 10 °C in der WARTESCHLEIFE.
8. Nach der Heteroduplex-Bildung werden 0,5 μl T7EI-Lösung in das Röhrchen gegeben. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
9. Bereiten Sie ein 1,2%iges Agarose-Gel vor:
   1. Wiegen Sie die Agarose in einer Glasflasche und fügen Sie das entsprechende Volumen von 1x TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,3) hinzu. Stellen Sie es in die Mikrowelle und achten Sie darauf, die Kappe nicht fest zu schrauben. Mehrmals erhitzen, bis sich die Agarosekristalle vollständig aufgelöst haben.
      HINWEIS: Falls erforderlich, mischen Sie die Lösung. Lassen Sie es nicht kochen, da sonst das Volumen abnimmt und sich die Agarosekonzentration verändert.
   2. Fügen Sie den DNA-Gel-Fleck mit 1/20.000 verdünnt hinzu und mischen Sie ihn gut.
   3. Gießen Sie die Agaroselösung in eine Form, fügen Sie einen Kamm hinzu und lassen Sie sie bei Raumtemperatur erstarren.
10. Bereiten Sie die Proben für die Gelelektrophorese vor, indem Sie 5 μl der T7EI-Aufschlussprodukte (Schritt 5.9) oder das unverdaute PCR-Produkt mit 5 μl Wasser und 2 μl 6x DNA-Beladungsfarbstoff mischen. Laden Sie die Proben- und Größenleiter und migrieren Sie 45 Minuten lang bei 80 V (die Zeit kann je nach erwarteter Größe der DNA-Fragmente angepasst werden). Sobald die Migration abgeschlossen ist, nehmen Sie ein Bild des Gels mit einem geeigneten Bildgebungssystem auf.

6. Validierung der Geneditierung durch Sanger-Sequenzierungsanalyse (Abbildung 1.6)

1. Um die genetische Veränderung zu charakterisieren, reinigen Sie die PCR-Produkte (Schritt 5.4) und analysieren Sie nach der Sanger-Sequenzierung die Ergebnisse mit dem ICE-Tool (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
2. Kontrollieren Sie, ob ein Protein trotz der Modifikationen hergestellt werden kann.
   1. Laden Sie die ICE-Ergebnisse herunter und öffnen Sie die contribs.txt Datei.
   2. Vergleichen Sie die bearbeiteten Sequenzen mit dem WT-Gegenstück. Kartieren Sie die Indels und stellen Sie sicher, dass sie in der gewünschten genomischen Region entstanden sind. Beurteilen Sie ihre Größe. Wenn die Indellänge kein Vielfaches von drei ist, kommt es zu einer Frameshift, und es wird möglicherweise ein PTC eingeführt. Die mutierte mRNA wird voraussichtlich einen NMD-vermittelten Abbau durchlaufen.

7. Isolierung eines Einzelzellklons durch Begrenzung der Verdünnung (Abbildung 1.7)

HINWEIS: Die Isolierung von einzelligen Klonen ist nicht obligatorisch. Wenn Sie sich jedoch dafür entscheiden, ist es wichtig, mehrere Klone zu charakterisieren und ihren Phänotyp mit der ursprünglichen polyklonalen Population zu vergleichen.

1. Es wird eine Probe der Zellsuspension entnommen, sie zu 1/2 mit Kulturmedium verdünnt und die Konzentration bestimmt (Schritt 2.7.1). Die Verdünnung erhöht die Zählgenauigkeit.
2. Führen Sie 2 bis 3 serielle Verdünnungsschritte durch, um eine Konzentration von 7 Zellen/ml zu erreichen. Geben Sie 100 μl der Zellsuspension pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden ab (d. h. 0,7 Zellen pro Vertiefung). Lassen Sie die Zelle einige Stunden dekantieren, bevor Sie die Platten am Mikroskop betrachten, um Vertiefungen zu identifizieren, die eine Zelle enthalten.
3. Überwachen Sie regelmäßig die Koloniebildung und das Wachstum und übertragen Sie die Zellen bei Bedarf in eine größere Kulturplatte oder einen größeren Kolben.

8. Funktionelle Charakterisierung von THP-1 KO SAMHD1 Zellen mittels HIV-1 Restriktionsassay

1. THP-1 in einer 24-Well-Kulturplatte mit 0,25 x 10⁶ Zellen pro Well in 300 μl RPMI, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin (vollständiges RPMI) und mit 300 ng/ml PMA zur Differenzierung. Bewahren Sie die Platte 24 h lang in einem befeuchteten Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) auf.
2. Ersetzen Sie das Medium durch ein PMA-freies RPMI-Vollmedium und stellen Sie die Platte für weitere 24 h wieder in den Inkubator.
3. Saugen Sie mit einer Vakuumpumpe das gesamte Kulturmedium ab. 250 μl VSVg-pseudotypisierte HIV-1-GFP-Virus-Stammlösung (MOI = 0,5 IFU/Zelle) zugeben. Schließen Sie ein nicht infiziertes Steuerelement ein. Stellen Sie die Platte 2 Stunden lang bei 4 °C auf, um die Infektion zu synchronisieren.
4. Waschen Sie die Zellen einmal mit RPMI. Geben Sie 500 μl vollständiges RPMI in jede Vertiefung und inkubieren Sie 48 Stunden lang unter Standardbedingungen (die Zeit kann angepasst werden).
5. Nach der Entnahme des Nährmediums die Zellen einmal mit kaltem 1x PBS waschen. Geben Sie dann 100 μl 0,05 % Trypsin-EDTA in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in einen Inkubator, bis sich die Zellen vollständig gelöst haben (5 Minuten sollten ausreichen), bevor Sie 200 μl vollständiges RPMI hinzufügen, um das Enzym zu inaktivieren. Übertragen Sie 250 μl aus jeder Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden (stellen Sie sicher, dass das Durchflusszytometer Kulturplatten akzeptiert).
6. Die Platte zentrifugieren (757 x g, 3 min, Verzögerung = 6, 20 °C) und den Überstand mit einer Mehrkanalpipette ansaugen. Das Pellet mit 100 μl 4 % PFA resuspendieren und 10 min bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie 100 μl kaltes 1X PBS hinzu.
7. Analysieren Sie die Infektionsrate, dargestellt durch GFP-positive Zellen, mittels Durchflusszytometrie (siehe Ergänzende Abbildung 2 für eine vorgeschlagene Gating-Strategie).

Ergebnisse

Es wurde eine THP-1-Zelllinie erzeugt, die das GFP-Reporterprotein (THP-1_GFP) stabil exprimiert (Abbildung 2A) und als Werkzeug zur Etablierung eines Protokolls für eine effiziente CRISPR-Cas9-vermittelte Genedition verwendet. Zu diesem Zweck wurden mit dem CRISPOR-Web-Tool^{29 (Abbildung 2B}) 3 sgRNAs, die auf das EGFP-Gen abzielen, mit dem CRISPOR-Web-Tool 29 (Abbildung 2B) entwickelt, die gleic...

Diskussion

In dieser Arbeit wird ein Protokoll beschrieben, um eine erfolgreiche CRISPR-vermittelte Editierung der THP-1-Zelllinie zu erhalten. Der Ansatz beruht auf dem Transfer von vorassemblierten sgRNA/Cas9 RNPs durch Elektroporation/Nukleofektion. Diese Strategie wurde gewählt, um die Off-Target-Effekte zu begrenzen, die möglicherweise bei der lentiviralen Integration der sgRNA/Cas9-Kassette auftreten und eine persistente Expression der Nuklease ermöglichen. Mehrere sgRNAs, die auf das inte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	ClearLine	146560	_
0.4 % trypan blue	Beckman Coulter	383200	_
1.5 mL tube	Eppendorf	3810X	_
24-well plate	Corning	353047	_
6x TriTrack DNA Loading Dye	Thermo scientific	R1161	_
75 cm² Culture Flask Vented Cap	Corning	353136	_
8-Strip PCR Tubes with Caps	Life technologies	AM12230	_
96-well plates Flat bottom	Corning	353072	_
96-well plates Round bottom	Corning	353077	_
Agarose	Euromedex	D5	_
ATGpr	_	_	https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging System	BIO-RAD	12003153	_
Counting slide	NanoEntek	DHC-N04	_
CRISPOR	_	_	http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBS	Gibco	14190094	_
Ensembl	EMBL-EBI	_	https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	_
FlowJo	BD Life Sciences	v10.10	_
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo scientific	SM0323	_
Genome Data Viewer	NCBI	_	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad Prism	Dotmatics	_	Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA Polymerases	Agilent	600679	_
ICE CRISPR Analysis Tool	Synthego	_	https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab Touch	BIO-RAD	_	Version 2.4.0.03
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µL	Invitrogen	MPK1025K	Electroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	_
NetStart 1.0	_	_	https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free Water	Synthego	_	_
PCR primer (EGFP)	Eurofins	_	Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)	Eurofins	_	Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	_
PFA	Electron Microscopy Sciences	15714	_
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	_
PrimerQuest	IDT	_	https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	_
QuickExtract DNA Extraction Solution	Biosearch Technologies	QE09050	_
RPMI 1640, GlutaMAX	Gibco	61870010	_
SnapGene Viewer	Dotmatics	_	Version 7
SpCas9 2NLS Nuclease	Synthego	_	_
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	_
Synthetic sgRNA (EGFP)	Synthego	_	#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetic sgRNA (SAMHD1)	Synthego	_	#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Syringe Plastipak Luer Lock	BD	301229	_
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	1861096	_
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302S	_
TAE buffer UltraPure, 10x	Invitrogen	15558026	400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cells	ATCC	TIB-202	_
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco	25300054	_
ZE5 Cell Analyzer	BIO-RAD	12014135	_