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要約

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。

要約

ヒト急性単球性白血病(AML)THP-1細胞株は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)などの重要なヒト病原体との相互作用を含む、ヒト単球由来マクロファージの機能を研究するモデルとして広く使用されています。骨髄系起源の他の不死化細胞株と比較して、THP-1細胞は多くの無傷の炎症性シグナル伝達経路を保持し、ホルボール-12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)で処理するとマクロファージに分化する能力など、初代単球の表現型により近い表現型の特徴を示します。CRISPR-Cas9技術を使用して標的遺伝子ノックアウト(KO)を通じてTHP-1細胞を操作することで、ウイルスと宿主の相互作用を含む免疫関連メカニズムをより適切に特徴付ける強力なアプローチが可能になります。この記事では、エレクトロポレーションを使用して事前にアセンブルされたCas9:sgRNAリボ核タンパク質を細胞核に送達する効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングのプロトコルについて説明します。わずかに異なる位置で同じ遺伝子座を標的とする複数のsgRNAを使用すると、大きなDNA断片が欠失し、T7エンドヌクレアーゼIアッセイで評価されているように、編集効率が向上します。CRISPR-Cas9を介した遺伝子レベルでの編集は、サンガーシーケンシングとそれに続くCRISPR編集の推論(ICE)解析によって検証されました。タンパク質の枯渇は、イムノブロッティングと機能アッセイの組み合わせによって確認されました。このプロトコルを使用すると、標的遺伝子座の最大100%のインデルとタンパク質発現の95%以上の減少が達成されました。編集効率が高いため、希釈を制限してシングルセルクローンを単離するのに便利です。

概要

THP-1は、急性白血病(AML)患者から単離されたヒト単球由来細胞株であり、初代単球1によく似た表現型の特徴を示します。初代単球由来マクロファージは、分裂せず、限られた寿命と表現型のドナー間/ドナー内変動の両方を示さないため、THP-1細胞は事実上永久に培養でき、結果の再現性に有利なより均一な挙動を持つことができます2,3,4,5,6 .特に、THP-1細胞は、ホルボール-12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)でマクロファージ様表現型に分化させることができるため、炎症シグナル7,8,9,10,11,12,13に対する単球/マクロファージの応答や、HIVを含む臨床的に重要なヒト病原体による感染を調査するためのin vitroモデルとして広く使用されています、15、16。THP-1細胞を遺伝子操作する可能性は、多くの生物学関連研究分野で注目されています。

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9 (CRISPR-Cas9) は、RNA誘導ヌクレアーゼを中継して侵入するウイルスゲノムを分解する原核生物の適応免疫系であり、遺伝子工学ツールとして再プログラムされている17.ゲノム編集のプロセスは、認識、切断、修復の3つのステップで進行します。シングルガイドRNA(sgRNA)は、Cas9ヌクレアーゼを20 bpガイド配列との塩基対形成を通じて特定のゲノム遺伝子座にリクルートします。20 bpゲノム標的配列の直接3'にProtospacer Adjacent Motif(PAM)配列が存在すると、位置17と18の間の両方のDNA鎖(PAMの3 bp 5')でCas9を介した巻き戻しと切断が引き起こされます。結果として生じる二本鎖切断(DSB)は、2つの主要な修復経路によって処理されます。損傷した遺伝子座と相同性を持つ修復テンプレートがない場合、エラーが発生しやすい非相同末端結合(NHEJ)経路は、ランダムなヌクレオチドの挿入および/または欠失(インデル)を導入し、フレームシフト変異および/または早期終結コドン(PTC)の導入につながる可能性があります。次に、PTC含有mRNAは、ナンセンス媒介性mRNA崩壊(NMD)経路による分解の標的となり、最終的にタンパク質の発現/機能を破壊する18,19,20。あるいは、テンプレート依存のHomology-Directed Repair(HDR)経路がDSBを操作し、忠実に修復することができます。このメカニズムを利用して、ノックインや塩基置換などの正確な遺伝子編集を実現しています。細胞周期の状態がDSB修復経路の選択に影響を与える重要な要素であることは注目に値します。実際、NHEJは細胞周期のすべての段階で活性がありますが、HDRは主にS/G2期に限定されています21。

THP-1細胞は懸濁液中で増殖し、プラスミドDNAによるトランスフェクションが難しいことで有名であり、この手続きはおそらくその生存率および/または分化能力をも変える22,23。Cas9とsgRNAの両方をコードするHIV-1ベースのレンチウイルスベクターによる形質導入は、目的の遺伝子をノックアウト(KO)するためによく用いられる24。Cas9/sgRNAカセットを細胞ゲノムに組み込むことで、長時間の発現と効率的なKOが保証されますが、オフターゲット効果の持続的な供給源でもあります25。あるいは、事前に組み立てられたCas9:sgRNAリボ核タンパク質(RNP)は、電気インパルスの印加時にプラズマ膜と核膜の両方に一時的に細孔を形成する方法であるエレクトロポレーションによって送達されます。このアプローチを行う際には、細胞の生存率を維持することが重要な課題です。

ここでは、CRISPR-Cas9を用いた効率的な編集を実現するためのプロトコールを確立するためのツールとして、GFPを安定的に発現するTHP-1細胞株(THP-1_GFP)を作製しました。3つのsgRNAを同時に使用して EGFP 遺伝子を不活性化する戦略を設計した後(マルチガイドアプローチ)、GFP発現を読み取りとして、いくつかのエレクトロポレーション条件でのKO効率を決定しました。細胞増殖を並行してモニターしました。遺伝子編集は、T7エンドヌクレアーゼI(T7EI)アッセイとサンガーシーケンシングの両方によって確認され、続いてICE(Inference of CRISPR Edits)アルゴリズムによる解析が行われました26。エレクトロポレーション後にTHP-1細胞が正常な増殖速度を回復すると、GFP発現が最大95%減少するパラメータを使用して、内因性遺伝子(SAMHD1)を不活性化し、シングルセルTHP-1クローンを作製することに成功しました。

プロトコル

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. CRISPORによるガイド設計(図1.1)

注:SnapGene Viewerソフトウェアは、ステップ4、7、および10で、編集ターゲット部位と目的の遺伝子内のPCRプライマーハイブリダイゼーションの位置をアノテーションするために使用できます。

  1. Ensembl の Web サイト (www.ensembl.org) にアクセスします。検索 ボックスで、種を選択し、目的の遺伝子の名前を入力します。 [実行]をクリックします。遺伝子に対応する結果を選択します(転写産物ではありません)。
  2. 「転写産物テーブルを表示」をクリックし、「Biotype」列の金色の「Protein coding」に対応する転写産物IDを選択します。転写産物のページで、左側のメニューのExonsをクリックします。
  3. 下にスクロールして、[ Download sequence]をクリックします。ファイル形式がFASTAであることを確認してください。 「設定」 - 「含まれる配列」で、「 ゲノム配列」以外のすべての選択を解除します。
    トランスクリプトボックスの両端にあるFlanking sequenceに番号「500」を入力します。「プレビュー」をクリックし、シーケンス全体(ヘッダーのないヌクレオチドのみ)を選択してコピーします(Ctrl + C)。
  4. SnapGene Viewerを開き、[新しい>DNAファイル]をクリックします。シーケンス (Ctrl+V) を [シーケンスの作成] ボックスに貼り付けます。[一般的なフィーチャを検出] のチェックを外し、[トポロジ] で [線形] を選択します。
    ファイルの名前を変更し、[ 作成]をクリックします。左側のメニューで、「 酵素を表示 」(最初のアイコン)の選択を解除します。ウィンドウの下部にある [ Sequence ] タブを選択します。
    注:このステップでは、エクソン、イントロン、および500 bpの隣接配列(オプション)を含む完全な遺伝子配列を検索することができます。この後者の情報は、第1エクソン内に位置する標的部位を増幅するためのPCRプライマーの設計に役立ちます。
  5. Ensembl の Web サイトに戻り、ファイルのプレビューを上にスクロールして [戻る] をクリックします。次に、 ファイル形式 をRTFに変更します。 Settings - Included Sequencesで、 Exons以外のすべての選択を解除します。 [バリアントの表示] で [いいえ] を選択します。ページ上部の[ ダウンロード ]をクリックします。
  6. ダウンロードしたファイル(Word)を開きます。このファイルにはエクソンの配列が含まれており、最初のATGから始まるコーディングシーケンスが青色で表示されます。CRISPR-Cas9による編集の対象となるエクソンを選択し(推奨事項については以下を参照)、選択してコピーします(Ctrl + C)。
    1. 標的エクソンは、初期エクソンまたはタンパク質の機能的に重要なドメインをコードするエクソンのいずれかです。3' UTRに近い後期エクソンにPTCが確立すると、NMDが引き起こされず、C末端に切断されたタンパク質が発現する可能性が高いことは注目に値します。逆に、ネイティブ開始部位に近接する初期エクソンにPTCを導入すると、違法な翻訳(ITL、別名代替翻訳開始(ATI))のリスクと関連し、最初のATGコドンの下流にあるインフレーム翻訳開始部位(TIS)から始まるN末端切断タンパク質の予期しない発現が生じます。この後者のリスクを軽減するには、ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) や NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/) を使用して、代替 TIS の発生を評価することをお勧めします。
    2. 標的エクソンにコード配列が含まれていることを確認してください。しかし、最初のATGの上流に5'UTR領域を持つsgRNAアニーリングを選択して、それを欠失フラグメントに含めることが有用であることが証明されるかもしれません。
    3. 理想的には、標的エクソンは、遺伝子のすべてのタンパク質コード転写産物バリアントに共通であるべきです。NCBIのGenome Data Viewer(www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/)で目的の遺伝子を検索し、その通りか確認してください。
      表示ウィンドウ上の遺伝子名(緑色)をクリックすると、転写産物のバリアント(紫色)が表示されます。エクソンは長方形で表されます。
  7. SnapGene Viewerで、 Ctrl+F、Ctrl+V、 Enter を押してエクソンの配列を検索します。 Ctrl + T を押して新しい機能を追加し、名前を付け、タイプを「exon」に変更して、[ OK]をクリックします。
  8. CRISPOR の Web サイト(http://crispor.gi.ucsc.edu/)にアクセスし、ステップ 1 のエクソン配列を貼り付けます。まず、 ステップ2 で参照ゲノムを選択し、 次にステップ3でターゲットとするPAMのタイプ(通常はSpCas9の場合は20bp-NGG)を選択します。 [送信]をクリックします。
  9. 最大 150 bp 離れるように 2 つの sgRNA を選択し、その間に 3 つ目の sgRNA を選択します。ここでは、sgRNA選択のガイドラインをいくつか紹介します。
    1. MIT特異度スコアは、オフターゲット効果に関連しています。スコアが高いほど、潜在的なオフターゲットが少ないことを示します。右の列には、可能性の高いものから最も低いものへとランク付けされた 3 つの予測オフターゲット部位と、その位置 (エクソン、イントロン、または遺伝子間領域) が表示されます。予測されるオフターゲットサイトの完全なリストにアクセスするには、[ すべて表示]をクリックします。可能であれば、MITスコアが>80のsgRNAを選択し、0、1、または2のミスマッチに対してオフターゲットがないものを優先します。さらに、エクソンにオフターゲットを持つsgRNAは、表現型に影響を与える可能性が最も高いため、避けるべきです。
    2. 予測される有効性については、Doench '16 スコアを参照してください。Doench '16のスコアが高いということは、単にsgRNAが有効である可能性が高いことを示しているに過ぎません。実際の有効性は実験的に決定する必要があります。.このため、複数のsgRNAを一緒に使用することを意図していない場合でも、選択することは常に有用です。
    3. GC含量が高すぎたり低すぎたりすると、また特定のモチーフと同様に、sgRNAの効率に悪影響を与える可能性があるため、避けるべきです。これらのパラメータは、CRISPORによって強調表示されます。
  10. 手順1.7を繰り返して、SnapGene ViewerでsgRNA配列と関連するPAM配列を遺伝子配列に追加します。同時に、sgRNA配列(PAMなし)をテキストファイルまたはExcelファイルに貼り付けて、オリゴヌクレオチドを注文する際に必要な5'-3'配向を保持します。
  11. ターゲット部位のPCRベースの増幅のためには、その周囲をいくつかのプライマーで設計します。アンプリコンのサイズは 800 から 1000 bp の間である必要があります。PrimerQuestは、このプロトコル(https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest)のプライマーを設計するために使用されました。あるいは、CRISPORは、標的ゲノム領域とオフターゲット部位を増幅するためのプライマーのリストを提供します。オフターゲット候補部位の全リストを表示した後(ステップ1.9.1)、右下隅にあるオフターゲットプライマー をクリックします。

2. エレクトロポレーション用の試薬と細胞の調製(図1.2)

  1. エレクトロポレーション後に細胞を回収するための24ウェル培養プレートを調製し、20%熱不活性化(56°C、30分)を添加した500μLのRPMI 1640培地をウェルに充填し、ろ過(0.20μm)したウシ胎児血清(FBS)を充填します。抗生物質は追加しないでください。プレートを37°Cおよび5%CO2 の加湿インキュベーターに、エレクトロポレーションまで24時間保管します。
  2. sgRNAが乾燥して出荷される場合は、TEバッファー(10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 8.0)で最終濃度100 μM(つまり 、sgRNA1 nmolあたり10 μLのTEバッファー)まで再水和します。ボルテックスで30秒間、4°Cで一晩インキュベートして完全な再水和を行い、短時間のピペット均質化後、sgRNAストック溶液を-20°Cで保存します。 最終的な量に応じて、複数回の凍結融解サイクルを避けるためにアリコートを作成します。
  3. 100 μMのストック溶液をヌクレアーゼフリーの水で希釈することにより、最終濃度30 μMの作業用sgRNA溶液を調製します。ボルテックスを30秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。
  4. エレクトロポレーションキットに含まれる3.5 μLの再懸濁バッファーRに、3つの30 μM sgRNAのそれぞれ1 μLと20 μM Cas9溶液0.5 μLを同時に希釈することにより、Cas9:sgRNPを1:9モル比で組み立てます(最終容量は1つの実験条件で7 μL、それに応じてスケールアップ)。短時間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。
  5. その間に、0.5 μL の 20 μM Cas9 を 6.5 μL の再懸濁バッファー R. Vortex に短時間加えて未編集のコントロールを調製し、室温で 5 分間インキュベートします。
  6. 5 μLの再懸濁バッファーRをすべてのサンプルに加えると、エレクトロポレーション条件あたり最終容量が12 μLになります。
  7. エレクトロポレーション用のTHP-1セルを調製します。
    1. トリパンブルー除外試験による濃度と生存率の評価。細胞を0.4%トリパンブルー染色溶液で1:2に希釈します。30秒のインキュベーション後、よく均質化し、ノイバウアー改良グリッドスタイルの計数チャンバーの壁に10 μLを加えます。大きな正方形を3つ数え、その数を100で割って細胞濃度(x106 細胞/mL)を求めます。
      注:細胞の健康状態は、エレクトロポレーションに対する細胞の感受性に影響を与えます。細胞培養を最適な条件で行うように注意する必要があります。インキュベーターの外での時間は制限し、すべての試薬と溶液は事前に準備して温める必要があります。
    2. 各条件について、0.2 x 106 細胞に相当する容量を回収し、遠心分離(336 x g、5分間、20°C)します。
    3. ピペットを使用して上清を吸引し、ペレットを500μLのPBSに再懸濁します。再度遠心分離します(336 x g、5分、20°C)。
    4. ピペットを使用して上清を慎重に吸引し、THP-1細胞ペレットを12μLのRNP溶液で再懸濁します(ステップ2.6)。

3. エレクトロポレーションシステムのセットアップとヌクレオフェクション(図1.3)

  1. ピペットステーションをバイオセーフティキャビネットの下に置き、エレクトロポレーションチューブをサポートに入れ、エレクトロポレーションキットに含まれているバッファーEを3mL追加します。
  2. エレクトロポレーションデバイスのスイッチを入れた後、タッチスクリーンを使用して、 電圧 = 1 500 V、持続時間 = 10 ms、数値 = 3 のエレクトロポレーションパラメータを設定します。
  3. エレクトロポレーションピペットにチップを装着し、RNP/THP-1溶液10μLを吸引します(ステップ2.7.4)。ピペットをエレクトロポレーションチューブに挿入し、エレクトロポレーションデバイス画面の [開始 ]を押します。 「完了」 というメッセージが表示されるのを待ち、ピペットをチューブから取り外します。
  4. 細胞を予熱した24ウェルプレートのウェルに移し、穏やかに均質化します。プレートを加湿インキュベーターに戻し、72時間邪魔されずに休ませます。
    注:RNP/THP-1懸濁液をピペッティングする際には、エレクトロポレーション手順に支障をきたすため、気泡が発生しないように注意してください。目に見える電気アークがないときにエラーメッセージが表示される場合は、エレクトロポレーションピペットをチューブから取り外し、もう一度 [開始 ]を押します。ただし、短い明るい火花の形の電気アークが観察された場合、それは気泡の存在を示している可能性があります。エレクトロポレーション手順は、エラーメッセージがない場合でも失敗する可能性があります。

4. エレクトロポレーション後72時間のTHP-1回復(図1.4)

  1. エレクトロポレーションの72時間後に濃度を評価するための細胞をカウントします(ステップ2.7.1)。
  2. 十分な細胞(すなわち、≥0.6 x 106 細胞/ mL)がある場合は、20%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMIで少なくとも第2因子で希釈し、1mLあたり0.3〜0.5 x 106 細胞の濃度にします。それ以外の場合は、セルをさらに 72 時間回復させます。
  3. KO検証に十分な量になるまで細胞を継代し、増幅します。その間に、シングルセルクローンの単離を開始することができます(ステップ7)。

5. T7EIミスマッチアッセイによる遺伝子編集の検証(図1.5)

注:このアッセイは、T7EIが1 bpを超えるミスマッチを認識することを考えると、編集効率を過小評価する可能性があります。したがって、T7EIアッセイは、適切に修飾されない限り、ホモ接合細胞集団(すなわち、単一細胞クローン)のスクリーニングには役立ちません(ステップ5.7)。

  1. 細胞濃度を評価し(ステップ2.7.1)、1.5mLチューブ内の0.1×106 細胞に相当する容量を回収します。遠心分離(336 x g、5分、20°C)し、上清を吸引し、ペレットを500 μLのPBSに再懸濁します。再度遠心分離し、ピペットを使用して、ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引します。サンプルを急速冷凍し、-20°Cで保存します。
  2. ゲノムDNAを抽出して、PCR増幅のマトリックスとして機能します。
    1. ペレットを50 μLのDNA抽出溶液で再懸濁し、ホモジナイズし、0.2 mL PCRチューブに全容量を移します。ボルテックスし、短時間遠心分離します(3秒間パルスします)。
    2. チューブをサーマルサイクラーに入れ、65°Cで15分間加熱し、続いて98°Cで10分間加熱します。
    3. 抽出したDNAを90μLの超純水で希釈します。ボルテックスと遠心分離を短時間(5,000 x g、3秒)行います。
  3. PCRプライマー( 材料表を参照) を超純水で希釈し、最終濃度を10 μM(すなわち、10 pmol/μL)にします。
  4. 0.2 mL PCRチューブ(最終容量 = 50 μL、1つの条件)でPCRミックス(下記の注を参照)を調製します。通常、少なくとも 2 つの条件があります: KO と Cas9 のみの未編集コントロールです。
    注:精製されたゲノムDNA:10 μL;フォワードプライマーおよびリバースプライマー(10 μM):各2.5 μL、最終濃度500 nM;反応バッファー(5倍):10 μL.添加する前に十分にボルテックスします。混合dNTP(各25 mM):0.6 μL、各dNTPの最終濃度は0.3 mMです。DNAポリメラーゼ:0.5μL;超純水:23.9μL.ボルテックスと短時間遠心分離機(パルス3秒)。
  5. チューブをサーマルサイクラーにセットし、次の設定でPCRプログラムを実行します。
    注:95°Cで5分間のサイクル1サイクル、続いて30サイクル[98°Cで20秒(変性ステップ)、X°Cで15秒(アニーリングステップ)、72°Cで45秒(伸びステップ)]、次に72°Cで2分間の最終サイクル。増幅の最後に、チューブを取り外し、ボルテックスを取り出し、短時間遠心分離します(3秒間パルスします)。アニール温度(X)は、プライマーの融解温度(Tm)から5°Cを引いたものです。
  6. ポリクローナル編集集団の場合:新しい0.2 mLチューブに、17.5 μLのPCRアンプリコンと2 μLのNEBuffer 2(10x)を加えて、最終容量を19.5 μLにします。あるいは、シングルセルクローンをスクリーニングするには、編集されたコントロール細胞と未編集のコントロール細胞の両方からPCR産物を1:1で混合します(ステップ5.6)(補足図1)。
  7. ヘテロデュプレックス形成では、チューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムを実行します:95 °Cで10分間のサイクル、95°Cから85 °Cまでの-2 °C/sのランプ、85°Cから25 °Cまでの-0.3 °C/sのランプ、HOLDで10°Cでの最終冷却サイクル。
  8. ヘテロ二本鎖形成後、0.5μLのT7EI溶液をチューブに加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
  9. 1.2%アガロースゲルを調製します。
    1. ガラス瓶に入ったアガロースを重量で量り、適切な量の1x TAEバッファー(40 mM Tris-acetate、1 mM EDTA、pH 8.3)を加えます。キャップをしっかりとねじ込まないように注意して電子レンジに入れます。アガロースの結晶が完全に溶解するまで数回加熱します。
      注意: 必要に応じて、溶液を混合します。沸騰させないと、体積が減少し、アガロースの濃度が変化します。
    2. 1/20,000に希釈したDNAゲル染色液を加え、よく混ぜ合わせる。
    3. アガロース溶液を型に流し込み、コームを加えて室温で固めます。
  10. 5 μL の T7EI 消化産物 (ステップ 5.9) または未消化 PCR 産物を 5 μL の水および 2 μL の 6x DNA ローディング色素と混合して、ゲル電気泳動用のサンプルを調製します。サンプルとサイズラダーをロードし、80 Vで45分間移動させます(DNAフラグメントの予想されるサイズに応じて時間を調整できます)。移行が終了したら、適切なイメージングシステムでゲルの画像を取得します。

6. サンガーシーケンシング解析による遺伝子編集の検証(図1.6)

  1. 遺伝子改変を特徴付けるには、PCR産物を精製し(ステップ5.4)、サンガーシーケンシング後、ICEツールで結果を分析します(https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis)。
  2. 修飾にもかかわらずタンパク質を産生できるかどうかを制御します。
    1. ICE の結果をダウンロードし、contribs.txt ファイルを開きます。
    2. 編集したシーケンスをWTの対応物と比較します。インデルをマッピングし、それらが標的ゲノム領域で発生したことを確認します。それらのサイズを評価します。インデルの長さが 3 の倍数でない場合、フレームシフトが発生し、PTC が導入される可能性があります。変異したmRNAは、NMDを介した分解を受けることが予想されます。

7. 限界希釈によるシングルセルクローンの単離(図1.7)

注:シングルセルクローンの単離は必須ではありません。ただし、選択する場合は、複数のクローンを特徴付け、それらの表現型を元のポリクローナル集団と比較することが重要です。

  1. 細胞懸濁液のサンプルを採取し、培地で1/2に希釈し、濃度を評価します(ステップ2.7.1)。希釈により、計数精度が向上します。
  2. 2〜3回の連続希釈ステップを実行して、7細胞/mLの濃度に到達します。丸底の96ウェルプレートにウェルあたり100 μLの細胞懸濁液を分注します(つまり、ウェルあたり0.7個の細胞)。細胞を数時間デカントさせてから、顕微鏡でプレートを観察し、1つの細胞を含むウェルを特定します。
  3. コロニーの形成と成長を定期的にモニタリングし、必要に応じて細胞をより大きな培養プレートまたはフラスコに移します。

8. HIV-1制限アッセイによるTHP-1 KO SAMHD1細胞の機能評価

  1. 10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン(完全 RPMI)を添加し、分化のために 300 ng/mL PMA を含有した 300 μL の RPMI に 0.25 x 106 細胞/ウェルの 24 ウェル培養プレートに THP-1 を播種します。プレートを加湿インキュベーター(37°C、5%CO2)に24時間保管します。
  2. 培地をPMAフリーの完全なRPMI培地と交換し、プレートをインキュベーターにさらに24時間戻します。
  3. 真空ポンプを使用して、すべての培地を吸引します。250 μLのVSVgシュードタイプHIV-1-GFPウイルスストック含有溶液(MOI = 0.5 IFU/細胞)を加えます。感染していないコントロールを含めます。プレートを4°Cに2時間置き、感染を同期させます。
  4. 細胞をRPMIで一度洗浄します。各ウェルに500 μLの完全RPMIを添加し、標準条件で48時間インキュベートします(時間は調整可能)。
  5. 培地を取り除いた後、細胞を冷たい1x PBSで一度洗浄します。次に、各ウェルに0.05%トリプシン-EDTAを100μL加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに置き、細胞が完全に剥離するまで(5分で十分です)、200 μLの完全RPMIを添加して酵素を不活性化します。各ウェルから250 μLを96ウェル丸底プレートに移します(フローサイトメーターが培養プレートを受け入れることを確認してください)。
  6. プレートを遠心分離し(757 x g、3分、減速= 6、20°C)、マルチチャンネルピペットを使用して上清を吸引します。ペレットを100 μLの4% PFAで再懸濁し、4°Cで10分間インキュベートします。冷やした1X PBSを100μL加えます。
  7. GFP陽性細胞で表される感染率をフローサイトメトリーで解析します(推奨されるゲーティング戦略については、 補足図2 を参照)。

結果

GFPレポータータンパク質(THP-1_GFP)を安定して発現するTHP-1細胞株を作製し(図2A)、効率的なCRISPR-Cas9媒介遺伝子編集のプロトコールを確立するためのツールとして使用しました。この目的のために、 EGFP 遺伝子を標的とする3つのsgRNAをCRISPORウェブツール29(図2B)で設計し、Cas9と9:1のモル比で同時に複合...

ディスカッション

ここでは、THP−1細胞株のCRISPR媒介編集を成功裏に得るためのプロトコルが記載されている。このアプローチは、エレクトロポレーション/ヌクレオフェクションによる組み立て済みのsgRNA/Cas9 RNPの転写に依存しています。この戦略は、sgRNA/Cas9カセットのレンチビラールを介した組み込み時に発生する可能性のあるオフターゲット効果を制限し、ヌクレアーゼの持続的?...

開示事項

すべての著者に利益相反はありません。

謝辞

プロトコルの共有とディスカッションに協力してくださったJP Concordet氏(MNHN, U1154/UMR7196, Paris)、G. Bossis氏(IGMM, Montpellier)、D. Schlüter氏(Hannover Medical School, Germany)に感謝します。このプロジェクトは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラム(AZへの助成金契約なし101017572)とANRS(AZへの助成金ECTZ162721)から資金提供を受けています。感染症モデルと革新的治療法(IDMIT)の研究インフラストラクチャは、参照ANR_11_INSB_0008の「プログラム投資ダベニール(PIA)」によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm syringe filterClearLine146560_
0.4 % trypan blueBeckman Coulter383200_
1.5 mL tubeEppendorf3810X_
24-well plateCorning353047_
6x TriTrack DNA Loading DyeThermo scientificR1161_
75 cm² Culture Flask Vented CapCorning353136_
8-Strip PCR Tubes with CapsLife technologiesAM12230_
96-well plates Flat bottomCorning353072_
96-well plates Round bottomCorning353077_
AgaroseEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging SystemBIO-RAD12003153_
Counting slideNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Life Sciencesv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo scientificSM0323_
Genome Data ViewerNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrismDotmatics_Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent600679_
ICE CRISPR Analysis ToolSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Version 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluded with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µLInvitrogenMPK1025KElectroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free WaterSynthego__
PCR primer (EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
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PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104_
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RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
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SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102_
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T100 Thermal CyclerBIO-RAD1861096_
T7 endonuclease INew England BiolabsM0302S_
TAE buffer UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cellsATCCTIB-202_
Trypsin-EDTA (0,05 %)Gibco25300054_
ZE5 Cell AnalyzerBIO-RAD12014135_

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